共聚焦顯微鏡zeisslsm700使用說明-中文版lsm

前 設(shè)備概 觀察方 熒光觀 TFT觸摸屏的使 啟動頁 啟動 圖像掃 Z-stack掃 光漂白實 圖像拼 多視野掃 光譜拆 λstack掃 光譜拆 濾鏡功 圖像修 圖像 通道平 圖像的保 圖像的瀏 圖像的輸 激光安 附 Tile模 為方便廣大用戶在使用ZeissLSM700初期，熟悉設(shè)備的使用方法，特參照ZEN2011Black本說明包含了激光共聚焦掃描顯微鏡基本工作原理，設(shè)備概述，硬件操作說明，使用說明，安使用須知設(shè)備日常潔6部分。簡單介紹了eissM0的常用功能和基本操作，高級模塊的使用或其他相關(guān)問題請參考N01lackesineatinMaal或致電當(dāng)?shù)貞?yīng)用工程師做進一步咨詢。糊。特別是對于比較厚的樣品來講，這種現(xiàn)象會更為明顯(Fig.1)。Fig2一視野內(nèi)相鄰樣品之間的發(fā)射信置加裝Pinhole。由于只有來自焦平面的發(fā)射光信號可以在共軛位置匯聚，穿過Pinhole，而來自非焦平面的發(fā)射光信號在共軛位置是發(fā)散的，絕大部分被Pinhole阻平面的發(fā)射光信號(Fig2)。這樣，激光共聚焦掃描顯微鏡在很大程度上限制了來自非焦平面的信號Fig2成一幅完整的圖像，在激光共聚焦掃描顯微鏡中引入了XY掃描振鏡，滿足了逐點逐行掃描焦平面信號的需求。激光共聚焦掃描顯微鏡通常使用光電倍增管(PMT)作為檢測器。當(dāng)激傳輸至計算機，最終完整清晰的共聚焦圖像。Z軸移動時，共軛焦平面隨之發(fā)生移動，可以再次掃描形成一張新的圖像，站及其他相關(guān)附件組成(Fig.3)。PHPinholePMTPhotomultiplierLSM700激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)最多可以接入4在掃描元件中，激光由Combiner會聚為一束，經(jīng)二色分光片反射后，通過XY振鏡的引導(dǎo)離開掃描元件，由物鏡聚焦到樣品上，在樣品上逐點逐行進行掃描。用戶可以通過控光在Pinhole處匯聚，穿過Pinhole，其他非焦平面的發(fā)射光則絕大部分被Pinhole。用戶可以調(diào)節(jié)Pinhole的直徑來優(yōu)化光學(xué)切片的厚度。經(jīng)過Pinhole后，焦平面的信號被VSD按照指定波長分為兩束。在通過發(fā)射光濾片后，投射到不同的檢測器上，完成信號。VSD與常用的二色分光片不同，其分光范圍在420–630nm范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)。用戶可以通過在其分光范圍內(nèi)任意指定圖像所需分光波長，將同時激發(fā)的兩種發(fā)射光分別投射不同的檢測器上，同時信號，迅速完成圖像掃描。LSM700激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)配有獨立的透射光檢測器，可以在熒光成像的同時顯微鏡常見元件名稱蔡司科研級電動倒置顯微鏡AxioObserverZ1的各常見元件名稱如下圖所示(Fig.4)Fig4AxioObserverZ1 蔡司科研級電動正置顯微鏡AxioImagerZ2的各常見元件名稱如下圖所示(Fig.5)Fig5AxioImagerZ2 激光共聚焦掃描顯微鏡開關(guān)機順序激光共聚焦掃描顯微鏡開機順序打開穩(wěn)壓電源或UPS6)。上方的黃色指示燈亮起，提示激光器已經(jīng)啟動。打開熒光照明器開關(guān)。processing按鈕。Fig6激光柜正面 Fig7.激光柜背面共聚焦掃描顯微鏡關(guān)機順保存圖像，退出。關(guān)閉電腦及顯示器電源顯微鏡的科勒照明科勒照明的調(diào)節(jié)步驟(Fig將樣本(最好是色彩鮮明的樣品)用樣品夾固定在載物臺上，使用10X物鏡，聚光鏡選擇H或BF位置，反射光模塊轉(zhuǎn)盤選擇空位，其他附屬光學(xué)元件，包括起偏器、物鏡根部的DIC插片，全部拉出光路。照相光路轉(zhuǎn)換到觀察狀態(tài)。旋轉(zhuǎn)粗/微調(diào)焦旋將視場光欄慢慢放大，當(dāng)多邊形正好外切于視場的時候(即看不到多邊形的邊緣)就112345Fig8觀察方式微分差觀微分差(DIC)是一種常用的透射光明場觀察方式，主要用于觀察活細胞等透明樣本，其使用方法較為復(fù)雜。完成DIC觀察所必需的元件包括四部分：兩個DICDIC根據(jù)物鏡根部DIC棱鏡上的標(biāo)記，將聚光鏡轉(zhuǎn)到DICⅠ或Ⅱ或Ⅲ位置，這一組棱中點擊DIC按鈕，顯微鏡將根據(jù)當(dāng)前物鏡將需要的DIC由于雙折射物質(zhì)會影響DIC的效果，因此，不能使用塑料制品進行DIC觀察熒光觀察塊轉(zhuǎn)盤中選擇相應(yīng)的熒光模塊，聚光鏡選擇H/BF位置，即可正常觀察。TFTTFT觸摸屏可以控制顯微鏡部分的常用電動元件，啟動頁面如下圖所示(Fig.啟動頁面啟動頁面的部分會顯示所有在顯微鏡啟動初始化過程中檢出的配置及其狀態(tài)，包置顯微鏡則是物鏡向下移動。負載位置比工作位置低大約10mm，方便用戶完成(Fig.10)，點擊按鈕，載物臺返回操作位置。Fig9TFTshutter。如果明場光路中沒有shutter，點擊Fig9TFTMakeitvisible!按鈕：這個按鈕可以將顯微鏡轉(zhuǎn)換到一個基本的觀RL轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)至透射光觀察方式位置或空位，光路轉(zhuǎn)換至100%目鏡觀察Microscope頁對于正置和倒置顯微鏡來講，TFT觸鈕都在Microscope頁面中，包括物鏡，在啟動頁面左側(cè)點擊Fig10LoadPosition按鈕，打開Microscope頁面。正置顯微鏡會出現(xiàn)Revolver按鈕，而倒置顯微鏡會出現(xiàn)Control按鈕。點擊按鈕，可進入相應(yīng)頁面。在Revolver/Control頁面中選擇Objective控制頁面(Fig.11)，其中會列出顯微鏡上配置的全部物鏡，點擊物鏡按鈕，該物鏡會在Revolver/Control頁面中選擇Reflector控制頁面(Fig.12)，會列出顯微鏡上配置Fig11XYZ頁

Fig12MicroscopeXYZ頁面中包含兩個控制頁：Position和Measure。由于觸摸屏只能控制電動元件，根據(jù)顯微鏡所配置的載物臺不同，XYZ頁面顯示的內(nèi)容會有所電動載物臺：觸摸屏可以XY和Z軸坐標(biāo)手動載物臺：只允許Z軸聚焦螺旋位置（XY控制缺失無法使用如果配置了電動載物臺和電動Z軸，Position頁面中會以毫米為單位顯示當(dāng)前視野的XYZ坐標(biāo)位置(Fig.13)。SetZeroman0。SetZeroauto按鈕：將載物臺移動到端位，設(shè)置為原點。當(dāng)載物臺移動時，會出現(xiàn)如下彈出窗口。"CautionRemovespecimen,beforestagemovesintoendposition!"如果載物臺上沒有樣品，點擊OK按鈕確認信息，或者按Cancel按鈕停止載物臺的移動。SavePosition作可以通過下方的位置按鈕定義五個視野的坐標(biāo)位置(Fig.14)。方法移動到所需XYZ位置；如果想同時記錄Z軸坐標(biāo)，勾選incl.Z復(fù)選框。按下SavePosition按鈕，彈出CurrentPositionssaveas在此窗口中，顯示出5個按感視野的XYZ坐標(biāo)，否。。Delete按擊Yes按鈕確認刪除。Measure控制頁

