生物技術(shù)原理74

第五章生物技術(shù)原理21世紀(jì)是生命科學(xué)與生物技術(shù)的世紀(jì)，生物技術(shù)被世界各國視為一項高新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、化工能源等各行各業(yè)，正在對人類社會生活產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。傳統(tǒng)生物技術(shù):醬、醋、酒、面包、奶酪、酸奶現(xiàn)代生物技術(shù):20世紀(jì)70年代末80年代初,基因工程{生物技術(shù)生物技術(shù)也稱為生物工程，是指以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其它基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的工程技術(shù)手段，改造或重新設(shè)計細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體，獲得優(yōu)良品質(zhì)的動物、植物和微生物品系，或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品，達(dá)到提高社會生產(chǎn)力和生活質(zhì)量的目的。基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程生物技術(shù)第一節(jié)基因工程操作原理第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理第三節(jié)酶工程第四節(jié)發(fā)酵工程第五節(jié)蛋白質(zhì)工程第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記

生物技術(shù)的發(fā)展日新月異，新成果層出不窮，了解生物技術(shù)原理有利于理解和利用生物技術(shù)為社會服務(wù)。旨在通過本章的學(xué)習(xí)，達(dá)到了解生物技術(shù)基本原理的目的。第一節(jié)基因工程操作原理（P133）一、什么是基因工程二、基因工程操作技術(shù)及原理一、什么是基因工程

概念：也叫基因操作遺傳工程重組DNA技術(shù)基因工程主要原理基因工程四個步驟用人工方法，把生物的遺傳物質(zhì)分離出來，在體外進(jìn)行基因切割、連接、重組、轉(zhuǎn)移和表達(dá)的技術(shù)?？寺∧康幕颍〉盟枰腄NA特異片段。與DNA載體連接成重組DNA。引入細(xì)菌或動植物細(xì)胞并使其增殖。挑選出受體細(xì)胞，指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)或優(yōu)良新品種。第一節(jié)基因工程操作原理

（一）核酸分子的提取技術(shù)（二）電泳技術(shù)（三）各種酶的使用（四）基因克?。ㄎ澹w外重組（六）載體構(gòu)建（七）轉(zhuǎn)化（八）重組體的篩選與鑒定（九）培育新型品種二、基因工程操作技術(shù)及原理第一節(jié)基因工程操作原理

分類：方法：（一）核酸分子的提取技術(shù)RNA的提取總DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取首先，粉碎組織細(xì)胞；其次，DNA用乙醇等進(jìn)行沉淀；最后，用苯酚、氯仿等洗滌純化。第一節(jié)基因工程操作原理

（二）電泳技術(shù)帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。各種生物大分子在一定pH值條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。分類：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、脈沖電場凝膠電泳。概念：第一節(jié)基因工程操作原理

總RNA總DNA質(zhì)粒DNA第一節(jié)基因工程操作原理

第一節(jié)基因工程操作原理

（三）各種酶的使用1、限制性內(nèi)切酶的使用分類：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。

概念：是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的條件下使每一條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3′-OH基團和5′-P基團的DNA片段的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶。

用質(zhì)粒構(gòu)建第一節(jié)基因工程操作原理

重組DNA分子用噬菌體DNA構(gòu)建第一節(jié)基因工程操作原理

重組DNA分子限制性內(nèi)切酶造成粘性末端有利于重組DNA分子的構(gòu)建第一節(jié)基因工程操作原理

2、DNA連接酶的使用DNA連接酶能夠催化具有3′-OH基團和5′-P基團的DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。在基因克隆中用來連接載體與目的基因。第一節(jié)基因工程操作原理

DNA聚合酶可以使單核苷酸通過磷酸二酯鍵加在寡核苷酸的3′-OH端，在基因克隆中用來補平缺口。尤其是具有耐熱性質(zhì)的DNA聚合酶的分離極大促進(jìn)了基因等DNA片段的體外合成與擴增技術(shù)的發(fā)展。3、DNA聚合酶的使用第一節(jié)基因工程操作原理

4、逆轉(zhuǎn)錄酶的使用逆轉(zhuǎn)錄酶可以RNA為模板合成DNA，即cDNA（互補DNA）。在基因克隆中常用來構(gòu)建cDNA文庫。

第一節(jié)基因工程操作原理

（四）基因克隆第一節(jié)基因工程操作原理

5′3′3′5′5′3′3′5′+變性(94℃)復(fù)性(55℃)5′3′P13′5′+P2+P1P2合成（72℃）PCR一般用PCR擴增方法，根據(jù)已知基因的序列設(shè)計引物來克隆基因。1、克隆已知基因序列的基因

