結核分枝桿菌實驗室檢測方法

關于結核分枝桿菌實驗室檢測方法第1頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五分枝桿菌屬一類細長略帶彎曲，有時呈分枝狀的桿菌，本屬細菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fastbacillus），細菌體內含有分枝菌酸，細胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關。本屬細菌已經(jīng)被鑒定的有70多種，可分為三大類：結核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風分枝桿菌；按生長速度可分為三類，即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型第2頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五結核分枝桿菌群結核分枝桿菌，是人和動物結核病的病原體，包括人結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti），前三種對人類治病，其中人型結核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。結核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌第3頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五非典型分枝桿菌偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜/膿腫、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、不產色分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌等偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種屬于迅速生長型，雞蛋培養(yǎng)基上3-5天可見菌落其他非典型分枝桿菌多為緩慢生長型第4頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五麻風分枝桿菌麻風分枝桿菌（M.leprae）是麻風病的病原體，也是抗酸桿菌，但較結核分枝桿菌短而粗，兩端尖細，抗酸染色著色均勻，呈束狀或團狀排列，結核分枝桿菌多散在，偶有聚集。為典型的胞內寄生菌，有麻風桿菌存在的細胞胞漿呈泡沫狀，稱麻風細胞。體外不能培養(yǎng)。第5頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五6全球約有1/3的人口已經(jīng)感染結核分枝桿菌，有2000萬活動性肺結核患者，每年新發(fā)病例900萬人，每秒鐘有1人感染結核，每年有300萬人死于結核病。隨著抗結核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降20世紀80年代后，由于艾滋病和結核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應用、吸毒、貧困及人口流動等因素，全球范圍內結核病的疫情驟然惡化結核分枝桿菌第6頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五生物學形狀結核分枝桿菌為細長略帶彎曲的桿菌，有時可見分枝狀，無芽孢和鞭毛，因衰老或抗結核藥物的作用可出現(xiàn)多形態(tài)，如球狀、串珠狀或絲狀，大小為1～4X0.4μm。細胞壁中含有大量脂質而不易著色，特別是有大量分枝菌酸包圍在肽聚糖層的外面，一般用抗酸染色。萋尼染色呈紅色，背景為藍色；熒光染料金胺“O”染色，熒光顯微鏡下為橘黃色第7頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五8培養(yǎng)特性第8頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五實驗室檢測方法

萋尼染色+熒光染色

羅氏培養(yǎng)+分枝桿菌快速培養(yǎng)

抗原抗體檢測

細胞因子檢測

熒光定量PCR

芯片雜交

病原學

免疫學

分子生物學第9頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五涂片鏡檢--抗酸染色抗酸染色是目前為止最快的結核檢出方法，可用來檢測病情進展，為感染控制提供參考依據(jù)，可確證培養(yǎng)物為陽性萋尼染色法—紅色—普通顯微鏡（高倍）熒光染色—黃或橘色—熒光顯微鏡（低倍）聯(lián)染法：敏感性高，特異性好，速度快！第10頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五抗酸染色局限性抗酸染色對分枝桿菌非特異，其他如Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（紅球菌屬）、Legionellamicdadei（軍團菌）、cryptosporidium（隱孢子蟲）、Isospora（等孢球蟲）等有抗酸菌特點不能區(qū)分結核和非結核分枝桿菌不能區(qū)分活菌和死菌敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000條菌時可檢出，而培養(yǎng)可檢出>10-100條菌.第11頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）熒光顯微鏡成本高、易損壞、耗電量大、光源壽命短、顯微鏡價格昂貴且需要在暗室內工作等，熒光染色法一直沒有在結核病痰涂片診斷中得到廣泛的應用。只需將二極管替換普通光學顯微鏡的目鏡就相當于一臺熒光顯微鏡，組裝的“熒光顯微鏡”結合金胺O染色在結核病痰涂片檢查中有一定的應用價值。田斌等，發(fā)光二極管熒光顯微鏡在基層實驗室診斷結核分枝桿菌的應用評價.實用預防醫(yī)學2012年10月第19卷第10期.第12頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五分枝桿菌培養(yǎng)技術結核菌培養(yǎng)仍是目前診斷的金標準．尤其是藥敏試驗結果在指導臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用,是鑒定是否為活菌的可靠方法．1、傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法