Fig13正置顯微鏡Microscope->XYZ->PositionFigFig13正置顯微鏡Microscope->XYZ->PositionFig14正置顯微鏡Microscope->XYZ->Position這樣顯示區(qū)域ΔX,Y和ΔZ將被設(shè)置為0。通過目鏡觀察樣品，每次載物臺的移動距離均可顯示為ΔX,ΔY和ΔZ顯微鏡使用時的注意事項 顯微鏡的各光學(xué)部件應(yīng)調(diào)節(jié)到位（如，DIC插片，熒光濾片，物鏡等，以免影響顯微鏡的正常工作。如果未調(diào)節(jié)到位,那么觀察時通常會看到月牙形陰影。啟動雙擊桌面上的圖標(biāo)ZEN2011(Blackversion)啟動 口(Fig.16)：Fig16ZEN2011Blackversion)點擊StartSystem按鈕，激活全部模塊，完成圖像掃描和分析。注意，此時電源點擊Imageprocessing按鈕，只激活圖像處理模塊，可以完成對已保存圖像的后期處理；但不激活圖像掃描模塊，不能拍攝新的。此時，由于不使用掃描元件，電啟動過程中會進行顯微鏡及掃描頭部分的自檢，所以在啟動期間，請不要移動物鏡熒模塊元，避免檢錯點擊ttts的角形鈕打開隱藏框，以示啟時自檢程?；窘缑娼榻B啟動后，基本界面如下圖所示(Fig.應(yīng)用欄Application 左側(cè)LeftTool 狀態(tài)欄Status菜單 圖像顯示區(qū)域CenterScreen主MainTool 右側(cè)RightToolFig17啟動后的ZEN2011BlackVersion)護。通常蔡司會在裝機時調(diào)整好該主頁面的設(shè)置，用戶通常不需要再進行掃描生成的圖像會顯示在界面的中間部分(Fig.18)。打開后，在圖像的左側(cè)會出現(xiàn)一系列不同的視圖窗口。根據(jù)圖像內(nèi)容，可提供各通道的單像、灰度直方圖、熒光共，3D重構(gòu)圖像等不同視圖。在打開不同的視圖窗口時，圖像下方會顯示中間圖像顯示區(qū)域就會出現(xiàn)多個圖像窗口，并在最上方顯示圖像名稱，方便用戶選擇工具主頁面MainTool 工具 顯示的圖像Displayed設(shè)置列表 工具組Tool 右側(cè)RightTool操作按鈕Action 狀態(tài)欄Status 視圖控制界面View拍攝工具選擇界面

視圖窗口View拍攝啟動按鈕Starting5

圖像頁面ImageFig18ZEN2011BlackVersion)所有打開的圖像會在右側(cè)中 按鈕，將右側(cè)選中的圖像保存為默認的CZI格式。點擊按鈕，可以刪除選中的圖像。 存圖像，打開文件夾和恢復(fù)設(shè)置。用戶還可使用主 右側(cè)的Workspaceconfiguration保存對界面的設(shè)置，包括對各和圖像窗口的設(shè)置等。點擊Workspaceconfiguration輸入框右側(cè)的按鈕，可以在彈出的 存大小等信息(Fig19)。如果電腦緩存占用過多，此處會出現(xiàn)紅色或黃色警示。在掃描圖Fig19二維圖像掃描目鏡下觀察樣品將樣品固定在樣品夾上，注意使蓋玻片朝向物鏡。啟動，在左側(cè)點Locate頁面下的Ocular以圖形按鈕的方式展示了顯微鏡部分包含的全部電動元件(Fig.20)。下圖中為AxioObserverZ1的常見配置光路圖，根據(jù)配置不同，實際顯示FigFig20Locate：，點擊Online按鈕，激活對顯微鏡的：，控制按鈕，在框中點擊按鈕On條將光強調(diào)節(jié)至3-6V相應(yīng)的光學(xué)元件，如DICII或DICIII，并用滾動條調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)臄?shù)值孔徑制按鈕，從下拉菜單中選擇適當(dāng)在框中打開反射光照明器，并調(diào)節(jié)光強；點擊反射光shutter按鈕，將其打開；點擊灰度濾片按鈕，在框中使用下拉菜單調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)透過率，以保護樣品；點擊反射光模塊控制按鈕，根據(jù)熒光從下拉菜在目鏡下將待掃描區(qū)域調(diào)節(jié)至視野，在界面中點擊Offline按鈕，關(guān)閉所有shutter，不再控制顯微鏡包含的電動元件，結(jié)束觀察。準(zhǔn)備開始掃描。設(shè)置快捷按鈕右側(cè)的保存按鈕，在彈出的框中輸入相稱，點擊OK，完成保存。點點擊Assign按鈕，在Buttons下拉菜單中選擇任一按鈕，在Configuration下拉菜單好的光路配置設(shè)為快捷按鈕(Fig.21)。最多可以設(shè)8個快捷按鈕。在以后的操作中，只需在點擊Online按鈕，激活對顯微鏡的控制后，點擊所活細胞培養(yǎng)相關(guān)元件的控如果配有活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可以在Incubator中完成相應(yīng)的設(shè)置(Fig.在啟動前，確認活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)各控制模塊上的電源已經(jīng)打開，電源控制燈菜單中輸入各通道溫度及CO2濃度的相應(yīng)參數(shù)Fig22Fig22Fig21圖像掃描新建圖像文件由于預(yù)覽或掃描形成的二維圖像無法自動保存，每次預(yù)覽或掃描形成的會覆蓋之前形成的，所以需要在每次掃描新的前新建空白。點擊操作按鈕右上方的New按鈕，建立一張空白，用于顯示預(yù)覽或掃描形成的(Fig.23)。點擊 左側(cè)或右 右下角的按鈕，也可新 光路配置點擊操作按鈕左上方的SmartSetup按鈕(Fig.23)，打開SmartSetup框，在Configureyourexperiment物質(zhì)，則默認顯示黑白圖Dye列表中包含了目前 Fig24SmartSetup提供三種備選掃描模式(Fig.光路配置完成后，在Acquisition頁面SetupManager工具組下LightPath.點擊LightPath的藍色標(biāo)題行，打開LightPath。勾選標(biāo)題行右側(cè)的Showall復(fù)選框，顯示全部設(shè)置參數(shù)。在ZEN2011中，每張圖像根據(jù)所含熒光物質(zhì)的數(shù)Fig26LightFig26Light高亮狀態(tài)，LightPath中即顯示出所選track的光路設(shè)置，如Fig.26中的Track1即處于選中狀態(tài)。點擊激光器控制按鈕，可以在彈出的框中更改配置的激光器和質(zhì)名稱。更改名稱后，Detector列表上方的發(fā)射光譜也會發(fā)生相應(yīng)變化。在Fig28框恰當(dāng)?shù)男盘柺占秶?yīng)Fig28框。相應(yīng)的track光路設(shè)置圖中勾選T-PMT復(fù)選框。直至完成全部掃描(Fig.默認的掃描模式為Switchtrackeveryframe，即在一個track完成整幅圖像的掃描后，自動切換至下一個直至完成全部掃描(Fig.信號無法完全的現(xiàn)象。此時，可在LightPath中選擇Switchtrackeveryline，在選擇Switchtrackeveryline后，會彈出框，提示將根據(jù)第一個track的光路設(shè)置自動覆蓋后續(xù)所有track的設(shè)置，選擇Yes將接受此修改，選擇No則仍然使用Switchtrackeveryframe掃描模式(Fig.28)。掃描圖像參數(shù)的設(shè)置完成光路設(shè)置后，在AcquisitionParameter工具組的AcquisitionMode下，進一步設(shè)置掃描圖像參數(shù)。點擊AcquisitionMode的藍色標(biāo)題行，打開。勾選標(biāo)題行右側(cè)的Showall復(fù)選框，顯示所有設(shè)置參數(shù)。AcquisitionMode下有5個的參數(shù)(Fig.29)。Objective控制區(qū)域中會自動顯示在ScanMode下拉菜單中選擇Frame，完成二維圖像掃描；或選擇FrameSize為掃描所得圖像的分設(shè)定大于計算所得最優(yōu)分辨率的 Fig29AcquisitionLineStep下拉菜單的默認設(shè)置為1，即選擇逐行掃描。如果選2，則為隔行掃描，在ed控制區(qū)域中可以通過拖動滾動條或直接在輸入框中輸入數(shù)值來設(shè)置掃描速度，通常在響圖像質(zhì)量。所以請選擇適中的掃描速度。如果需要較高的掃描速度，可以點擊輸入xAveraging參數(shù)的設(shè)置是為了通過重復(fù)掃描計算平均結(jié)果，來降低背景噪音。 度和大小。最好在預(yù)覽圖像的同時，對掃描區(qū)域進行調(diào)節(jié)以保證其準(zhǔn)確性。由于掃描掃描通道參數(shù)的設(shè)置開。勾選標(biāo)題行右側(cè)的Showall復(fù)選框，顯示所有設(shè)置參數(shù)(Fig.30)在Channels中勾選一個Gain(Master)值調(diào)大，并適當(dāng)調(diào)節(jié)焦平PMT的。Fig30點擊Pinhole輸入框下方的1AU按度上Fig30界面中的RangeIndicator，啟動強(Fig.31)。圖像中的紅色偽彩代代表該像素點的灰度值為0(Fig.32).調(diào)節(jié)GainMaster)和Offset