第一節(jié)基因工程操作原理

第一節(jié)基因工程操作原理

在某種植物的同源基因被克隆的條件下，可先構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后以該基因（或部分序列）為探針來篩選目的基因的克隆。作圖克隆技術(shù)是隨著分子標(biāo)記圖譜的建立而發(fā)展起來的基因克隆技術(shù)。根據(jù)連鎖圖譜定位的基因來克隆目的基因?？寺≈参锓肿舆B鎖圖譜定位的基因，可采用作圖克隆的策略。作圖克隆是從連鎖標(biāo)記出發(fā)，通過大片段克?。˙AC或YAC庫）的染色體步移到達(dá)靶基因。

第一節(jié)基因工程操作原理

3、作圖克隆根據(jù)基因的產(chǎn)物蛋白質(zhì)克隆基因。首先根據(jù)已知的生化缺陷或特征確認(rèn)與該功能有關(guān)的蛋白質(zhì)，再分離純化這一蛋白并制備相應(yīng)抗體；或測定其氨基酸序列，推測可能的mRNA序列，根據(jù)mRNA序列設(shè)計相應(yīng)的核苷酸探針或寡核苷酸引物。利用抗體或核苷酸探針篩選文庫，也可進(jìn)行PCR擴增。2、功能克隆第一節(jié)基因工程操作原理

（1）消減雜交法（2）DNA標(biāo)簽法（3）差別顯示技術(shù)包括：mRNA差別顯示法等。（4）缺陷互補和反義mRNA技術(shù)（5）cDNA微陣列和基因芯片技術(shù)4、表型差異克隆

利用表型差異或組織器官特異表達(dá)產(chǎn)生的差異來克隆基因。

利用酵母或細(xì)菌制備人工染色體基因組文庫，從中克隆基因，如酵母雙雜交體系可以分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。5、染色體大片段基因克隆第一節(jié)基因工程操作原理

第一節(jié)基因工程操作原理

是將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。（五）體外重組

理想的運載體是質(zhì)粒，當(dāng)給它安裝一段外來DNA片段后，它依然如故地進(jìn)行自我復(fù)制。（六）載體構(gòu)建第一節(jié)基因工程操作原理

（1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：將外植體放入農(nóng)桿菌菌液中浸泡，然后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基誘導(dǎo)抗性愈傷組織和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至營養(yǎng)缽培養(yǎng)。（七）轉(zhuǎn)化1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第一節(jié)基因工程操作原理

又稱微彈轟擊法。其基本原理是將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下，微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上，得到表達(dá)，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化，（2）基因槍法第一節(jié)基因工程操作原理

利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。（3）花粉管通道法第一節(jié)基因工程操作原理

80年代初期周光宇轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不依賴組織培養(yǎng)

首先制備植物原生質(zhì)體，游離出細(xì)胞，在倒置顯微鏡和顯微操作器的幫助下，將目的基因DNA通過微管注射到受體細(xì)胞中。（4）微注射法第一節(jié)基因工程操作原理

在短時間的高壓直流電脈沖的沖擊下，可以使原生質(zhì)膜的分子疏松，形成暫時性的直徑為3～4nm的小孔，但對原生質(zhì)體生活力影響不大。這時，存在于原生質(zhì)體周圍溶液中的外源DNA，就可以通過這種小孔進(jìn)入原生質(zhì)體，實現(xiàn)基因的直接轉(zhuǎn)移。（5）電穿孔法第一節(jié)基因工程操作原理

原生質(zhì)體在短時間的微束激光照射下，可在質(zhì)膜表面形成面積約0.25μm2左右的小孔，使DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。（6）微束激光打孔法

世界上主要有4類已報道的方法：1）融合法，包括精子融介法，微細(xì)胞介導(dǎo)融合等。2）化學(xué)法，包括DNA-磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色體介導(dǎo)法。3）物理法，包括顯微注射法、電脈沖法、細(xì)胞凍存法等。4）病毒感染法，包括重組DNA病毒感染、重組RNA病毒感染等。真正成熟方法顯微注射DNA法精子介導(dǎo)法核移植法2、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)

第一節(jié)基因工程操作原理

核顯微注射法是轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最常用的方法。它是在顯微鏡下將外源基因注射到受精卵細(xì)胞的原核內(nèi)，注射的外源基因與胚胎基因組融合，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)，最后移植到受體母畜子宮內(nèi)發(fā)育，這樣分娩的動物體內(nèi)的每一個細(xì)胞都含有新的DNA片段。（1）核顯微注射法第一節(jié)基因工程操作原理

