蛋白免疫印跡法原理及步驟

關于蛋白免疫印跡法原理及步驟第1頁，共9頁，2022年，5月20日，4點39分，星期六WesternBlot的原理WesternBlot

：首先利用SDS對蛋白質樣品進行分離，然后轉移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結合位點，而后用所要研究的蛋白質的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，而其它的蛋白質不能與一抗結合，這樣清洗除去未結合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。印跡用酶連二抗處理后，再用適當?shù)牡孜锶芤禾幚?，當酶催化底物生成有顏色的產物時，就會產生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質位置。該技術主要應用于檢測蛋白水平的表達。第2頁，共9頁，2022年，5月20日，4點39分，星期六SDS原理

SDS

：是在蛋白質樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。強還原劑巰基乙醇等可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物蛋白質分子結合SDS陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所帶凈電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質量，而與其所帶電荷的性質無關。第3頁，共9頁，2022年，5月20日，4點39分，星期六Westernblot內容蛋白樣品的制備SDS轉膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色第4頁，共9頁，2022年，5月20日，4點39分，星期六步驟蛋白樣品的制備1，在冰上收細胞，用PBS清洗兩次，洗去培養(yǎng)基。1500r,5min離心，棄去上清液。2，裂解細胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根據(jù)所需蛋白濃度加細胞裂解液?；靹?。于冰上裂解20min。3，14000r,10min離心。上清液即為所需蛋白樣品液。4，用Bradford蛋白分析法測蛋白濃度。5，按100ul裂解液加30ul的6X的loadingbuffer的比例，向蛋白樣品液中添加loadingbuffer。6，于95℃

，5min條件下對蛋白樣品進行高溫變性。第5頁，共9頁，2022年，5月20日，4點39分，星期六SDS:1，灌膠：

（1）保證玻璃板干燥潔凈，玻璃板對齊后放入夾中卡緊，垂直卡在架子上準備灌膠。（2）配好分離膠，加入TEMED，混勻后即可灌膠。灌膠過程中膠要沿著玻璃板流下，防止有氣泡產生。將膠灌至接近綠帶中線即可。（3）用去離子水進行液封，膠凝速度會更快（加水時速度要慢，防止膠被沖變形）（4）待水與膠之間有一條折射線的時，說明膠已經(jīng)凝固。此時，可完全除去膠上層的水。（5）配制濃縮膠，加入TEMED,混勻后將剩余空間灌滿濃縮膠。然后插入梳子。待濃縮膠凝固后小心拔出梳子。（6）用水沖洗一下膠板，裝入電泳槽中（小玻板面向內，大玻板向外；若只跑一塊板，槽的另一邊要放一塊塑料板，有字的一面向外）第6頁，共9頁，2022年，5月20日，4點39分，星期六2，電泳向電解槽中加入適量的RunningBuffer,將蛋白樣品以50ug的標準換算出的體積進行上樣。以電壓120V或160V進行電泳，電泳至前沿跑至最底端即可進行轉膜。

轉膜

用硝酸纖維素膜（NC膜），進行轉膜。組裝轉膜“三明治”的過程在Transferbuffer中進行：黑的一面在下，依次放上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，然后合上三明治。整個過程必須保證無氣泡。接著把轉膜“三明治”放入轉膜槽中，注意正負極放置正確。倒入適量的Transferbuffer。在冰浴中進行轉膜。轉膜條件：120V,1.5h或者150V，1h

封閉轉膜結束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸潤于封閉液中，緩慢搖蕩1h第7頁，共9頁，2022年，5月20日，4點39分，星期六一抗雜交

封閉過后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入適量的一抗溶液（一抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育4h。二抗雜交

一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS進行洗膜，一共洗三次，每次7~10min。然后，再將NC膜放入塑料袋中，加入酶標二抗（一抗的抗體，含辣根過氧化物酶HRP）（二抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育45min~1h。最后再次洗膜（同上）底物顯色取上述處理過的NC膜