Fig31Dimension圖像中達到飽和灰度值的點和灰度值為0的點都盡可能的少(Fig.32)(長檢測器。DigitalOffset：用以調(diào)節(jié)圖像背景，數(shù)值越小，背景越暗。但Offset在降低背景的DigitalGain：對所有信號進行數(shù)碼放大，包括來自樣品的真實信號和環(huán)境背景噪用戶針對每一track在LightPath中所設(shè)定的光路和Channels中設(shè)定的掃描設(shè)置，可以逐一保存在Channels的TrackConfiguration中。點擊TrackConfiguration輸入框右側(cè)的保存按鈕，在彈出的框中輸入名稱，點擊OK完成保掃描區(qū)域的調(diào)節(jié)點擊AcquisitionMode下ScanArea左側(cè)的三角形按鈕，打開控制區(qū)域(Fig.點上，可以旋轉(zhuǎn)掃描區(qū)域至所需的角度，但圓形結(jié)點將處于圖像的右下角位置。使按鈕所在行恢復(fù)初始設(shè)置。點擊ResetAll按鈕，則使ScanArea下的全中間變倍值，ZEN2011提供了從 Fig33ScanArea控制區(qū)域后，需要重新點擊FrameSize下的Optimal按鈕，將圖像分辨率調(diào)節(jié)到當(dāng)前掃描區(qū)域圖像掃描其他常用按鈕方，會激活Reuse按鈕(Fig.31)。點擊此按鈕，會自動掃描該圖像時的光路及也可使用 中的按鈕，加載當(dāng)前打開的原始圖像的光路及掃描設(shè)置鈕(Fig.31)。點擊此按鈕，圖像中會出現(xiàn)一紅色方框(Fig.34)。可用此方框在當(dāng)前圖像將鼠標(biāo)移動至紅色方框的，光標(biāo)會變?yōu)槭中危藭r可用鼠標(biāo)拖曳方框移動掃描位置；將鼠標(biāo)移動至方框的頂點位置，光標(biāo)會顯示為，可以拖曳邊框調(diào)節(jié)掃描區(qū)域的大小；將鼠標(biāo)移動至邊框上，光標(biāo)會顯示為，可以拖曳邊框調(diào)節(jié)掃描區(qū)域的Fig34Crop Fig34Crop，F(xiàn)rameSize和Speed，及系統(tǒng)允許的最快掃描速度。因此，特別是在將掃描區(qū)域設(shè)置成長方形后，需要使用Continue按鈕進行預(yù)覽。否則，會自動把掃描區(qū)域調(diào)節(jié)至512x512。Set按鈕會自動恢復(fù)為SetExposure按鈕。Find點擊操作按鈕中的FindFocus按鈕，會沿Z軸方向自動掃描一系列圖像，選擇Stop按鈕會自動恢復(fù)為FindFocus按鈕。Fig35二維圖像相關(guān)的常用視圖掃描形成的圖像最終顯示在界面的圖像窗口中，ZEN2011可以提供多種視圖及相應(yīng)的視圖控制界面，滿足用戶在觀察分析優(yōu)化圖像方面的需求。ZEN2011在圖像2D視像，在2D視圖中，只顯示多通道疊加圖像(Fig.36)。Dimension視圖控制界

Fig362DDimension視圖控制界面由上至下分為圖像顯示比例(Zoom)，圖像顯示通道(Channels)和常用按鈕三個控制區(qū)域(Fig.37)為最適顯示比例，根據(jù)視圖窗口的大小自動調(diào)節(jié)圖像顯示比例，以保證整和分別為縮小和放大圖像按鈕。也可以拖動按鈕右側(cè)的滾動條點擊此按鈕，可以用鼠標(biāo)在圖像中選擇感 默認勾選Interpolation選項(Fig.37)。勾選此選項，在放大圖像時，會自會出現(xiàn)明顯的馬賽克現(xiàn)象(Fig.38)。在Channels區(qū)，列出了圖像中包含的各熒光通道及其偽彩色。在此，每個熒白圖像。如果勾選了SingleChannelFig37Fig37Dimension在常用按鈕區(qū)，列出了Reuse描。點擊Stage按鈕，圖像中心Display視圖控制界Display視圖控制界面中顯 節(jié)參數(shù)。用戶可以對圖像顯示的灰度進行調(diào)節(jié)，以優(yōu)化圖像達到更好的顯示效果(Fig.在灰度直方圖的上方，設(shè)置了Min/Max和Bestfit快捷按鈕，可以迅速調(diào)節(jié)圖像的對比度。點擊Min/Max按鈕，會自動將灰度直方圖對角線左側(cè)的第一個點調(diào)estit按鈕，將會根據(jù)estit按鈕右側(cè)入框中輸入的數(shù)值，自動調(diào)節(jié)灰度直方圖對角線的位置。例如，在第一個輸入輸入.，將圖像中最暗的.%的像素全部設(shè)為背景；在第二個輸入框輸入.%灰度。選At選，將動據(jù)置調(diào)圖對比。Graphic視圖控制界。字說明等項的工具，并可完成手動測量的設(shè)定(Fig.40)。方的項按鈕中，從左至