缺點：效率低表達(dá)結(jié)果的不確定性動物利用率低等在反芻動物：繁殖周期長，較強的時間限制、需要大量的受體動物。精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是把精子作適當(dāng)處理后，使其具有攜帶外源基因的能力。然后，用攜帶有外源基因的精子給母畜授精。優(yōu)點：成本很低，只有顯微注射法成本的1／10。由于它不涉及對動物進(jìn)行手術(shù)處理，因此，可以用生產(chǎn)牛群或羊群進(jìn)行試驗。（2）精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移第一節(jié)基因工程操作原理

先把外源基因與供體細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使外源基因整合到供體細(xì)胞上，然后將供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體細(xì)胞—去核卵母細(xì)胞，構(gòu)成重建胚，再把其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉(zhuǎn)基因的克隆動物。（3）核移植轉(zhuǎn)基因法第一節(jié)基因工程操作原理

遺傳檢測法物理檢測法菌落或噬菌斑雜交篩選法免疫化學(xué)檢測法DNA－蛋白質(zhì)篩選法轉(zhuǎn)譯篩選法等（八）重組體的篩選與鑒定技術(shù)方法:第一節(jié)基因工程操作原理

★草甘磷是一種廣譜除草劑，將含有抗草甘磷的EP2SP合成酶突變基因引入植物，就可使植物獲得抗除草劑特性，使大田作物便于除草，農(nóng)業(yè)操作簡便。（九）培育新型品種第一節(jié)基因工程操作原理

★在食品工業(yè)方面可提高微生物菌種性能，通過基因工程改造的面包酵母中麥芽糖透性酶和麥芽糖酶的含量比普通面包酵母高，產(chǎn)生二氧化碳?xì)怏w的量也較高，可制作出更松軟可口的面包。第一節(jié)基因工程操作原理

★凝乳酶傳統(tǒng)方法是從小牛胃中提取，成本高，產(chǎn)量低，20世紀(jì)80年代以來，將凝乳酶原基因?qū)氪竽c桿菌，成功地進(jìn)行了大規(guī)模的生產(chǎn)。第一節(jié)基因工程操作原理

★美國基因重組的抗霜菌，灑在植物上可抗霜凍。

目前，基因工程作物主要有玉米、大豆、水稻、棉花、馬鈴薯、番茄、煙草等。第一節(jié)基因工程操作原理

第一節(jié)基因工程操作原理

“多莉”轟動了世界；“克隆人”讓人匪夷所思；將人類的干細(xì)胞加到動物的早期發(fā)育胚胎中，導(dǎo)致豬體內(nèi)流人血，老鼠長著人類腦細(xì)胞，小鼠背上長人耳……。

第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理（P139）一、什么是細(xì)胞工程二、細(xì)胞工程技術(shù)與原理細(xì)胞工程：按照人們的需要和科學(xué)設(shè)計改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，并通過無菌操作，細(xì)胞融合，核質(zhì)移植，染色體移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)，重組細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。一、什么是細(xì)胞工程第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理（一）細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合，又稱細(xì)胞雜交：是指在離體條件下用人工方法使兩個或兩個以上的細(xì)胞相互接觸后，導(dǎo)致細(xì)胞合并形成一個新細(xì)胞的過程。二、細(xì)胞工程技術(shù)與原理第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理自然融合人工誘導(dǎo)融合通常所說的細(xì)胞融合指人工誘導(dǎo)融合。1、制備原生質(zhì)體2、誘導(dǎo)細(xì)胞融合

3、篩選雜合細(xì)胞

細(xì)胞融合技術(shù)主要步驟:第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理克隆技術(shù)：從同一個親代細(xì)胞形成的一組細(xì)胞，形成大量子細(xì)胞的無性繁殖過程，這些子細(xì)胞和親代細(xì)胞完全相同，"多莉"的誕生意味著人類可以利用動物的一個組織細(xì)胞“復(fù)印”出大量相同的生命體，這個過程稱為克隆技術(shù)。（二）克隆技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理生物克隆原理第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理

染色體工程是按照預(yù)先的設(shè)計，添加、消除或替代同種或異種染色體的全部或一部分，從而達(dá)到定向改變生物遺傳性狀或選育新品種的目的。

例如，向小麥中添加黑麥染色體形成小黑麥附加系、代換系等，為染色體的研究和育種提供新材料。（三）染色體工程第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理

