蛋白質(zhì)測(cè)序分離及提純

關(guān)于蛋白質(zhì)測(cè)序分離及提純第1頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)紫外吸收：最大吸收峰為280nm兩性解離：蛋白質(zhì)的pI值不能直接計(jì)算，只能使用等電聚焦等方法進(jìn)行測(cè)定膠體性質(zhì)沉淀反應(yīng)：鹽析、pI沉淀、有機(jī)溶劑引起的沉淀和重金屬鹽作用造成的沉淀變性、復(fù)性水解顏色反應(yīng)第2頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.6.1蛋白質(zhì)的性質(zhì)第3頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六第4頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.6.2蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀第5頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六

蛋白質(zhì)溶液有膠體溶液的性質(zhì)，如：擴(kuò)散慢、易沉降、粘度大、不能透過(guò)半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體。

蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當(dāng)破壞這兩個(gè)因素時(shí)，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。

蛋白質(zhì)是相對(duì)分子質(zhì)量很大的生物分子,相對(duì)分子質(zhì)量一般在10000～1000000之間或更大一些.+++++++++++++++++++++++++++第6頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六第7頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.6.3

變性

、復(fù)性

（1）變性：在某些理化因素作用下，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變、生物活性喪失的現(xiàn)象稱(chēng)為變性。變性不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。使蛋白質(zhì)變性的因素（1）物理因素：高溫、高壓、超聲波、紫外線(xiàn)射線(xiàn)等

（2）化學(xué)因素：有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等第8頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六變性的本質(zhì)：分子中各種次級(jí)鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無(wú)序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：（1）生物學(xué)活性消失

（2）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，側(cè)鏈反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)酶的作用敏感，易被水解。

第9頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（2）復(fù)性：去除變性因素回復(fù)原來(lái)結(jié)構(gòu)與功能。變性并非是不可逆的變化，當(dāng)變性程度較輕時(shí)，如去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來(lái)的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱(chēng)為復(fù)性。（3）應(yīng)用①利用變性：酒精消毒高壓滅菌②防止變性：低溫保存生物制品③取代變性：乳品解毒(用于急救重金屬中毒)第10頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.6.4

蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)沉淀（1）沉淀：不穩(wěn)定蛋白質(zhì)從溶液中析出（2）結(jié)絮：變性蛋白質(zhì)的絮狀沉淀，沉淀可溶于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿（3）凝固：沉淀結(jié)塊，凝塊不溶于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿蛋白質(zhì)在溶液中維持穩(wěn)定的因素：表面電荷、水化層（溶劑化層）變性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定變性第11頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六蛋白質(zhì)的沉淀

Pr從膠體溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒(méi)有變化適當(dāng)條件下可重新溶解

——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等

第12頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六不可逆沉淀強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ第13頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六①.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性第14頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六②.有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用③.等電點(diǎn)沉淀第15頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六④.重金屬鹽沉淀與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽⑤.生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽⑥.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)第16頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.6.5

蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)酚試劑反應(yīng)→蛋白質(zhì)定量、定性

茚三酮反應(yīng)測(cè)定常用方法

第17頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六雙縮脲反應(yīng)(堿性溶液)Cu2+紅紫色絡(luò)合物

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物第18頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六

Folin(福林試劑）-酚試劑反應(yīng)

蛋白質(zhì)分子中含有一定量的酪氨酸殘基，其中的酚基在堿性條件下與福林試劑的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物。第19頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩層之間就會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應(yīng)。第20頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六坂口反應(yīng)精氨酸分子中含有脈基，能與次氯酸鈉（或次溴酸鈉）及ɑ-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。此反應(yīng)可以用來(lái)鑒定含有精氨酸的蛋白質(zhì)。第21頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六米倫反應(yīng)米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液，蛋白質(zhì)溶液加入米倫試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。酚類(lèi)公化合物有此反應(yīng)。第22頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六紫外吸收蛋白質(zhì)分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，這些氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)具有紫外光吸收能力，最大吸收峰在在280nm處，故通過(guò)對(duì)280nm波長(zhǎng)的紫外吸光度的測(cè)量可對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量分析。第23頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.7蛋白質(zhì)分離提純及分析技術(shù)第24頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.7.1蛋白質(zhì)分子量及其確定方法蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在6000～1000000之間。測(cè)定分子量的主要方法有化學(xué)組成法、滲透壓法、超離心法（沉降分析法）、凝膠過(guò)濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。第25頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六化學(xué)組成法:最低M=元素(分子)分子量/元素(分子)百分含量滲透壓法:Mr=cRT/Π超離心法:Mr=RTs/[(1-υρ)D]凝膠過(guò)濾:logMr

