黃芩苷的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

黃芩苷的提取別離及結(jié)構(gòu)鑒定概論黃芩及其有效成分黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性,除了傳統(tǒng)意義上的抗炎、抗變態(tài)、抗病毒等生物活性之外,近年來對其抗氧化、抗腫瘤和抗HIV21病毒的研究日趨深入,開發(fā)黃芩及其活性成分作為抗血栓、降血壓、治療冠心病和糖尿病以及防治腫瘤和艾滋病藥物的前景十分廣闊。目前，國內(nèi)對黃芩苷提取工藝有較多報道，其提取方法主要有溫浸法、煎煮法、微波法、超濾法，超聲法等，但如何提高黃芩苷收率和純度一直是實際生產(chǎn)中存在的問題，缺乏對整個工藝條件進行全面研究，因此，有必要對影響黃芩苷提取工藝及其影響因素作一全面探討。本實驗擬對水提酸沉法進行探討，研究黃芩苷的提取工藝，并對其穩(wěn)定性進行考察，旨在為生產(chǎn)實踐中大規(guī)模提取生產(chǎn)黃芩苷提供理論根底。一、文獻綜述1.1黃芩〔ScutellariabaicalensisGeorgi〕基源：唇形科植物黃芩的枯燥根。產(chǎn)地：產(chǎn)于河北、遼寧、陜西、山西、山東、內(nèi)蒙古、黑龍江等。功能主治：味苦、性寒，能清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎。主治溫熱病、上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎動不安、高血壓、癰腫癤瘡等癥?；瘜W成分:含多種黃酮類化合物,主要為黃芩苷,黃芩素,漢黃芩苷,漢黃芩素,黃芩新素Ⅰ,Ⅱ,去甲漢黃芩素,7-甲氧基黃芩素,7-甲氧基去甲基漢黃芩素,等.此外還有揮發(fā)油,苯乙醇糖苷類成分等.其成分含量與根的新老及不同炮制方法有關(guān)。臨床應用：呼吸道感染、急性扁桃體炎、急性咽炎、肺炎及痢疾等病。1.2黃芩苷〔Baicalin〕圖一黃芩苷分子式分子式：C21H18O11分子量：446.37熔點：223-225℃理化性質(zhì)：本品為淡黃色結(jié)晶粉末,易溶于N,N-二甲基甲酰胺、吡啶。微溶于熱水、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉。難溶于甲酸、乙酸、丙酮，幾乎不溶于水、乙醚、苯、氯仿等。在植物中以鹽的形式存在，含量約4.0%～5.2%黃芩苷為淡黃色晶體，熔點223℃，不溶于水，難溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于熱醋酸，易溶于二甲基甲酰胺、吡啶等堿性溶液。黃芩苷在一定溫度和濕度下能酶水解成黃芩素及葡萄糖醛酸。黃芩素分子中具有臨三酚羥基，性質(zhì)不穩(wěn)定，在空氣中易氧化成醌式結(jié)構(gòu)顯綠色。所以在儲藏、加工炮制及提取過程中應注意防止黃芩苷的酶解、氧化，以減少有效成分的破壞。