將動物的一個早期胚胎如8細(xì)胞胚取出并在動物體外進(jìn)行分割后，把分割胚胎都移植到母體內(nèi)，結(jié)果得到由多個胚胎細(xì)胞克隆而成的生物。（五）胚胎分割和移植技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理

細(xì)胞質(zhì)工程又稱細(xì)胞拆合工程，是通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分開，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核質(zhì)的重新組合，細(xì)胞質(zhì)的置換重建成新細(xì)胞。（四）細(xì)胞質(zhì)工程

細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)就是將一個細(xì)胞的細(xì)胞核取出，移入另外一個除去了細(xì)胞核的細(xì)胞中，組成一個完整的細(xì)胞。該技術(shù)是體細(xì)胞克隆技術(shù)的基礎(chǔ)。（六）細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理（七）干細(xì)胞工程第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理

干細(xì)胞工程是利用干細(xì)胞的增殖特性，多分化潛能及其增殖分化的高度有序性，通過體外培養(yǎng)干細(xì)胞、誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化或利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)處理干細(xì)胞以改變其特性的方法。（八）大規(guī)模細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理第二節(jié)細(xì)胞工程操作原理生物體——機器——酶——復(fù)雜高效化學(xué)反應(yīng)。胃分泌的胃蛋白酶胰臟分泌的淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶第三節(jié)酶工程（P142）

一、酶工程的概念和內(nèi)容二、酶分析技術(shù)三、酶的生產(chǎn)四、酶的提取和分離純化五、酶的固定化方法六、酶的應(yīng)用

酶是一種在生物體內(nèi)具有新陳代謝催化劑作用的蛋白質(zhì)。具有反應(yīng)效率高、條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物污染小、能耗低和反應(yīng)易控制等特點。酶工程又稱酶工藝學(xué)，就是利用酶的催化作用，利用酶或者微生物細(xì)胞，動植物細(xì)胞，細(xì)胞器等，通過工程學(xué)的手段，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品。一、酶工程的概念和內(nèi)容第三節(jié)酶工程

酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和臨床診斷等方面。

對傳統(tǒng)化學(xué)工業(yè)的改造和“三廢”處理等具有很大潛力。第三節(jié)酶工程酶的工作效率很高，

α-淀粉酶在60℃15分鐘可使兩噸淀粉轉(zhuǎn)化為糊精，若用酸水解須在14O～15O℃高溫耐酸設(shè)備中至少進(jìn)行2小時。目前，人們把酶工程分為生物酶工程和化學(xué)酶工程。第三節(jié)酶工程

主要任務(wù)是：(1)采用基因重組技術(shù)，利用微生物、動植物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)酶。目前已成功地生產(chǎn)了lOO多種酶。(2)通過基因工程技術(shù)，使酶基因發(fā)生定位突變，產(chǎn)生遺傳性修飾酶(突變酶)。(3)設(shè)計新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。雖然生物酶工程技術(shù)的發(fā)展尚處在幼年時代，但它將開創(chuàng)從分子水平根據(jù)遺傳設(shè)計藍(lán)圖，創(chuàng)造出超自然生物機器的新時代。1、生物酶工程第三節(jié)酶工程2、化學(xué)酶工程(1)自然酶，是指由生物材料中分離出來的酶。(2)化學(xué)修飾酶又稱“生物分子工程”，是通過對酶分子實行“手術(shù)”以達(dá)到改構(gòu)和改性的目的。(3)固定化酶，是將酶分子通過吸附、交聯(lián)、包埋及共價鍵結(jié)合束縛于某種特定支持物上而發(fā)揮酶的作用。具有能反復(fù)使用、產(chǎn)物易純化、可用微電腦控制，實行自動化連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)點。(4)人工合成酶，模擬酶的催化功能，用化學(xué)方法合成具有專一性的催化劑。第三節(jié)酶工程

包括酶試劑盒、酶聯(lián)免疫、酶標(biāo)基因探針、酶傳感器等等，已經(jīng)在臨床診斷、生物工藝過程分析與監(jiān)控、環(huán)境監(jiān)測、檢疫、生命科學(xué)研究等方面逐漸取代傳統(tǒng)的化學(xué)分析法。二、酶分析技術(shù)第三節(jié)酶工程酶在分析生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用也很廣。提取法、發(fā)酵法和化學(xué)合成法1、提取法：直接從動植物或微生物的細(xì)胞或組織中將酶提取出來。2、發(fā)酵法：通過微生物發(fā)酵來獲得人們所需要的酶。3、化學(xué)合成法：采用化學(xué)合成的方法獲得酶。但是，成本比較高，并且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。三、酶的生產(chǎn)

