溶劑效應(yīng)-液相色譜峰形的隱形黑手

11/11?溶劑效應(yīng)——液相色譜峰形的隱形黑手？在液相系統(tǒng)分析過程中，有沒有遇到過色譜峰前延現(xiàn)象？為什么有時候同一個樣品減小進樣量色譜峰就變的很好看？日常的分析工作中，我們通常將更多精力集中在流動相和儀器方法的選擇上，忽視了樣品進樣溶劑的重要性。

如果溶劑選擇不當(dāng)則會產(chǎn)生“溶劑效應(yīng)”，使我們在定性和定量分析中產(chǎn)生誤判，影響分析結(jié)果。因此，了解“溶劑效應(yīng)”產(chǎn)生的原因及掌握避免“溶劑效應(yīng)”的基本方法對我們分析工作者是十分必要的。今天小析姐就跟大家分享一下，液相分析過程中“溶劑效應(yīng)”的那些事兒~

一、溶劑效應(yīng)是怎么回事兒

1.溶劑效應(yīng)的概念

通常情況下對于溶劑效應(yīng)理解為稀釋劑溶劑強度大于流動相時造成色譜峰變形的現(xiàn)象。如用純乙腈溶解樣品，注入流動相為乙腈-水（18:82）的反相系統(tǒng)中，會造成峰分叉或拖尾的結(jié)果。但是這種概念不能解釋實踐中其他由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異?，F(xiàn)象，如溶出曲線研究中pH6.8溶出介質(zhì)的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況，這些情況中稀釋劑的溶劑強度并不一定大于流動相，但是卻發(fā)生了色譜行為異常的現(xiàn)象。

鑒于許多由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異常現(xiàn)象不能用目前的溶劑效應(yīng)進行解釋，筆者認為有必要將溶劑效應(yīng)的概念進行重新闡述：溶劑效應(yīng)，是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動相中所處狀態(tài)的差異對色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴重，則可能造成明顯的色譜行為異常，如峰分叉、拖尾等。

產(chǎn)生溶劑效應(yīng)的圖

2.溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生過程解析

第一階段：樣品剛被注入系統(tǒng)，進入色譜柱后，流動相氛圍中的目標物以正常速度被洗脫。因強溶劑洗脫，移動速度快，樣品在空間上開始慢慢分裂。

第二階段：在一定時間內(nèi)，溶劑氛圍中的目標物移動始終快一些，前后兩部分距離擴大。但移動快的目標物所處氛圍逐漸被流動相稀釋(注：因為溶劑和流動相均不保留)，其移動速度會逐漸降至正常流速。直到前面目標物的氛圍完全被流動相替代，前后兩部分的距離穩(wěn)定下來。因而，樣品溶劑與流動相洗脫強度差距越大，兩部分目標物最終的距離拉的越大。

第三階段：所有目標物在色譜柱中正常移動，但分裂已不可逆轉(zhuǎn)。

經(jīng)過檢測器，同一目標物給出了兩個色譜峰。其中進柱前即擴散進入流動相的那部分目標物組成了后面的色譜峰，它的保留時間與目標物的真實保留時間基本吻合。

簡單概括，強洗脫溶劑不均衡地參與了目標物的洗脫，使色譜峰保留時間整體提前，而樣品在柱前的不充分擴散導(dǎo)致了峰形扭曲。這種影響輕則導(dǎo)致峰展寬，嚴重時甚至導(dǎo)致峰裂分，給定性定量帶來災(zāi)難。

二、溶劑效應(yīng)為啥會發(fā)生！

1.溶劑強度

在反相色譜系統(tǒng)中溶劑強度的順序為水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最強）。溶解樣品的溶劑強度大于該樣品出峰時流動相強度，樣品溶劑可以看成流動相的一部分，一部分樣品溶解于溶劑中會被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動相，被流動相洗脫出，這樣會造成色譜峰的展寬或者分叉。

2.進樣體積

當(dāng)進樣體積較小時，擴散至流動相中的溶質(zhì)占大多數(shù)，且擴散在很短時間內(nèi)完成，因此峰形與用流動相直接溶解樣品無大差異。隨著進樣的體積增大，留在溶劑本身里的溶質(zhì)的量逐漸增大，當(dāng)進樣體積增大到一定數(shù)量，留在溶劑里的溶質(zhì)的量變得不可忽略，在色譜圖上就表現(xiàn)為色譜峰的分叉、拖尾等。