藥理作用：具有顯著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)及解痙作用，并且具有較強的抗癌反響等生理效能。功能主治：瀉實火，除濕熱，止血，安胎。治壯熱煩渴，肺熱咳嗽，濕熱瀉痢，黃疸，熱淋，吐、衄、崩、漏，目赤腫痛，胎動不安，癰腫疔瘡。近年來,國內(nèi)外學者對其進行了大量的研究,且到達了較高的水平。現(xiàn)就近幾年來有關(guān)黃芩化學成分及藥理活性的研究進展做一簡要綜述。二、實驗2.1提取2.1.1實驗目的掌握從黃芩中提取、精制黃芩苷的原理、方法及操作要點。掌握黃芩苷的結(jié)構(gòu)鑒定原理及方法。為深入研究黃酮類化合物提取純化提供參考，并為生產(chǎn)實踐中大規(guī)模提取生產(chǎn)黃芩苷提供理論根底。2.1.2實驗原理：黃芩苷分子中連葡萄糖醛酸，有多個酚羥基、羧基，顯酸性，在植物中常以鎂鹽的形式存在，故能溶于水。但藥材內(nèi)含有水解酶，當其與冷水后發(fā)生水解而使黃芩苷質(zhì)量濃度下降，而水解酶在高溫下被破壞失活，故用沸水法提取。黃芩苷在熱水中溶解度大，在強酸性條件下易析出沉淀，利用此性質(zhì)，從黃芩中提取粗品黃芩苷。黃芩苷和黃芩素在95％乙醇中溶解度不同，可據(jù)此別離二者。2.1.3實驗試劑及儀器〔1〕儀器電子天平、1000mL三口圓底燒瓶、球形冷凝柱、溫度計、鐵架臺、鐵夾、雙擰絲、布氏漏斗、抽濾瓶、玻璃棒、250mL/500mL/1000mL/5000mL燒杯各一、250mL/500mL錐形瓶各一、500mL三角具塞瓶，10mL/100mL量筒各一、滴管、PH試紙、濾紙、硅膠CMC-Na薄層板、展開缸〔2〕藥品

黃芩飲片200g、鎂粉、鋅粉、活性炭、5%二氧化鋯、2%三氯化鋁、35%鹽酸、40%氫氧化鈉、95%乙醇、2%枸櫞酸試劑、冰醋酸、苯、甲酸乙酯、甲酸、正丁醇1%三氯化鋁、三氯化鐵乙醇試劑、1%黃芩標準品、95%乙醇〔3〕設備粉碎機、電熱套、循環(huán)水抽濾泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外分光光度計2.1.4別離方法創(chuàng)新之處黃芩苷是極細的微粒，致抽濾過程中速度很慢，濾液難以流下。在抽濾之前，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮液體，大大提升抽濾效率。同時液體過多導致黃芩苷難以沉淀，濃縮液體后，使少量溶于液體的黃芩苷析出，提高產(chǎn)率。2.1.5自創(chuàng)實驗條件由于回流裝置數(shù)量不能滿足需求，我們使用水煎方法代替第一次回流。電磁爐和不銹鋼盆很好地解決了問題，但是因其開口較大，水分蒸發(fā)較快，在煎煮過程中需不斷補充水分以保持水量的恒定。2.1.6實驗操作方法及流程操作方法①黃芩苷的提取取黃芩飲片200g，粉碎。加8倍量水，回流1h，用多層紗布過濾。藥渣再用6倍及4倍量的水同法分別回流1h。合并三次濾液，濾液濃縮至適量，加35%鹽酸調(diào)PH至1~2，80℃水域保溫30min，靜置，抽濾。②黃芩苷的精制沉淀用少量50％、95％乙醇依次洗滌，抽干，濾餅經(jīng)40℃枯燥，粉碎成細粉，即得到精制黃芩苷。計算得率。用于片劑的原料。流程圖二流程圖2.2產(chǎn)物鑒定2.2.1定性鑒別〔1〕鹽酸-鎂粉反響：取黃芩苷少許置于試管中，以乙醇1ml水域微溫振搖溶解，加鎂粉適量，滴加濃鹽酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。

〔2〕鋯-枸櫞酸反響：取黃芩苷少許置于試管中，加水2ml置水浴上溫熱至溶解，加數(shù)滴5%二氧化鋯溶液，振蕩后，觀察現(xiàn)象。再加2%枸櫞酸試劑，觀察現(xiàn)象。