第三節(jié)酶工程1、細(xì)胞破碎處理

機械破碎法：利用搗碎機、研磨器或勻漿器等將細(xì)胞破碎。物理破碎法：利用溫度差、壓力差或超聲波等將細(xì)胞破碎。化學(xué)破碎法：利用甲醛、丙酮等有機溶劑或表面活性劑作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞或透性發(fā)生改變。酶學(xué)破碎法：選用合適的酶，使細(xì)胞壁遭到破壞，進(jìn)而在低滲溶液中將原生質(zhì)體破碎。四、酶的提取和分離純化

第三節(jié)酶工程2、酶的提取過柱法鹽溶液提取法堿溶液提取法有機溶劑提取法等3、分離酶分離純化的方法很多，可利用酶相對分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離純化，如通過透析的方法分離酶等。1、載體結(jié)合法載體結(jié)合法是指將酶固定到非水溶性載體上的方法。物理吸附法、離子結(jié)合法、共價結(jié)合法。2、交聯(lián)法：通過雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法。交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑是戊二醛等水溶性化合物。3、包埋法：將酶包裹在多孔的載體中。五、酶的固定化方法

第三節(jié)酶工程酶的固定化方法不下百種，歸納起來大致可以分為三類：（1）高果糖漿

葡萄糖——經(jīng)過異構(gòu)化——果糖。生產(chǎn)上實際上只有42%～45%，其余的仍然是葡萄糖。把果葡糖漿中的果糖和葡萄糖分離，將分離出來的葡萄糖再次進(jìn)行異構(gòu)化，如此反復(fù)多次，最后的混合物中果糖的含量可以達(dá)到70%～90%，形成高果糖漿。六、酶的應(yīng)用第三節(jié)酶工程

加酶洗衣粉中添加了多種酶制劑，如堿性蛋白酶制劑和堿性脂肪酶制劑等。對人體沒有毒害作用不會污染環(huán)境。（2）加酶洗衣粉

第三節(jié)酶工程

肌肉組織中含有膠原蛋白，由于存在著交聯(lián)鍵而使肌肉具有很強的機械強度。用嫩肉粉處理年老畜禽的肌肉，可以使這類肌肉中的膠原蛋白水解，使肌肉變軟并且易于烹調(diào)。第三節(jié)酶工程（3）嫩肉粉

木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或米曲霉蛋白酶制成。

傳感器又叫變送器，是一類能將某一種被測物理量變換成便于傳送和處理的另一種物理量（通常為電量）的器件或裝置。例如，驗鈔器就是一種比較簡單的傳感器。第三節(jié)酶工程（4）酶傳感器★菠蘿蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、胃蛋白酶等----胃分泌功能障礙?！?/p>

L-天冬酰胺酶、白喉毒素----抗腫瘤，★胰凝乳蛋白酶----治療炎癥，★激肽釋放酶----降血壓，★尿激酶----溶解血凝塊。第三節(jié)酶工程（5）醫(yī)藥醫(yī)療1857年，法國微生物學(xué)家巴斯德發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵原理，人們才認(rèn)識到發(fā)酵是微生物活動的結(jié)果。第四節(jié)發(fā)酵工程（P147）一、發(fā)酵工程的概念和內(nèi)容二、發(fā)酵工程操作技術(shù)三、發(fā)酵工程的應(yīng)用四、發(fā)酵工程產(chǎn)品——氨基酸

發(fā)酵工程：是指利用微生物的特定性狀，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)，在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)有用物質(zhì)的一種技術(shù)系統(tǒng)，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種新技術(shù)。發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、滅菌、擴大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程和產(chǎn)品的分離提純等方面。一、發(fā)酵工程的概念和內(nèi)容第四節(jié)發(fā)酵工程2、發(fā)酵工藝：:主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。3、下游工程：:指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)。第四節(jié)發(fā)酵工程發(fā)酵工程由三部分組成：1、上游工程:包括利用常規(guī)方法、基因工程方法、細(xì)胞工程方法等選育優(yōu)良種株，最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)組成）的確定，營養(yǎng)物的準(zhǔn)備等。(一)菌種的選育：自然選育、誘變育種，例如，在1943年剛開始生產(chǎn)青霉素時，青霉素的產(chǎn)量只有20μg/mL左右，經(jīng)過長期的誘變育種，如今青霉素的產(chǎn)量已達(dá)到85000μg/mL以上。（二）培養(yǎng)基的配制合適的培養(yǎng)基對細(xì)菌生長非常重要。（三）滅菌發(fā)酵工程中所用的菌種大多是單一的純種。（四）擴大培養(yǎng)和接種在大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中，需要多次擴大培養(yǎng)。二、發(fā)酵工程操作技術(shù)第四節(jié)發(fā)酵工程