例尺，直線，箭頭，矩形，圓形和不規(guī)則形狀的添加按鍵結(jié)束，可自動閉合曲線成不規(guī)則形狀。使用選擇工具，可以改變項的位置和大小。使用選擇工具點擊感區(qū)域的邊框，使之處于選中模式，可用鼠標(biāo)拖曳Select菜單右側(cè)的下拉菜單中，可以分別設(shè)定項的線條粗細和顏色。點擊More按 項在圖像中的位置固定，否則，可移動該項在圖像中的位置。當(dāng)勾選M列時，會自動測量項的周長，角度和面積等信息，并自動顯示在圖像中。對于文本和比例尺，無法使用此復(fù)選框。點擊列 按鈕，可以刪除選中的項。點擊列表左下角的 框中輸入名稱，點擊OK完成對整 項列表保存。點擊按鈕，在文件列表右側(cè)的輸入框，由上至下依次顯示了項在圖像中的位置(X,Y)，長度(W)和高度(H)。點擊CutRegion按鈕，可以將選中的感區(qū)域中的圖像剪切至新的圖像Split對于多通道熒光圖像，ZEN2011提供了Split視圖，以觀察各通道單獨的熒光圖像及疊加圖像(Fig.41)。在設(shè)置多通道熒光圖像的掃描參數(shù)時，可使用此視圖，優(yōu)化各框，會自動顯示多通道熒光疊加圖像；否則，只顯示各通道單獨的熒光圖像。Histo

Fig41Split表供用戶參考(Fig.43)。在表格上點擊右鍵，選擇SaveTable選項，可以將表格中的數(shù)選擇工具點擊感區(qū)域的邊 Coloc視

Fig43Histo多通道熒光圖像中某兩種熒光的共定位關(guān)系?？梢蕴峁晒夤捕ㄎ簧Ⅻc圖和相關(guān)同的偽彩標(biāo)記出來(Fig.45)。在表格上點擊右鍵，選擇SaveTable選項，可以將表格中工具和參數(shù)(Fig.44)。在多通道熒光圖像中，每個像素點都含有至少兩種熒光信號的灰度值信息(Ch1,Ch2)。進行熒光共定位分析，首先需要選擇感的熒光信號。在Horizontal下拉菜單自身，；只含有熒光信號Ch1的像素點，；示的所有點。然后，使用選擇工具，將感區(qū)域移動到只含有Ch2信號的區(qū)域。同點擊選擇工具右側(cè)的Delete按鈕，從圖像中刪除選中的感區(qū)域。會自動點擊控制界面下方的CutMask按鈕，可以將同時含有Ch1和Ch2信號的區(qū)域剪切至如果圖像中同時存在多個感區(qū)域，Coloc表格中將逐一列出所有感區(qū)域的用戶可以使用Crosshair，Table和image復(fù)選框，選擇是否在Coloc視圖中顯示散點一致，以保證像素點大小一致；第三，需要比較熒光共定位效果的各張，需要使Profile視

在Profile視圖中，可以測量圖像中某一直線或曲線上各點之間的灰度值變化(Fig.光灰度值變化，并將具體數(shù)據(jù)列入表格中。在表格上點擊右鍵，選擇SaveTable選項，可以將表格中的數(shù)據(jù)保存為*.txt文件；也可以選擇Copytable選項，將表格中的數(shù)據(jù)直Profile視圖下方設(shè)有Profile視圖控制界面，其中列出了Profile視圖的設(shè)置工具 Fig46Profile視圖控制界Info視在I圖像分辨率，e大小，物鏡種類，掃描速度，m值，Gan值，et值，激光波長和強度，主分光片和發(fā)射光的波長范圍等Fg.。請注意，這些信息在將該直接保存為其他格式的后將被刪除。4.4.圖像掃

常見的圖像掃描方式包括三維重構(gòu)(ZStack)、時間序列(Timeseries)、區(qū)域掃描在拍攝工具選擇界面中勾選所需的拍攝方式，左側(cè)中會出現(xiàn)相應(yīng)的設(shè)置工具欄，可用以設(shè)置相關(guān)實驗的掃描參數(shù)。可以同時選擇一種或多種拍攝方式(Fig.49)。 Z-stack

Fig49圖像拍攝工具的選Z-stack掃描可以逐層拍攝在Z軸方向上的一系列樣品，用于分析樣品的三維結(jié)依前述方法，通過SmartSetup框設(shè)置在拍攝工具選擇界面中勾選Z-stack功能。會在MultidimensionalAcquisition工具組下增加Z-Stack。點擊Z-Stack的的OptimizeSectioningandStep標(biāo)題左側(cè)的三角形按鈕，打開控制區(qū)域，點擊Optimal按鈕，然后點擊MatchPinhole按鈕，將自按鈕只在多通道熒光圖像時激活。如果拍Fig50Z-stack在Channels中選擇一個包含感熒光通道的track進行預(yù)覽。調(diào)節(jié)Gain值，擊Set按鈕，記錄此Z軸位置。向反方向調(diào)節(jié)焦平面，移動至結(jié)構(gòu)結(jié)束的位置，點擊SetLast按鈕，此焦平面的Z軸位置。出需要掃描的圖像數(shù)量(Slice)。對于多通道熒光圖像，此設(shè)置在OptimizeSectioningand在確定結(jié)構(gòu)的起止位置后，也可在Slices輸入框中手動輸入所需的數(shù)值，會根據(jù)用戶定義的Z軸距離，自動計算出步進(Interval)；反之，輸入Interval數(shù)值，可自動計算出Slice數(shù)量。通常自定義的Interval值不會小于計算所得最優(yōu)步進，即Optimal 軸結(jié)束平面，并拍攝。確認起止位置無誤后，點擊拍攝工具選擇界面中的Start實驗開始后，StartExperiment按鈕會變成Stop按鈕，點擊Stop按鈕可以立刻終止實驗；點擊Stop按鈕下的FinishCurrentStep按鈕，會在完成當(dāng)前層面的掃描后結(jié)束實Fig51Fig51Time依前述方法，選擇感的焦平在拍攝工具選擇界面中勾選TimeSeries功能。會在MultidimensionalAcquisition工具組下增加TimeSeries(Fig.51)。定的時間間隔短于AcquisitionMode中Speed下的Scantime，將在完成一張圖確認勾選Channels中所有Track。點擊拍攝工具選擇界面中的Start實驗開始后，StartExperiment按鈕會變成Stop按鈕，點擊Stop按鈕可以立刻終止實光漂白實驗光漂白實驗主要用于觀察靶分子在細胞內(nèi)或細胞間的運動或，如熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)，光控蛋白的激活，及熒光能量轉(zhuǎn)移等。依前述方法，選擇感的焦平面，設(shè)置各track的激光強度，Pinhole大小，Gain值及掃描速度、FrameSize、Average等參數(shù)。在拍攝工具選擇界面中勾選Bleaching功能。會同時自動選擇Region和Timeseries功能。Region位于AcquisitionParameter工具組下，Bleaching位于MultidimensionalAcquisition工具組下(Fig.52)。Fig52Bleaching,RegionTimeSeries。會自動賦予各感區(qū)域不拖拽拐點，可改變感區(qū)域的大(Fig.53)。選中某一區(qū)域后，點擊Region中的Delete按鈕，可。