〔3〕三氧化鋁反響：取黃芩苷少許置于試管中，加水2ml置水浴上溫熱至溶解，參加2%三氧化鋁甲醇溶液數(shù)滴，溶液產(chǎn)生鮮黃色，在紫外光下觀察。

2.2.2純度檢驗〔1〕測熔點用數(shù)字熔點儀分別測定黃芩苷粗品和各步精制所得產(chǎn)品的熔點，記錄結(jié)果薄層色譜法

吸附劑：硅膠G薄層板

樣品：自制黃芩苷乙醇溶液

對照品：標準黃芩苷乙醇溶液

展開劑：乙酸乙酯:甲酸:甲醇:水〔7:2:0.5:0.5〕顯色劑：1%三氯化鐵-乙醇溶液方法：點樣，在展開劑中展開，吹干，噴顯色劑，即顯色。2.2.3結(jié)構(gòu)鑒定紫外光譜法樣品在紫外條件下得到的紫外光譜圖與黃芩苷的標準光譜圖進行比照。三、結(jié)果與分析3.1結(jié)果3.1.1產(chǎn)率黃芩苷提取率＝[精制黃芩苷〔g〕/黃芩粗粉(g)]%實驗的黃芩苷共計：0.47g黃芩粗粉：100.0g提取率：0.47%3.1.2定性反響〔1〕鹽酸-鎂粉反響：取黃芩苷少許置于試管中，以乙醇1ml水域微溫振搖溶解，加鎂粉適量，滴加濃鹽酸數(shù)滴，溶液產(chǎn)生櫻紅色。

〔2〕鋯-枸櫞酸反響：取黃芩苷少許置于試管中，加水2ml置水浴上溫熱至溶解，加數(shù)滴5%二氧化鋯溶液，振蕩后，顯黃色并有黃綠色熒光。再加2%枸櫞酸試劑，黃色和熒光褪去。

