蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定及其進展

關(guān)于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定及其進展第1頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的概述:研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是目前分子生物學(xué)的中心課題之一.1953年英國人F.Sanger首先第一個完成牛胰島素的測定工作.同時此人還是第一個搞清ф×175phageDNA的一級結(jié)構(gòu)的學(xué)者,為此兩次獲得諾貝爾獎.第2頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六1969年,基本與應(yīng)用化學(xué)國際聯(lián)合會規(guī)定以各種氨基酸按一定的順序排列構(gòu)成的蛋白質(zhì)肽鏈骨架為蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu).1.多肽鏈的數(shù)目;2.每一條多肽鏈末端氨基酸的種類;3.每一條多肽鏈氨基酸中氨基酸的數(shù)目、種類和排列順序;4.鏈內(nèi)二硫鍵的位置和數(shù)目

5.鏈間二硫鍵的位置和數(shù)目第3頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)研究需要一級結(jié)構(gòu)的知識;

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)如:牛胰核糖核酸酶的復(fù)性實驗基因工程中包涵體的問題蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與分子進化的關(guān)系;

細胞色素C是廣泛存在于需氧生物線粒體呼吸鏈中的起傳替作用的一種蛋白質(zhì)通過它可以繪出生物進化樹,一般在進化樹位置相距越遠,則氨基酸的順序差別越大.一級結(jié)構(gòu)與遺傳病(分子病);

鐮刀狀細胞貧血癥中的血紅蛋白(HbS),他僅是β-鏈上第六號的Glu變?yōu)閂al，從而導(dǎo)致生物功能上的巨大差異第4頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六多肽激素功能以及作用；酶原激活與激素原的激活；酶原與激素原均是酶和激素的前體，均無生物活性，但經(jīng)過特殊處理如激酶作用，肽段切除，氨基酸的置換等則可使其具有生物活性。蛋白質(zhì)工程研究發(fā)展；利用一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的知識在蛋白質(zhì)工程中廣泛應(yīng)用第5頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重要意義用來研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系;可用于分子克隆中寡核苷酸的制備為cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列提供證據(jù)為重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作指紋分析蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)鑒定確定翻譯后修飾的位點決定簇的定位二硫鍵的確定第6頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的進展1953年的Sanger測定胰島素全部氨基酸序列蛋白質(zhì)測序的基本思路與測定氨基酸序列的化學(xué)法與酶法1967年推出基于Edman機理的液相（旋轉(zhuǎn)杯）自動蛋白質(zhì)測序儀1970華裔科學(xué)家張瑞耀采用DABITC試劑（4-N，N-二甲基氨基偶氮苯-4`-異硫氰酸酯）與PITC偶聯(lián)提高靈敏度1970年代推出固相序列分析儀，彌補液相序列分析儀不適合分析小肽（＜30個殘基的肽）不足1980年代Hewwick推出氣相序列分析儀1980年代通過測定DNA順序推出蛋白質(zhì)序列1980年代質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)序列測定中應(yīng)用第7頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六目前蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)通過經(jīng)典測定方法已經(jīng)搞清近幾百種目前蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定可上千個氨基酸,如牛皮膠元(1052)、RNApolymerase(1407)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫大多來源于DNA推導(dǎo)序列第8頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的戰(zhàn)略從DNA開始推蛋白質(zhì)的氨基酸順序從蛋白質(zhì)開始進行蛋白質(zhì)序列分析質(zhì)譜法測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)第9頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六從DNA推測蛋白質(zhì)的氨基酸順序第10頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六目的蛋白的N、C末端均已知目的蛋白的N末端已知目的蛋白的N、C末端均不知第11頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六從蛋白質(zhì)開始進行氨基酸的序列分析序列分析的關(guān)鍵：

1蛋白樣品的純度；

2氨基酸組成與分子量關(guān)系；

3重疊(序列的重建)也有一些特例：組蛋白和一些同功酶第12頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)序列分析的一般步驟第13頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的關(guān)鍵步驟二硫鍵的拆除與大片肽段的分離;末端分析;多肽的一次性降解;肽段氨基酸的序列測定;二硫鍵位置的確定;第14頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六二硫鍵的拆除與大片肽段的分離

1直接拆除并固定-SH(過甲酸氧化)2拆除后再固定(利用還原劑還原)

3大片段的分離第15頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

1直接拆除并固定-SH(過甲酸氧化)

兩個-SH全部能轉(zhuǎn)變?yōu)榛撬峄?被氧化的Cys稱為磺基Ala)過甲酸是強氧化劑,MetTrp也可能被氧化低溫,過甲酸的濃度,一般不超過10%反應(yīng)不可逆第16頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六2拆除后再固定(利用還原劑還原)1)β-巰基乙醇還原:

還原劑處理前需用變性劑處理蛋白反應(yīng)可逆

β-巰基乙醇濃度必需在第17頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六2)Cleland試劑的還原:Cleland試劑指的是二硫赤蘇糖醇,二硫蘇糖醇。還原能力上是較強的試劑,只要0.01M就使-S-S-還原,在許多球蛋白反應(yīng)中可以不用變性劑.