這是發(fā)酵工程的中心階段和生產(chǎn)過程。在這個階段，除了要隨時取樣檢測培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度等，以了解發(fā)酵進(jìn)程外，還要及時添加必需的培養(yǎng)基組分，以滿足菌種的營養(yǎng)需要。同時，要嚴(yán)格控制溫度、pH值、溶氧、通氣量與轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件。第四節(jié)發(fā)酵工程（五）發(fā)酵過程20世紀(jì)60年代，生物學(xué)家將計算機應(yīng)用到發(fā)酵工程中，實現(xiàn)了對溫度、pH值、通氣量、轉(zhuǎn)速等的自動記錄和自動控制。

未轉(zhuǎn)基因酵母轉(zhuǎn)基因酵母第四節(jié)發(fā)酵工程轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)β－胡蘿卜素

可食酵母體系的中試生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因酵母430-1290ug/g胡蘿卜31ug/g第四節(jié)發(fā)酵工程

胰島素1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素干擾素1200升人血1升發(fā)酵液2－3萬美元/病人200－300美元/病人第四節(jié)發(fā)酵工程

（1）溫度

溫度影響酶的活性。金色鏈霉菌——在30℃以下時，合成金霉素的能力較強，但當(dāng)溫度超過35℃時，則只合成四環(huán)素而不合成金霉素?；疑溍咕钸m生長溫度是37℃，產(chǎn)生抗生素最適溫度是28℃。第四節(jié)發(fā)酵工程（六）影響發(fā)酵過程的因素（2）pH值

pH值能夠影響酶的活性，以及細(xì)胞膜的帶電荷狀況，從而有可能影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌。此外，pH值還會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的分解等。（3）溶解氧

氧的供應(yīng)對需氧發(fā)酵來說，是一個關(guān)鍵因素。從葡萄糖氧化的需氧量來看，1mol的葡萄糖徹底氧化分解，需6mol的氧。因此，必須向發(fā)酵液中連續(xù)補充大量的氧，并要不斷地進(jìn)行攪拌，以提高氧在發(fā)酵液中的溶解度。（4）泡沫

在發(fā)酵過程中，通氣攪拌、微生物的代謝過程及培養(yǎng)基中某些成分的分解等，都有可能產(chǎn)生泡沫。發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫是正常現(xiàn)象，但過多的持久性泡沫對發(fā)酵是不利的。常用的消泡沫措施有兩類：一類是安裝消泡沫擋板，通過強烈的機械振蕩，促使泡沫破裂；另一類是使用消泡沫劑。（5）營養(yǎng)物質(zhì)的濃度

發(fā)酵液中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是碳氮比、無機鹽和維生素的濃度，會直接影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的積累。因此，在發(fā)酵過程中，也應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行控制。第四節(jié)發(fā)酵工程應(yīng)用發(fā)酵工程生產(chǎn)的產(chǎn)品有兩類：一類是代謝產(chǎn)物，另一類是菌體本身，如酵母菌和細(xì)菌等。菌體——可采用過濾、沉淀等方法將菌體從培養(yǎng)液中分離出來；代謝產(chǎn)物——可采用蒸餾、萃取、離子交換等方法進(jìn)行提取。第四節(jié)發(fā)酵工程（七）產(chǎn)物分離提純

發(fā)達(dá)國家發(fā)酵工業(yè)的總產(chǎn)值占到國民生產(chǎn)總值的5％左右。生產(chǎn)出了種類繁多的藥品，如抗生素、維生素、動物激素、藥用氨基酸、核苷酸(如肌苷)等。1、谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)2、單細(xì)胞蛋白三、發(fā)酵工程的應(yīng)用第四節(jié)發(fā)酵工程

氨基酸主要用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品的生產(chǎn)等方面。在食品工業(yè)上的應(yīng)用

甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸鈉、天冬氨酸鈉具有鮮味，食品添加劑。甘氨酸用于清涼飲料、肉湯、醬菜等的加工，不僅能增加甜味，還能緩和苦味。賴氨酸、蛋氨酸等人體必需的氨基酸常作為食品添加劑，用以提高食品的營養(yǎng)價值。四、發(fā)酵工程產(chǎn)品——氨基酸第四節(jié)發(fā)酵工程