〔3〕三氧化鋁反響：取黃芩苷少許置于試管中，加水2ml置水浴上溫熱至溶解，參加2%三氧化鋁甲醇溶液數(shù)滴，溶液產(chǎn)生鮮黃色，在紫外光下顯黃綠色熒光。3.1.3薄層色譜利用薄層色譜法鑒定實驗所得產(chǎn)品的純度如下列圖圖三薄層色譜〔左邊的點為產(chǎn)品，右為標準品〕3.1.4紫外圖譜利用紫外光譜儀測得的紫外數(shù)據(jù)及圖譜如下圖四紫外圖譜〔一〕圖五紫外圖譜〔二〕圖六黃芩苷紫外標準圖譜3.2結(jié)果分析由產(chǎn)量和產(chǎn)率知，我們所得的黃芩苷產(chǎn)率偏低，可能由于粗粉未浸泡，PH調(diào)節(jié)不適宜，也可能是由于在提取別離的過程中，我們屢次過濾，使許多產(chǎn)物粘在漏斗和濾紙上，造成損失。由所薄層顯示的顏色及紫外最大吸收波長可知，我們組所得的黃芩苷純品的純度較高，因為黃芩苷易溶于熱水難溶于酸很適合于水提酸沉這種提取方法，同時在操作過程中我們也注意使其免受其他試劑的污染，在精制時，使用易揮發(fā)的無水乙醇，使得其純度較高。四、結(jié)論4.1黃芩苷在一定溫度和濕度下能酶水解成黃芩素及葡萄糖醛酸。黃芩素分子中具有臨三酚羥基，性質(zhì)不穩(wěn)定，在空氣中易氧化成醌式結(jié)構(gòu)顯綠色。所以在儲藏及提取過程中應注意防止黃芩苷的酶解、氧化以減少有效成分的破壞。4.2黃芩苷為葡萄糖醛酸苷,具有弱酸性,其可在堿性溶液中溶解,形成鈉鹽,而在酸性條件下黃芩苷分子就被復原析出來。利用這一特性可以通過對提取的溶劑的PH值調(diào)整以到達較好的提取效果。試驗過程中發(fā)現(xiàn),當溶液pH值調(diào)節(jié)至1時,所得產(chǎn)品量少且為棕黑色,分析可能是強酸使局部黃芩苷水解所致;當溶液pH值為3時,溶液為黃色乳濁液,極難過濾且產(chǎn)品量少,分析原因可能是酸沉不完全,或根據(jù)黃芩苷在趨堿性溶液中極不穩(wěn)定的性質(zhì),在pH>3時穩(wěn)定性也有所下降所致,當溶液pH為2時,所得產(chǎn)品量多且為黃色。因此我們采用了在pH為1～2的條件下使之形成黃芩苷沉淀析出,同時也與溶液中共存的水溶性雜質(zhì)別離。4.3酸沉反響必須在較高的溫度下方可順利進行,在低溫條件下非常緩慢。因而黃芩苷濾液加酸后加熱保溫是非常重要的條件,它會直接影響到黃芩苷的得率。試驗過程中,當保溫溫度為70℃時,得到的粗粉量較少,可能是由于保溫溫度過低而沒有到達黃芩苷充分酸沉的溫度;當保溫溫度為80℃時,酸沉所得的黃芩苷粗粉的量較多;考慮到保溫溫度過高到達90℃時,可能由于保溫溫度過高,黃芩苷在此條件下會發(fā)生一定程度的水解,因此會導致粗粉中黃芩苷的純度降低。綜合考慮產(chǎn)率以及黃芩苷純度,我們采用了將溶液加熱至80℃后,調(diào)節(jié)其pH為1～2保溫的方法。4.4從黃芩中提取黃芩苷使用溶劑提取加酸沉的方法及其改良工藝已較為成熟,而且考慮到生產(chǎn)本錢和生產(chǎn)效率,我們在文獻方法的根底上選用了水回流提取、酸沉的實驗方法,該方法有快速、簡便、低本錢、易操作、高產(chǎn)率并且對環(huán)境無危害等特點。4.5合理利用實驗室所提供的儀器也是很必要的，實驗室老師給我們圓底燒瓶規(guī)格是1000ml，這樣就不能將所有的黃芩粗粉一次性裝入圓底燒瓶進行蒸餾，所以我們分三批進行蒸餾。五、在所完成實驗的根底上提出一個新的研究課題水提酸沉法提取黃芩苷的工藝優(yōu)化具體：液固比對黃芩苷收率的影響提取時間對黃芩苷收率的影響加酸時溫度對黃芩苷收率的影響酸沉保溫時間對黃芩苷收率的影響酸沉靜置時間對黃芩苷收率的影響洗滌方法對黃芩苷收率的影響六、合理化建議為了防止實驗過程中的交叉污染及儀器亂用現(xiàn)象，希望能盡量滿足每一組有一套儀器，同時也希望各位實驗成員在借用其他組的儀器的時候要告知對方，并及時歸還。七、致謝本次實驗是在孔陽老師的悉心指導下完成的，非常感謝這段時間給我們的指導與教誨。您嚴肅的科學態(tài)度，嚴謹?shù)闹螌W精神，精益求精的工作作風，深深地感染和鼓勵著我，是我們學的典范！辯論時老師對我們的方案耐心的指導，以及在實驗開始前的答疑解惑，讓我們對實驗更加有把握。在實驗期間，李老師屢次幫助我分析思路，開拓視角，在我遇到困難想放棄的時候給予我最大的支持和鼓勵，才使得本實驗得以順利的完成，在此謹向李老師表示忠心的感謝和崇高的敬意。其次還要感謝施春陽老師、曾橋老師，兩位老師非常的認真、負責。給我們在實驗過程中提供各種儀器與試劑，為我們實驗的成功做出了很大的努力、提供了很多方便。同時也感謝和我一組的伙伴，正是由于伙伴的不斷補充完善，才有成型的方案，我才能克服一個一個的困難和疑惑，直至本文的順利完成。