Fig53畫有兩個區(qū)域的模擬預(yù)覽圖像。其中，紅區(qū)域進行的處理，包括拍攝 可任意組合。如果各區(qū)域均不勾選Acquisition，將默認掃描整幅圖像。勾選FitFramesizetoboundingrectangleofregions復(fù)選框，將自動調(diào)節(jié)掃描區(qū)域以適應(yīng)感區(qū)域的大小。否則，默認掃描整幅圖像，但只在感區(qū)域內(nèi)打開激中含多個感區(qū)域，將調(diào)節(jié)掃描區(qū)域至恰好包含所有感區(qū)域。RepeatBleachafterscans：在輸入框中輸入二次漂白間間隔的圖像張數(shù)。如果在StopwhenIntensitydropsto：勾選RepeatBleachafter#scans復(fù)選框后，會彈出StopwhenIntensitydropsto的選擇。在此處可以設(shè)定需要停止漂白時樣品灰度值Differentscanspeed：選中此選項，可以在輸入框中輸入漂白時所用的掃描速度；否則，默認使用AcquisitionMode中設(shè)置的掃描速度進行漂白。在漂白DifferentZposition：選擇點擊此選項后的MarkZ按勾選ZoomBleach Fig54ExcitationofBleach設(shè)置界如果有多個區(qū)域需要漂白，會激活UsedifferentsettingfordifferentRIOs選項。勾選此選項，ExcitationofBleach控制區(qū)域下會出現(xiàn)不同的ROI頁面，用戶可以在其中為不同的感光漂白參數(shù)可以在Bleaching最上方的BleachSetting控制區(qū)域中保存并調(diào)用。點擊按鈕，在彈出的框中輸入名稱，點擊OK完成保存。點擊按鈕，在下拉確認勾選Channels中所有Track。點擊圖像中的StartExperiment按實驗開始后，StartExperiment按鈕會變成Stop按鈕，點擊Stop按鈕可以立刻終止實圖像拼接及掃描速度、FrameSize、Average等FigFig55Tile在拍攝工具選擇界面中勾選TileScan功能。會MultidimensionalAcquisition工具組下增加TileScan(Fig.55)。選擇感Track進行預(yù)覽，并將視野移動至感區(qū)域的中心。打開TileScan工具在Channels中選擇所有需要掃描的track，點擊拍攝工具選擇界面中的StartExperiment按鈕，開始實驗。會自動以當(dāng)前視野為中心，掃描以定義視野數(shù)為多視野掃描及掃描速度、FrameSize、Average等參數(shù)。在拍攝工具選擇界面中勾選Positions功能，會在MultidimensionalAcquisition工具組下增加Positions，可在此中設(shè)置多視野掃描的參數(shù)。Position提供兩種掃描方式：PositionList和SampleCarrier。PositionList通常用于任意視野的設(shè)置；SampleCarrier則于多孔培養(yǎng)板上的多視野掃描。PositionList在Position中選PositionList模式(Fig56)Fig56PositionList通過預(yù)覽圖像尋找感的視表下的Add按鈕，當(dāng)前視Fig56PositionList在Channels中選擇所需要掃描的track，點擊拍攝工具選擇界面中的StartExperiment按鈕，開始實驗。會按照順序逐一掃描PositionList中的視野。按鈕即可將其刪除。點擊RemoveAll按鈕，可以刪除列表中的全部視野。點擊MovetoSampleCarrier模掃描(Fig.57)。行間距(RowsDistance)，列數(shù)(ColumnsNumber)和列間距(ColumnsDistance)。使用SampleCarrier模式對多孔培在SampleCarrier界面中的孔板模式圖，，

Fig57 擊選中的孔，則在記錄中刪除此孔。點擊Selectall按鈕， 點擊Clearall按鈕，將清除所有選中的視野。在Channels中選擇所有需要掃描的track，點擊拍攝工具選擇界面中的StartExperiment按鈕，開始實驗。會按照從左到右，從上到下的順序逐一掃描選多孔培養(yǎng)板的設(shè)置參數(shù)可以在中保存。點擊Properties按鈕右側(cè)的按鈕，在彈出的框中輸入名稱，點擊OK完成保存。點擊按鈕，在下拉菜單中選擇所圖像相關(guān)的常用視圖地觀察分析圖像，ZEN2011在二維圖像視圖的基礎(chǔ)上增加了一系列視圖，用于 2D視由于在2D視圖中每次只能顯示一張二維圖像，在顯示圖像時，在Dimension視圖控制界面的最上方增加了滾動條(Fig.58)。用鼠標(biāo)拖動滾動條就可以逐一觀察多的圖像，將自動移動至指定的圖像。點擊輸入框右側(cè)的鍵，可以在2D視圖中自動逐一展示所有位置或時間點的圖像。再次點擊鍵，即還特別增設(shè)了Player視圖控制界面，用于逐幀圖像(Fig.59)Player視圖控制界面最上方的按鈕中，ZEN2011提供了前進后退停止，移動到第一張

FigFig58 如果圖像中同時包含Z-stack和時間序列，控制界面中會列出各自的起止位置滾動條供用戶設(shè)置。用戶可通過滾動條左側(cè)的復(fù)選框，選擇只Z-stack圖像或只播放時間序列圖像。如果同時勾選Z-stack和Time，會按照時間點的先后順序，逐一Gallery視在Gallery視圖中，可以同時顯示圖像在圖像上加注信息(Fig.

Fig60Gallery如果圖像中同時包含Z-stack和時間序列等多種掃描方式，在Gallery視圖下方的Gallery視圖控制界面中，ZEN2011提供了顯示設(shè)置按鈕，可以選擇與掃描方式名稱時間序列和多視野掃描的圖像來講，在Gallery視圖控制界面中選擇Z-stack按鈕，Gallery視圖中將顯示某一時間點，某一視野所拍攝的一組Z-stack圖像；而選擇Z-stack-position按鈕，Gallery視圖中顯示某一時間點，在所有視野上拍攝的全部Z-stack圖像下顯示注釋信息；Transparent為在圖像中顯示注釋信息。選擇TransparentOrtho視

Fig61GalleryOrtho視圖是專門為Z-stack(Fig62)。在此視圖中，Z-stack圖Fig63OrthoFig63Ortho切面位置的移動，還可以通過Ortho視圖控制界面中的各軸向滾動條來完成(Fig.63)。拖動Xposition滾動條，即可觀察YZ切面圖像隨X軸變化而發(fā)生的改變。也可在滾動條后的輸入框中直接輸入數(shù)字，來設(shè)定感的觀察位置?；螯c擊Mid按鈕，將YZ在Ortho視圖中，還提供了簡單的三維測量工具。首先，勾選3Ddistance復(fù)選框，3D視

3D視圖是最常用于觀察和分析Z-stack圖像的視圖(Fig.64)。其中提供了多種三維在視圖下方的邊框上，也有兩個滾動條。拖動左側(cè)的滾動條，可以使圖像繞Y時針旋轉(zhuǎn)，向右為順時針旋轉(zhuǎn)。點擊按鈕，會在3D圖像周圍顯示白色邊框。點擊按鈕，會用不同的顏色標(biāo)記XYZ方向的圖像邊框。點擊按鈕，會顯示帶刻度的XYZ坐標(biāo)。點擊，圖像會自動回復(fù)初始顯示狀態(tài)。點擊后，用鼠標(biāo)拖Fig643DDAeaae3D視圖控制界面中提供了三維重構(gòu)模式的選擇按鈕。在確定三維重構(gòu)模式后，了將旋轉(zhuǎn)觀察3D圖像的過程輸出為的設(shè)置。3D視圖控制界面在3D視圖控制界面中，ZEN2011提供了四種不同的三維重構(gòu)模式(Fig.65)。即Shadow，Transparency，um和Surface。在三維重，會變得粗糙。選擇好感，