3.溶劑與流動相的兼容性

有時，當(dāng)我們使用流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品，這時很多小伙伴會選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑，甚至DMSO這樣的“萬能溶劑”來溶解樣品。這樣進樣的結(jié)果是溶劑與流動相不兼容，溶質(zhì)難以在流動相中擴散。又如，在做參比制劑的溶出曲線中，溶媒中經(jīng)常加入表面活性劑。而帶有表面活性劑的溶劑進樣后，由于溶質(zhì)在含有表面活性劑的溶劑中的分配系數(shù)與在流動相中的分配系數(shù)存在較大差異，就會導(dǎo)致峰形的問題，甚至保留時間的漂移。

4.電離狀態(tài)

電離狀態(tài)的差異主要由溶劑和流動相各自的pH差異引起。我們都知道，在反相體系中，目標化合物的存在狀態(tài)不同，保留行為會有明顯的差異，而存在狀態(tài)就取決于目標化合物在不同pH體系內(nèi)的電離狀態(tài)。若樣品在溶劑和流動相中電離狀態(tài)差異較大，樣品溶液在接觸流動相的過程中，來不及緩沖至流動相中的電離狀態(tài)，這個時間如果較長，就容易表現(xiàn)為保留時間發(fā)生錯位或峰形變形，如下圖的案例。

（流動相為pH3.0緩沖鹽。綠色譜圖為對照品，另外三個譜圖樣品的溶劑從下至上分別為0.1%磷酸、純化水、pH3.0流動相）

5.柱前管路

柱前管路內(nèi)徑越大、管路越長，越利于目標物向流動相擴散，而且使用更粗的管路比更長的管路有效(注：假設(shè)死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬，對柱效有危害，然而相較于峰分叉的危害而言，前者尚能接受。

這就是為什么有時候會發(fā)現(xiàn)，HPLC的液相（管路死體積大）比UPLC的液相（管路死體積?。┥V峰型好。

三、有什么危害？

1.導(dǎo)致柱效下降，危害分離；

2.危害峰形，危害定量，甚至危害定性；比如，在LCMS中，掃描前體離子時，遇到這種情況，甚至不知道哪個峰才是目標物；

3.當(dāng)標樣和樣品的溶劑不一致時，保留時間不吻合，同樣危害定性；比如酒類成分分析，標樣溶于純水，樣品是過濾的酒，后者的溶劑就是乙醇水，它的保留時間必定早于純水溶解的標樣；再比如水中污染物分析，目標物溶于有機相得到標樣，而樣品是過濾后的天然水；

4.強洗脫的溶劑在基質(zhì)中提取出的雜質(zhì)遇流動相會析出，堵塞針座、柱前管路或色譜柱。

四、應(yīng)該怎樣解決“它”？

1.溶劑強度

對于這一最普遍的溶劑效應(yīng)，解決辦法即調(diào)整稀釋劑或流動相，使二者洗脫能力接近，或稀釋劑洗脫能力稍低于流動相都是可以的。一般情況下，為避免溶劑強度差異導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)，反相色譜中較為穩(wěn)妥的做法是稀釋劑中有機相比例和流動相相當(dāng)，必要時可略高于流動相，但應(yīng)當(dāng)據(jù)其評估其溶劑效應(yīng)風(fēng)險。

2.進樣體積

常規(guī)情況下，為了保證峰形，我們的進樣體積都控制在5-20μL，盡量不要超過25μL。如果不能做到減少至合適的進樣體積，為了得到較好的峰形，應(yīng)盡量選擇與流動相比例相同或接近的溶劑。

3.溶劑與流動相的兼容性

使得溶劑與流動相能較好地兼容，目前辦法有兩個：

一、若流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品，則用可以溶解樣品的溶劑溶解成高濃度儲備液，然后用流動相稀釋至所需濃度；

二、在流動相中加入同樣的助溶劑或表面活性劑，或提高有機相的比例。

4.電離狀態(tài)

電離狀態(tài)的差異許多情況下會表現(xiàn)為保留時間的漂移或不穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^將樣品溶液的pH調(diào)節(jié)至與流動相一致，或增大流動相的緩沖能力來改善。

5.柱前管路

對于梯度洗脫而言