第18頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六3)-SH的固定烷基試劑使-SH轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的硫醚衍生物氨乙基化乙睛化第19頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六3大片段的分離蛋白質(zhì)多肽鏈拆開后,可以通過凝膠柱分離如果蛋白質(zhì)分子的幾條肽鏈以非共價鍵結(jié)合,則可用尿素鹽酸胍變性劑進行拆分.第20頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)或多肽末端分析

N端分析C端分析第21頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六N端分析:丹磺酰氯法(dansyl-cl);靈敏度高,一般氨基酸都是可以的.但對H、R、W、C不完全成功;D、N、E、Q不能分,生成強熒光磺酰胺衍生物;PITC(苯異硫氰酸酯)法;基本上是成功的,但對S、T收率偏低.首先Edman用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N端;Dabitc;4-二甲基氨基偶氨苯異硫氰酸酯;氨肽酶;亮氨酸氨肽酶;FDNB;2.4-二硝基氟苯(FDNB)生成DNP-氨基酸.首先Sanger用來測定多肽或蛋白質(zhì)的N端氨基酸;氰酸鹽第22頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六三種氨基酸末端分析方法的對比試劑反應(yīng)產(chǎn)物備注名稱結(jié)構(gòu)式氟-2,4-二硝基苯肽的黃色二硝基苯的衍生物從肽鏈上水解新生成的N-末端產(chǎn)物,破壞其它肽鍵丹磺酰氯強熒光磺酰胺衍生物異硫氰酸苯苯硫氰甲酰基衍生物本法避免上述二法缺陷第23頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

封閉N端的測定:如果蛋白質(zhì)或多肽的N端是封閉的,則不能和上述反應(yīng),如蛋白乙酰化(兔肌紅蛋白)、蛋白甲?；?蜂毒素)、焦谷氯酰環(huán)化(兔免疫球蛋白)、丙酰氯環(huán)化以及環(huán)肽(短桿菌酪肽A)1N端甲?；蛞阴；梢杂脺睾退崴饣蛳鄳?yīng)的脫?；?2焦谷氯酰殘基可通過酶解法和化學(xué)降解法來裂解;第24頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六C端分析:

目前N-端氨基酸序列測定應(yīng)用Edman化學(xué)降解法已經(jīng)達到高度自動化,微量化,可以分析蛋白質(zhì)N端20-40或更多的氨基酸殘基,但是不少蛋白質(zhì)尤其是哺乳動物及高等植物中N端被修飾封閉,且封閉方式不盡相同,因此給蛋白質(zhì)N端測定帶來困難.因此人們希望從C端獲得一些信息,C端序列研究對研究多肽加工,DNA重組產(chǎn)物質(zhì)量監(jiān)控都很重要,同時cDNA起始于C端,因此了解C端氨基酸殘基序列更有助于DNA克隆并得到正確的基因結(jié)構(gòu).另外許多報道指出C端和生物活性有重要關(guān)系.第25頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

雖然C端研究很重要，但C端研究仍處于研究和發(fā)展階段,雖有自動分析儀，但多是由N端分析儀改裝而來,其基本結(jié)構(gòu)相同。兩者不同之處在于:1反應(yīng)所用的試劑不同;2C端序列儀中所有化學(xué)反應(yīng)均應(yīng)在彈筒型反應(yīng)室中進行不需再轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化。第26頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六C端分析比較困難，常用的有酶法和化學(xué)法:1化學(xué)法主要是肼解法:

肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。注意:1肼解絕對避免水分子的存在;2對于羧基末端氨基酸側(cè)鏈是帶有酰胺的Q、N,則肼解不能產(chǎn)生游離的羧基末端的氨基酸;3對Cys會發(fā)生分解需先氧化或烷化第27頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

羧肽酶法：現(xiàn)在通常用酶法,但是酶法需先進行酶的動力學(xué)實驗以及選擇合適酶的濃度及反應(yīng)時間使釋放出的氨基酸主要是C端氨基酸.

將蛋白質(zhì)在pH8.0,30℃與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羧肽酶B水解精氨酸和賴氨酸。第28頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六多肽的專一性降解（specificcleavageoftheprotein）

大于20的多肽一般需要預(yù)先進行降解，盡管目前的測序可以一次測定60-70氨基酸殘基，但由于氨基酸組成、純度、產(chǎn)率等因素的影響這種幾率比較少。多肽的降解不外于化學(xué)法和酶法倆種?；瘜W(xué)法（大片段）