Fig653D 的觀察角度，點擊Createimage按鈕， Shadow模式是一種利用投影來襯托圖像感的三維重構(gòu)方式(Fig.66)。在這種襯托圖像的感。這是唯一一種不能旋轉(zhuǎn)觀察的三維重構(gòu)模式，因而，圖像窗口邊ae模式下，會使用比較有顆粒感的渲染方法來重構(gòu)樣本的表面結(jié)構(gòu)，使圖像看起來更有質(zhì)感，對樣品的表面結(jié)構(gòu)有較好的強調(diào)作用i.)。由于上述兩種構(gòu)關(guān)系(Fig.66)。而 下的3D圖像有較好的對比度(Fig.66)。這兩種方法常用于生物樣品的三維重構(gòu)。Appearance視圖控制界面Appearance視圖控制界面ZEN2011提供了不同的調(diào)節(jié)參數(shù)(Fig.67)。常用的參數(shù)包括以Transparency界面可以定義 Fig67Appearance控制界 化速度。Ramp值越小，色彩過渡越快；反之，色彩過渡則會變得細膩。ZEN2011將這 設(shè)置可能使圖像失真。對于Surface模式，則可以通過Ambient，Specular和Shininess滾Series視圖控制界面在Series視圖控制界面的Renderseries下拉菜單中，提供了三種旋轉(zhuǎn)圖像的方式，分別為繞X軸旋轉(zhuǎn)(TurnaroundX)，繞Y軸旋轉(zhuǎn)(TurnaroundY)和自定義起止位置(Start當(dāng)選擇TurnaroundX或Y旋轉(zhuǎn)模式時，默認為旋轉(zhuǎn)重構(gòu)圖像180°(Fig.68)。在Totalframes輸入框下方的Differenceangle輸入框中輸入旋轉(zhuǎn)圖像的角度步進，在 以Differentangle角度為步進，旋轉(zhuǎn)Totalframe次所覆蓋的區(qū)域。如果點擊Panorama按鈕，將保持Totalframes不變，自動在360°范圍內(nèi)平均分布各幀圖像。Fig68SeriesFig69StartandendSeries當(dāng)選擇Startandend模式時，會在Totalframes下方顯示定義起止位置的XYZ滾動條和定義圖像顯示比例的Distance滾動條(Fig.69)。在確認Totalframes數(shù)值后，在Start界面中，調(diào)節(jié)XYZ和Distance滾動條Fig68SeriesFig69StartandendSeries，。后，點擊此按鈕預(yù)覽動畫，的設(shè)定做進一步的修改。在可點擊此按鈕停止預(yù)覽，。生成一個帶有renderseries后轉(zhuǎn)3D圖像的每一幀，將此文件輸出為*.avi文件，即可用常 正。Series界面中的設(shè)置。點擊MeanROI信息的圖像，ZEN2011會顯示MeanROI視圖，用以分析感區(qū)域內(nèi)的平均熒光灰度值或面積隨時間變化的趨勢(Fig.70)。在MeanROI視圖中，不僅會顯示感區(qū)積數(shù)據(jù)。在表格上點擊右鍵，選擇SaveTable選項，可以將表格中的數(shù)據(jù)保存為*.txt文件；也可以選擇Copytable選項，將表格中的數(shù)據(jù)直接拷貝至Excel表格當(dāng)中。Fig70MeanROI用戶可以在MeanROI視圖控制界面最上排的形狀工具中，選擇適當(dāng)?shù)男螤睿缇匦?，圓形，多邊形等，在圖像中選擇感的區(qū)域(Fig.71)。此時，在MeanROI視圖 位置；也可用鼠標(biāo)拖曳感區(qū)域的拐點位置，改變其大小。點擊選擇工具右側(cè)的可以分別設(shè)定感區(qū)域邊框的線條粗細和顏色。在Mode下拉菜單中選擇Mean選項，在MeanROI視圖中顯示灰度時間曲線。選擇Area選項，則顯示符合設(shè)定灰度閾值的感區(qū)域的面積隨時間變化的曲線。表格中數(shù)據(jù)也相應(yīng)變?yōu)槊娣e變化數(shù)據(jù)。灰度閾值可使用MeanROI視圖控制界面下方的Lower和Upper滾動條設(shè)置(Fig.72)。。Fig71MeanROIFArea模式的MeanROI項，在MeanROI視圖控制界面下方下拉菜單中選擇感的熒光通道灰度閾值下限，會自動在圖像灰度閾值上限，。Fig71MeanROIFArea模式的MeanROIMode下拉菜單下方的Diagramlinewidth下拉菜單中可以編輯灰度時間曲線或面積時間曲線的粗細；Diagramgraphstyle下拉菜單中可以選擇曲線的顯示模式，如彩色、下拉菜單選擇變化曲線中時間軸的單位；勾選TimeRange復(fù)選框，可以在輸入框中設(shè)定感的時間范圍，即可縮短時間軸，突出顯示感時間段內(nèi)的平均灰度變化。如果圖像中同時存在多個感區(qū)域，MeanROI視圖中將逐一列出所有感區(qū)光譜拆分發(fā)出的熒光強度信息，以獲得樣本發(fā)射光在可見光范圍內(nèi)的灰度分布曲線，即進行λstackFig73λstackλstack掃焦平面。在Acquisition主頁面的LightPath工具欄中選擇Lambdamode模式進行光路設(shè)置(Fig.列表中增加空白行或刪除列表最下方的。勾選名稱左側(cè)的Show復(fù)選框，則可在Dye在Lambdamode中，默認同時使Fig74LambdaFig74Lambda，。調(diào)節(jié)發(fā)射光譜下方滾動條的長度，可以調(diào)節(jié)SD分光的波長范圍。如果不確定樣品的發(fā)射波長范圍，可將滾動條盡量拉長，達Sat輸入框中顯示在輸入框中顯示。也可以直接在上述輸入框中分別輸入SD分光范圍的起止波長在Caels輸入框中可以直接輸入獲取光譜圖像的通道數(shù)。將根據(jù)指定的通道數(shù)，在分光范圍內(nèi)，均勻地選定SD分光的波長位置，該位置在示意圖中以白色豎線顯示。各通道信號間隔的帶寬則在Cth框中顯示。如果勾選FxeSltsti復(fù)選框，在可以在示意圖中靈活移動SD分光的波長位置。例如，可以在熒光物質(zhì)的發(fā)射峰值附近設(shè)置較多的分光位置。此時，C.t框變?yōu)镃etSptCuetSpt輸入框中直Caels所得λ，。

Fig75Lambda光路設(shè)置完成后，則可依前所述，在AcquisitionParameter工具組下的Channels工具欄和AcquisitionMode中完成掃描參數(shù)的設(shè)置(Fig.75)。由于光譜拆分是依據(jù)圖像根據(jù)RangeIndicator設(shè)置適當(dāng)?shù)膾呙鑵?shù)，使圖像中沒有達到飽和灰度值的點。光譜拆分打開λstack圖像或任意多通道熒光圖像時，在圖像顯示區(qū)域會出現(xiàn)Unmixing視圖窗在每張λstack圖像上的實際灰度數(shù)值。如需保存灰度數(shù)據(jù)，可在表格上點擊右鍵，選擇光譜拆分的參數(shù)設(shè)置位于Unmixing視圖下方的Unmixing視圖控制界面中(Fig77)自動拆分打開λstack圖像或任意多通道熒光圖像，在Unmixing視圖下的Unmixing視圖控制界面中點擊Auto(Fig.78)。會在。的光譜曲線及其在每張λ在Unmixing視圖控制界面的Dye列表中會出現(xiàn)代表各熒。