=K1-K2VeSDS－PAGE法:logMr=α-bμR氨基酸序列分析計(jì)算第26頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六元素原子量(分子分子量)最低相對(duì)分子量=

元素(分子)百分含量肌紅蛋白含鐵量為0.335%，其最低分子量可按下式算出：

Fe原子量(55.8)最低相對(duì)分子量=Fe元素百分含量(0.335%)=16700化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子量第27頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六真實(shí)分子量是最低相對(duì)分子質(zhì)量的n倍，這里n是每個(gè)蛋白質(zhì)分子中鐵原子的數(shù)目。因?yàn)榧〖t蛋白中，n＝l，所以其真實(shí)Mr就是16700。又如血紅蛋白含鐵也是0.335%，即最低Mr亦為16700，但根據(jù)其他方法測(cè)得的Mr是68000?？梢?jiàn)每一分子血紅蛋白含有四個(gè)鐵原子，即n＝4，因此其真實(shí)Mr＝16700×4=66800。第28頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六有時(shí)蛋白質(zhì)分子中某一氨基酸的含量特別少，應(yīng)用同樣的原理，由這一氨基酸含量的分析結(jié)果，也可以計(jì)算蛋白質(zhì)的最低相對(duì)分子質(zhì)量。例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，計(jì)算所得的最低相對(duì)分子質(zhì)量是35200。用其他方法測(cè)得的Mr是69000，所以每分子牛血清清蛋白含有兩個(gè)色氨酸殘基。第29頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.7.2蛋白質(zhì)純化總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶第30頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（一）利用溶解度差別的分離方法1.等電點(diǎn)沉淀和pH控制

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)pH值，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒(méi)有斥力而趨向于凝聚而沉淀。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的理可以把蛋白質(zhì)混合物分離開(kāi)來(lái)。蛋白質(zhì)混合物的分離純化方法第31頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析

中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)有明顯的溶解度影響。在低濃度時(shí)，中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱(chēng)鹽溶。鹽溶主要由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類(lèi)離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用卻加強(qiáng)。鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中大量加入中性鹽使水的活度降低，原來(lái)溶液中大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。第32頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六3.有機(jī)溶劑分級(jí)法有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。第33頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（二）根據(jù)分子大小不同的分離方法1.過(guò)濾與膜分離

借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱(chēng)為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離過(guò)程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆粒或分子通過(guò)，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。第34頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.離心分離離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。常速離心機(jī)又稱(chēng)為低速離心機(jī),其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以?xún)?nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過(guò)程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。第35頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過(guò)程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。第36頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六3.凝膠過(guò)濾層析（gel-filtrationchromatography）凝膠層析又稱(chēng)為凝膠過(guò)濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過(guò)凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。第37頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（三）根據(jù)電荷不同進(jìn)行分離1.電泳帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程稱(chēng)為電泳。顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。第38頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六

1）區(qū)帶電泳是由于在支持物上電泳時(shí)各組分因遷移速度不同分布成區(qū)帶而的名。區(qū)帶電泳按其支持介質(zhì)的物理性質(zhì)不同可以分為四類(lèi)：（1）紙電泳和聚酰胺薄膜電泳；（2）粉末電泳，支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和而成，鋪設(shè)成平板；（3）細(xì)絲電泳，如尼龍絲和其他人造絲；（4）凝膠電泳，最常用的支持介質(zhì)是聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。第39頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide，Bis)在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(AP)的作用下聚合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。凝膠的濃度和孔徑可調(diào)節(jié)。第40頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.離子交換層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽(yáng)離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。第41頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（四）蛋白質(zhì)的選擇吸附某些物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)有選擇吸附，利用對(duì)不同的蛋白質(zhì)的吸附能力不同而得到分離。常用的吸附劑有結(jié)晶磷酸鈣。第42頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（五）親和層析

親和層析（affinitychromatography)是一種有效分離蛋白質(zhì)的層析方法，它經(jīng)常只需要一步即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，并且純度很高。親和層析是基于某種蛋白質(zhì)的生物特異性，即它與另外一種稱(chēng)配基的分子能特異而非共價(jià)結(jié)合。第43頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2.7.3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。第44頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（一）蛋白質(zhì)順序測(cè)定基本戰(zhàn)略將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序?qū)㈦亩畏蛛x并測(cè)出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y(cè)定二硫鍵拆開(kāi)純蛋白質(zhì)第45頁(yè)，共53頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六(2)

斷開(kāi)二硫鍵在8mol/L尿素或6