A:Cyanogenbromide(CNBr)它選擇性的切斷Met殘基的羧基側(cè)肽鏈，將Met轉(zhuǎn)化為高絲氨酸（Homoser)和高絲氨酸內(nèi)酯(Homoserinelactone)。在氨基酸組成分析時高絲氨酸和高絲氨酸內(nèi)酯相距甚遠。高絲氨酸在絲氨酸之后，而高絲氨酸內(nèi)酯在組氨酸之后。計算時可將高絲氨酸和高絲氨酸內(nèi)酯相加，計算甲硫氨酸的量。第29頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六CNBr切割優(yōu)點：一般蛋白質(zhì)中甲硫氨酸含量較少，可得大的片段；專一性強，只作用于甲硫氨酸；產(chǎn)率在80%以上；作用條件溫和操作方便。注意：CNBr要新鮮，易氧化產(chǎn)生副產(chǎn)物。一般變黃后就不能用；CNBr有毒；注意在氨基酸分析同片段大小不符合時一定要注意，是否有Met漏掉；CNBr/Met=500：1可克服干擾提高產(chǎn)率；如蛋白質(zhì)中含Asp-Pro鏈，會出現(xiàn)所得肽段數(shù)目比根據(jù)Met量預(yù)計的數(shù)目多的現(xiàn)象；第30頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六其他裂解肽的方法：A：部分酶分解法：0.1NHCl在110度或6NHCl在37度水解，但特異性不強，因此對大片段和肽均不適用；B：羥胺法：反應(yīng)機理是通過羥胺作用，先形成一個琥珀酰亞胺環(huán)狀物然后導(dǎo)致肽鍵的裂解。羥胺專一性的裂解Asn-Gly的肽鏈，產(chǎn)率可達70%以上。但酸性條件下切割A(yù)sn-Pro；C：稀酸切割A(yù)sp-Pro肽鍵：蛋白質(zhì)中Asp-Pro鍵對酸不穩(wěn)定；D：CleavageatTrpresidesbyo-iodosobenzoineacid(亞碘?；郊姿幔┊a(chǎn)率：70%-100%

第31頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六酶法（小片段）：酶水解法較化學(xué)法具有較多的優(yōu)越性，使用也較廣泛，因其具有較高的專一性，而且水解產(chǎn)率較高，利用不同的酶可以獲得不同的肽的片段，加以比較就可獲得整個肽的順序。胰蛋白酶（Trypsin）最專一，一般肽鏈切割首選胰蛋白酶，但對Lys-Pro或Arg-Pro不切或較慢。胰蛋白酶是從胰臟中提取的蛋白水解酶，常含有胰凝乳蛋白酶，因此在測序時用 TPCK-Trypsin（即含有凝乳蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶）

TPCK=對甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲酮如果酶解片段過大，用Sephadex.G-50,對于小的片段可直接上HPLC第32頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六1：ModificationofLys

如果Lys或Arg在蛋白質(zhì)中過多，不能獲得大片段可用順丁烯二酸酐修飾Lys.一旦形成不被胰蛋白酶水解，在酸性條件下可去封閉，再被胰蛋白酶水解。2：ModificationofArg

丙烷-2.3-二酮或環(huán)己烷-1.2-二酮修飾，若有二硫鍵存在則環(huán)己烷-1.2-二酮則不起作用。3：ModificationofCys

通過修飾生成Lys的類似物，可被胰蛋白酶水解，從而在Cys處斷裂。對于酶切后多肽片段過多過小或過大的情況處理第33頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六小肽段（20左右氨基酸）的序列測定：

肽的氨基酸測定主要是使用Edman化學(xué)降解法，此外還有酶解法、酶解-肽譜重疊法以及氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

偶聯(lián)(FITC偶聯(lián)在多肽的N末端）裂解（三氟乙酸）轉(zhuǎn)化（強酸）pTH氨基酸的鑒定（ATZ-噻唑啉酮胺）第34頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六目前在Edman法基礎(chǔ)上產(chǎn)生一些新的方法：1。DNS-Edman序列分析法：利用DNS-Cl測定N末端殘基，用Edman法去降解多肽，然后純化少一個氨基酸殘基的多肽，再用DNS-Cl測其N-末端殘基；2。減數(shù)Edman法：利用Edman法降解肽鏈的N末端氨基酸殘基，逐次從肽鏈中除去一個N-末端殘基，并隨后分析相應(yīng)剩余肽鏈氨基酸組成，從而從每個循環(huán)中得知N端氨基酸的排列順序；3。DABITC/PITC雙偶合法；外肽二肽酶測定肽序列：（每隔2個殘基切一次）第一次，酶水解得一個二肽，純化，測定結(jié)構(gòu)；第二次先從N-末端切去一個殘基再用外肽酶水解得一個二肽，純化，測定結(jié)構(gòu)，然后兩者比較就可得被測肽的序列。

第35頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六多肽片段的重疊重疊第36頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六二硫鍵位置的確定：一般用二種方法：1用酶直接水解變性的蛋白：由于二硫鍵只在偏酸性條件下才穩(wěn)定（在堿性條件下易發(fā)生交換），因此常用胃蛋白酶水解，且此酶專一性低，位點多，