Fig77UnmixingFig78自動拆 點擊Savetospectradatabase按鈕，打開保存光譜曲線框，可以將從圖像中拆分出的發(fā)射光譜曲線逐一保存在光譜數(shù)據(jù)庫中(Fig.79)。首先，在框左側(cè)的列表中選擇某一待保存的熒光物質(zhì)發(fā)射譜線。然后，在框中間的保存路徑欄中指定保Save按鈕即完成保存。點擊Newfolder按鈕旁邊的Rename，Delete，Cut，Copy和Paste操作。保存各熒光物質(zhì)發(fā)射譜線后，點擊Close按鈕關(guān)閉框。保存的光譜曲線可以光物質(zhì)的發(fā)射光譜有比較大的，在自動拆分時很難識別各熒光物質(zhì)發(fā)射譜線手動拆分打開λstack圖像或任意多通道熒光圖像，在Unmixing視圖下選擇Unmixing制界面中的選擇工具，點擊圖像中某一熒光物質(zhì)單獨表達的區(qū)域，圖像中會出現(xiàn)彩物質(zhì)的Region1，并自動賦予該熒光物質(zhì)偽彩；可以在Color列表中點擊黑色三角形按含熒光物質(zhì)的發(fā)射譜線和相應(yīng)的灰度值。可在圖像中移動線，選擇發(fā)射譜線峰形根據(jù)拆分結(jié)果生成新的熒光圖像。在新的圖像中，會根據(jù)Unmixing視圖控制界面點擊Savetospectradatabase按鈕，打開保存光譜曲線框，同樣可以將從原始有相同熒光物質(zhì)的其他圖像(Fig.79)。Fig79保存光譜曲線使用參考發(fā)射譜線進行拆如果事先存有相關(guān)熒光物質(zhì)的參考譜線，可根據(jù)參考譜線對λstack圖像或多通道打開λstack圖像或任意多通道熒光圖像，在Unmixing視圖下Unmixing視圖控制界中會出現(xiàn)該熒光物質(zhì)的發(fā)射譜線及其在每張λstack圖像中的灰度值。重復(fù)上述操作，直至將圖像中所含有的全部熒光物質(zhì)發(fā)射譜線均載入到Dye列表中。點擊LinearFig.80Fig.80線的準(zhǔn)確性。在樣品過程中， 視圖控制界面中的其他設(shè)置Table復(fù)選框：勾選后，可用列表顯示各熒光物質(zhì)在每張λstackBackgroundRegion下拉菜單：可在下拉菜單中選擇某一指定區(qū)域為背景，在完成工具頁 工具頁 應(yīng)用按 預(yù)覽窗完成光譜拆分時，會自動DisplayChannelwithResidual常用圖像處理工具ZEN2011在Processing

35Fig82Processing(Fig82)。與Locate和Acquisition主頁面不同，此主頁面在ZEN2011Lite中也可以使用。最大灰度投影如果需要將Z-stack圖像中的所有信息整合到一張圖像當(dāng)中，當(dāng)中(Fig.83)。在Processing主頁面的圖像處理工具列表中選擇 umintensity

Fig83動出現(xiàn)在Inputimage右側(cè)。點擊Outputimage下方的三角形按鈕，打開圖像處理參數(shù)設(shè)置界面，在Coordinate 點擊Apply按鈕，會完成灰度投影，并根據(jù)投影結(jié)果，生成一張新的圖像。彩色編碼投影上處于較淺位置的圖像(Fig.84)。動出現(xiàn)在Inputimage右側(cè)(Fig.85)。點擊Outputimage下方的三角形較Z軸方向上具有相同XY坐標(biāo)的 Fig85彩色編碼投影參數(shù)設(shè) 為投影范圍的起止位置。如點擊Auto按鈕，將默認選擇全部用于彩色編碼Fig84Z軸信息后所濾鏡功能中值濾鏡平滑以相鄰像素點的平均灰度值替換像素點的灰度值，從而銳化帶寬濾鏡漸變?yōu)V鏡FigFig86FilterType，，其文件名自動出現(xiàn)在Inputimage右側(cè)，，點擊Outputimage下方的三角形圖像修正ZEN2011提供了以下功能，用以修正中的維度等信息(ReverseZstack/圖像中的將按照逆序排列。(ModifyZ/time(Convertto(Modifyacquisition(Modifychannel具列表中選擇ModifySeries功能。，，其文件名自動出現(xiàn)在Inputimage右側(cè)(Fig.87)，，點擊Outputimage下方的三角形在ModifyMode下拉菜單中選擇點擊Apply按鈕，會完成濾鏡

Fig 圖像通道如果需要將某張圖像中的某一例如，如果要將圖像A中的Ch1驟操作(Fig.88)。在Processing主頁面圖像處理中的CopyChannel功能。，，點擊Inputimage右側(cè)的Select，，點擊Outputimage右側(cè)的Select意NewChannel后綴的圖像動

Fig88CopyChannelCopyChannelFig89CopyChannelCopyimage也可以用此功能，將多通道圖像中的某一通道圖像提取出來(Fig.89)在Processing主頁面圖像處理工具列表中選擇Copy下拉菜單中的CopyChannel功Channel下拉菜單中，選擇感的Ch1通道。點擊Outputimage右側(cè)的Select按鈕，在其下方的Channel下拉菜單中，選擇New圖像備份使用圖像備份功能，可以備份選中的圖像(Fig.90)自動出現(xiàn)在Inputimage右側(cè)。如果需要刪除圖像中的某些，可以使用刪除功能。此功能也可以刪除多通道熒光圖像中某些通道(Fig.91)。具列表中選擇Copy下拉菜單中的Deleteimage功能。在圖像選擇界面中點擊Select按點擊Outputimage下方的三角形click按鈕，在Gallery視圖中點擊刪除范圍的起始；再點擊End滾動條右側(cè)的MouseClick按鈕，在Gallery視圖中點擊刪除范圍的結(jié)束。將自動點擊的，作為刪除范圍的起止位置。選取與刪除功能相反，選取功能可以將圖像中的某些選取出來，形像中的某一部分(Fig.92)。列表中選擇Copy下拉菜單中的其文件名自動出現(xiàn)在Inputimage右點擊Outputimage下方的三角形按滾動條設(shè)置選取范圍的起止位步進。例如，Step為1時，將在指定起止范圍內(nèi)選取連續(xù)；Step

右側(cè)的MouseClick按鈕，在圖像上點擊選取區(qū)域X軸或Y軸方向的結(jié)束位置。Mouseclick按鈕，在Gallery視圖中，點擊選取范圍的起始；再點擊End滾動保存的亮度與對比對于*.czi圖像文件來說，通過調(diào)節(jié)灰度直方圖優(yōu)化圖像顯示后，仍然會保存圖像的原始灰度數(shù)據(jù)。在使用ZENBlack輸出原始圖像時，也會依照原始灰度輸出圖像，而在Processing主頁面的圖像處理工具列表中選擇Adjust下拉菜單中的BurninBrightnessand在圖像選擇界面中點擊Select在Inputimage右側(cè) Fig94ChannelShift圖像選擇及參數(shù)設(shè)置界改變，這些圖像不能用于任何與灰度有關(guān)的分析！(Fig.93)Fig93BurninBrightnessandContrast處理前后的圖像灰度直方圖，左圖為處理前圖像的灰度直方圖，右圖通道平移使其與其他通道能夠疊加形成正常的圖像(Fig.95)。在Processing主頁面的圖像處理工具列表中選擇Adjust下拉菜單中的Channelshift功動出現(xiàn)在Inputimage右側(cè)(Fig.94)。點擊Outputimage下方的三角形按鈕，打開圖像處理參數(shù)設(shè)置界面。在界面下方，設(shè)置好X和Y的移動距離后，點擊Apply按鈕，會根據(jù)設(shè)置生成一張新的圖像圖像的瀏覽、保存與輸出圖像的保存，圖像掃描完成后，不僅會顯示在界面的圖像顯示區(qū)域，在右側(cè)中，也會生成一個新 ，并以圖形標(biāo)記 的右下角，提示此圖像尚未保存。，