在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用

氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉劑可作宇航員、飛行員的補品。精氨酸藥物用于治療由氨中毒造成的肝昏迷；絲氨酸藥物用作疲勞回復(fù)劑；蛋氨酸、胱氨酸用于治療脂肪肝；甘氨酸、谷氨酸用于調(diào)節(jié)胃液；L-谷氨酸與L-谷氨酰胺用于治療腦出血后的記憶力障礙等。第四節(jié)發(fā)酵工程

在化妝品生產(chǎn)中的應(yīng)用

氨基酸及其衍生物與皮膚的成分相似，具有調(diào)節(jié)皮膚pH值和保護皮膚的功能。例如，胱氨酸用于護發(fā)素中，絲氨酸用于面霜中。又如，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸與脂肪酸形成的表面活性劑，具有清洗、抗菌等功能，用于護膚品、洗發(fā)劑中。第四節(jié)發(fā)酵工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

苯丙氨酸和丙氨酸可用于治療蘋果瘡痂病。美國一家公司用甘氨酸制成了除草劑。不會造成環(huán)境污染。賴氨酸、蛋氨酸添加在飼料中，能加速家畜、家禽的生長，改善肉的質(zhì)量。第四節(jié)發(fā)酵工程第五節(jié)蛋白質(zhì)工程（P155）一、什么是蛋白質(zhì)工程二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的知識為基礎(chǔ)，通過周密的分子設(shè)計，把蛋白質(zhì)改造為合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)。一、什么是蛋白質(zhì)工程第五節(jié)蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析第五節(jié)蛋白質(zhì)工程RNase的某些二級結(jié)構(gòu)血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)（一）蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

基本方法：（1）應(yīng)用化學(xué)裂解法和蛋白酶水解法將多肽鏈專一性裂解；（2）逐一測定每個純化的小肽段的順序；（3）根據(jù)肽段氨基酸順序中的重疊區(qū)確定小肽段的排列次序；（4）完成整條多肽鏈的順序分析。盡管蛋白質(zhì)順序分析已經(jīng)自動化，但仍然耗時、復(fù)雜并且昂貴。重組DNA技術(shù)出現(xiàn)后，人們可以從cDNA或基因序列直接推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的氨基酸順序。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的推測與測定1、一級結(jié)構(gòu)測定

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)很大程度上決定了蛋白質(zhì)的功能，目前應(yīng)用X射線晶體衍射圖譜法和核磁共振法已測定出1萬多種蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，但與已測得的30多萬種蛋白質(zhì)序列相比，還有很大的差距。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程2、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測（1）比較建模法（2）反向折疊法（3）從頭預(yù)測法

根據(jù)蛋白質(zhì)的狀態(tài)，測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法分為兩大類：晶體中:應(yīng)用X射線晶體衍射圖譜法和中子衍射法。溶液中:應(yīng)用核磁共振法、園（圓）二色性光譜法、激光拉曼光譜法、熒光光譜法、紫外差光譜法和氫同位素交換法等。其它方法在應(yīng)用上存在較大的局限性。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程3、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)實驗測定（三）蛋白質(zhì)的創(chuàng)造和改造一是小范圍改造，少數(shù)幾個殘基的替換；二是較大程度的改造，是對來源于不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝，期望轉(zhuǎn)移相應(yīng)的功能；三是蛋白質(zhì)從頭設(shè)計。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程1、定點突變2、盒式突變

3、蛋白質(zhì)融合4、蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記（P158）一、分子雜交二、遺傳標(biāo)記三、分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

（1）Southernblot雜交第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記一、分子雜交（2）Northernblot雜交（3）Westernblot雜交第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記Northernblot雜交Westernblot雜交

遺傳標(biāo)記：指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。遺傳標(biāo)記包括形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記四種類型。第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記二、遺傳標(biāo)記（一）形態(tài)標(biāo)記主要包括肉眼可見的外部特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等，也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關(guān)的一些特性。形態(tài)標(biāo)記簡單直觀、經(jīng)濟方便；但其數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的，且多態(tài)性較差，表現(xiàn)易受環(huán)境影響。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記即細(xì)胞染色體的變異。包括染色體核型（染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）的變化。第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記（二）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

生化標(biāo)記主要包括同工酶和等位酶標(biāo)記。同工酶是指不同基因座位編碼的酶的不同形式，而等位酶是指由一個基因座位的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式。分析方法是從動植物組織的蛋白粗提物中通過電泳和組織化學(xué)染色法將酶的多種形式轉(zhuǎn)變成肉眼可辯的酶譜帶型。（三）生化標(biāo)記第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記分子標(biāo)記指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記（四）分子標(biāo)記(1)高的多態(tài)性(2)共顯性遺傳(3)能明確辨別等位基因(4)遍布整個基因組(5)均勻分布于整個基因組(6)選擇中性；(7)檢測手段簡單、快速；(8)成本低廉；(9)重復(fù)性好。