需要4～6周才能檢測到結核菌的生長．而且陽性率也只有30％-40％；特異性差．各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結核菌．需結合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗。第13頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五2、分枝桿菌快速液體培養(yǎng)技術BD公司推出的BACTEC—MGIT960全自動分枝桿菌培養(yǎng)，鑒定／藥敏系統(tǒng)，操作簡便，陽性標本檢出時間平均為9d：鑒定、藥敏試驗時間平均為4d：陽性標本檢出率比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)提高10％左右第14頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)優(yōu)缺點固體培養(yǎng)：污染少，易于進行菌落形態(tài)觀察，但是培養(yǎng)時間長液體培養(yǎng)：菌體與培養(yǎng)基充分接觸，生長迅速，但易受到污染第15頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五血清學試驗第16頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五免疫學檢測方法1、結核菌素試驗凡感染過結核桿菌的機體，會產生相應的致敏淋巴細胞，具有對結核桿菌的識別能力，當再次遇到通過皮膚注入的少量的結核菌素時，致敏Ｔ淋巴細胞受相同抗原再次刺激會在48-72小時內，產生局部炎癥反應，出現(xiàn)紅腫硬節(jié)即為陽性反應。對活動性結核的診斷靈敏度高達77％，第17頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五局限性：假陰性：小兒結核、老年人結核、免疫缺陷或免疫功能低下患者（如合并HIV感染、接受免疫抑制劑治療的患者)假陽性：接種過卡介苗的人也會產生陽性反應第18頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五γ干擾素釋放試驗被認為是近十年來結核診斷史上取得的最重要成就，該檢測方法的原理是：結核感染后體內長期存在抗原特異性的記憶性Ｔ細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增值，釋放γ干擾素。目前市售兩種，QFT-G和T-SPOT.TB，比較兩種方法，T-SPOT.TB更靈敏但QFT-G更特異，但均優(yōu)于結核菌素試驗，同時也被推薦用于潛伏結核診斷。第19頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五分子生物學檢測方法近年來核酸擴增技術和雜交分析技術的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天。研究、應用報道較多的結核病基因診斷技術主要包括聚合酶鏈反應(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。第20頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五MDR早期診斷分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)（協(xié)和醫(yī)院）

菌種鑒定篩查、鑒別診斷實時熒光PCR基因芯片快速檢測平臺第21頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五22高效：一個樣本可同時檢測結核分枝桿菌和NTM快速：4周（菌培）3小時靈敏：10個菌/反應（TB）；102

個菌/反應（NTM）分枝桿菌核酸檢測功能：TB快速篩查；TB/NTM鑒別診斷第22頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五23高效：同時檢測17種分枝桿菌（包括TB）快速：＞4周（菌種鑒定）6小時靈敏：

103

個菌/反應檢測范圍：結核、胞內、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜-膿腫、草、不產色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）

第23頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五24通量：兩個一線抗結核藥（MDR）速度：8周（藥敏）6小時靈敏度：103

個菌/反應基于rpoB（利福平）和katG/inhA（異煙肼）的基因突變，對耐多藥結核病做出快速診斷。結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒第24頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五五種結核檢測方法效果評價結核組：1260例非結核組：100例改良羅氏培養(yǎng)熒光PCR涂片法MGIT960快速培養(yǎng)結果比較斑點層析法第25頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五敏感性、特異性比較第26頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五羅氏培養(yǎng)和快速培養(yǎng)第27頁，共30頁，2022年，5月20日，19點35分，星期五快速培養(yǎng)和熒光PCR第28頁，