標(biāo)記代表多通道熒光圖 點擊 中的按鈕，可以保存當(dāng)前圖像窗口中打開的圖像。在右中選中該圖像成高亮狀態(tài)，點擊右側(cè)左下角的按鈕，也可將圖像保存為默認的CZI格式(Fig.96)。點擊右 中選中的圖像圖像的瀏覽

Fig96點擊File菜單中的Newfilebrowser功能，ZEN2011會打開ZEN文件瀏覽器(Fig.97)。在瀏覽器的左側(cè)，顯示了文件的路徑，而右側(cè)則可顯示指定文件夾中的圖像文件。拍攝時間，掃描方式等信息。ZEN2011默認使用Gallery模式顯示圖像。CCyPaste和Delete按鈕，用于剪切，，粘貼和刪除圖像。ZEN2011默認使用1Container，即在圖像顯示區(qū)域只顯示一幅圖像。如果需要比較2Container，界面中間的圖像顯示區(qū)域?qū)⒖梢酝瑫r容納2個圖像窗口，用鼠標(biāo)將待比較圖像上方的名稱拖入新增圖像窗口中，即可并排顯示兩幅圖像(Fig.98)。同樣的，選擇3Container可以同時顯示3幅圖像。圖像的輸出ZEN2011BlackVersion)圖像輸點擊菜單欄中File菜單下的Export選項，打開Export框(Fig.99)在Format下拉菜單中選擇所需的格式，如TIF,JPEG等。如需輸出為文件，則選擇forWindows格式。在Data下拉菜單中選擇源文件格式(Fig.100)。通常會選擇Rawdata，即原始數(shù)據(jù)應(yīng)的熒光通道，即可輸出一張彩像。選擇Palettee-image選項，則可選擇多通道熒三個通道，因而如果多通道熒光圖像中含有3個以上的熒光通道，就需要選擇Fullresolutionimagewindow格式。如果需要將中的比例尺等項一同輸出，也需要選擇Fullresolutionimagewindow格式。文件格式，即可將原始文件中的每一張單獨輸出成獨立的圖像文件(Fig.100)。例如，輸出Z-Stack文件時選擇Rawdata-Series格式，會將每一個Z軸層面的都單，需要輸出文件，同樣應(yīng)當(dāng)選擇張，可在2D視圖中打開待輸出的圖，ofimagewindow格式輸出。，點擊Selectfilenameandsave…在彈出的框中選擇保存輸出圖像的文件夾和文件名，即可將*.czi文件輸出成常見格式。，ZEN2011BlueVersion)圖

Fig99 Fig100對于多通道熒光圖像來講，ZENBlackVersion無法同時輸出 像，為此，此處簡單介紹BlueVersion的輸出功能，作為補充。雙擊桌面上的圖標(biāo)ZEN2011(Blueversion)，啟 ，系統(tǒng)彈 啟動由于ZEN2011(BlueVersion)不能控制掃描元件成像，因而只能用于共聚焦掃描的Fig101ZEN2011Blueversion)單張圖像文件的輸出打開ZEN2011(BlueVersion)，進入Processing主頁面，在Method中選Fig102ZEN2011BlueVersionProcessing主頁面Fig102ZEN2011BlueVersionProcessing主頁面Paaees含圖像出所需的相關(guān)參數(shù)i.)上角的wN01leesi)在iletye下拉菜JP，，M，P和DP五種常見圖像格式供用戶選擇。iltye拉菜單下的Qaity滾動條用于設(shè)置輸出g會自動增加Convertto8bit復(fù)選框。勾選此復(fù)選框，可以在輸出圖像時將。。ZEN2011默認使用原始圖右側(cè)的輸入框中直接輸入輸出分辨率相對于原始分辨率的比

Fig103，ZEN2011默認勾選ApplyDisplayCurveandChannelColor顏色和圖像對比度輸出。勾選Burn-inGraphics復(fù)選框，上的比例尺等項即可與，比例尺等項將被刪除如果用戶選擇輸出原始圖OriginalData復(fù)選框。注意，由于共聚焦掃描所得圖像均為黑

如果待輸出圖像為多通道圖像，會自動在Burn-inGraphics復(fù)選框下增加MergedChannelsImage和IndividualChannelImages復(fù)選框。勾選前者，直接輸出多在Exportto輸入框中，用戶可以自定義保存輸出圖像的文件夾，也可以點擊輸入框右側(cè)的按鈕，打開瀏覽文件夾框，在文件夾路徑列表中選擇輸出文件夾，立單獨的輸出文件夾，保存輸出圖像。勾選Generatexmlfile復(fù)選框，可以將共聚焦掃Generatezipfile復(fù)選框，則會生成一個壓縮文件夾，其中包含輸出圖像和含有原始文件信息的Excel文件。ZEN2011默認使用原始文件名來命名輸出圖像。用戶也可以對比度輸出，包含所有項，只輸出多通道疊加圖像，以原始文件名命名，輸出文件夾位于庫中。對于圖像來講，如果選擇輸出某一部分，則需選擇使用DefineSubset功能(Fig.105)。此時，會自動增加各維度的下拉菜單，可以在其中指定需要輸出。，F(xiàn)ig對于Z-Position，Time和Scene下ExtractSingle選項用于輸出某一張圖片，用戶可以使用滾動條來選擇也可以直接在滾動條右側(cè)的輸入框中輸入 進行定義?；螯c擊，F(xiàn)ig像窗口中打開的。Extract張輸出時相同。ExtractMultiple選項用于輸出指定維度中某些不連續(xù)的，用戶可以在輸入框中輸入 的第1，3，7張；如果需要輸出 7；如果導(dǎo)入二維多通道熒光圖像，還將出現(xiàn)Region下拉菜單。默認選擇Full，即輸出整幅圖像。如果選擇Rectangleregion選項，可輸打開ZEN2011(BlueVersion)，進入Processing主頁面，在Method中選擇Export/Import下拉菜單中的MoiveExport功能，完成輸出(Fig.106)。ZEN2011默認加載當(dāng)前圖像窗口顯示的以打開Input，點擊縮略圖右下角的白的圖像中選擇感的圖像進行輸出(Fig.。Fig106ZEN2011(BlueVersion)Processing主頁面MethodParameters包含了圖像輸出所需的相關(guān)參數(shù)(Fig.107)。勾選 Showall復(fù)選框，顯示全部設(shè)置參數(shù)。ZEN2011(BlueVersion)在Mode下拉菜單中提供了AVI和WMF二種常見格式供用戶選擇頻文件的分辨率。默認使用原始文件的。Fig106ZEN2011(BlueVersion)Processing主頁面Method下將出現(xiàn)Quality滾動條，用于設(shè)置輸出端，即選擇輸出高質(zhì)量圖像。默認設(shè)置為90。最大值為100，即按照原始信息輸出ZEN2011默認勾選Burn-inGraphics復(fù)選框，上的比例尺等項即可與圖片整合在一起進行輸出；否則，將只輸出，而上的比例尺等項將被刪如果待輸出圖像為多通道圖像，會自動在Burn-inGraphics復(fù)選框下增通道疊加；勾選后者，則將每一個通道分別輸出為獨立的文件。此時，通常只勾選MergedChannelsImage選項。例如，在Fig.107中，輸出將按順序每一視野的時間序列文件，在每一個時間點上，將Z-sta