限制性片段長度多態(tài)性（縮寫RFLP）是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)。RFLP技術(shù)的原理是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變和一段DNA的插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記1、RFLP

印跡法內(nèi)切酶切開DNA電泳印跡轉(zhuǎn)移放射性探針雜交膠片顯影第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記

對線粒體和葉綠體DNA進(jìn)行的這種多態(tài)性差異檢測在1980年之前就已出現(xiàn)，從理論上說，這種多態(tài)性也可稱為RFLP。

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))由Mullis等于1985年首創(chuàng)。經(jīng)數(shù)小時后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍。第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記2、PCR技術(shù)及其在分子標(biāo)記中的應(yīng)用（1）AP-PCR（2）隨機擴增多態(tài)性DNA(縮寫RAPD)：（3）DAF：（4）AFLP（5）STS第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記

簡單重復(fù)序列(SSR)：即微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性。3、SSR（SSLP）

染色體原位雜交技術(shù)是DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進(jìn)行檢測的分子標(biāo)記技術(shù)。第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記4、染色體原位雜交

1、司法鑒定親子鑒定、生物技術(shù)偵破案件等都是應(yīng)用分子標(biāo)記中的簡單、快速的PCR技術(shù)及其在相關(guān)方法。

2006年5月英國“泰唔士報”、美國“紐約時報”報道,根據(jù)英國“牛津祖先”公司的DNA檢測,美國邁阿密大學(xué)48歲會計學(xué)教授湯姆羅賓遜是成吉思汗的后裔;6月份改為美國休斯敦“族譜DNA”公司進(jìn)行第二次檢測，證實并非成吉思汗的后裔。三、分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記王納文2、分子遺傳圖譜的構(gòu)建第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記幾乎所有重要農(nóng)作物的RFLP圖譜均已構(gòu)成基因定位分子標(biāo)記輔助育種選擇基因圖位克隆第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記3、遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定4、重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記5、分子標(biāo)記輔助選擇6、重要性狀的圖位克隆建立在分子標(biāo)記遺傳圖譜基礎(chǔ)上，克隆目的基因。

無須事先知道基因的DNA序列，也不用了解基因的表達(dá)產(chǎn)物是什么就可以直接克隆基因。第六節(jié)分子雜交與遺傳標(biāo)記1、徐永華，《動物細(xì)胞工程》化學(xué)工業(yè)出版社P55-652、黎裕賈繼增王天宇分子標(biāo)記的種類及其發(fā)展，生物技術(shù)通報，1999年第4期19-223、季靜，山村三郎，西原昌宏，王罡，小巖宏之，朱長甫，通過轉(zhuǎn)基因提高β-胡蘿卜素生物合成量，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2004，20（4）：440-444，ISSN:1007-7626,CN:11-3870/Q4、宋思揚，樓士林，《生物技術(shù)概論》，科學(xué)出版社，2003年，第二版。HarveyLodish主編，《MolecularCellBiology》2000年6、GWang,VHyne,SChao,YHenry,JDeBuyser,MDGale,JWSnape(1995)AcomparisonofmaleandfemalerecombinationfrequencyinwheatusingRFLPmapsofhomoeologousgroups6and7chromosomes.TheorApplGenet91:744-7467、閻桂琴，韓榕，郜剛，《生命科學(xué)技術(shù)概論》科學(xué)出版社，20038、季靜,王罡,EBelhassen,HSerieys,ABerville(1996)運用BulkedDNA-RAPD方法尋找向日葵細(xì)胞質(zhì)雄性不育核恢復(fù)基因Rf1探針的研究。中國科學(xué)C輯26(4):377-384參考文獻(xiàn)1、什么是生物技術(shù)？（P133）2、簡述基因工程的操作過程。（P133-134）3、什么是細(xì)胞融合？簡述其操作過程。（P139-140）4、什么是酶工程？簡單舉例它有什么作用。（P142-143）5、簡述蛋白質(zhì)的創(chuàng)造與改造方法。（P157-158）6、什么是分子標(biāo)記？什么是遺傳標(biāo)記？（P159-162）7、簡述RFLP原理及其步驟。（P160）8、簡述植物轉(zhuǎn)基因的主要方法。（P137-138）思考題：v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9PgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5GOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1