結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗室檢測方法

關(guān)于結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗室檢測方法第1頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五分枝桿菌屬一類細(xì)長略帶彎曲，有時呈分枝狀的桿菌，本屬細(xì)菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fastbacillus），細(xì)菌體內(nèi)含有分枝菌酸，細(xì)胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關(guān)。本屬細(xì)菌已經(jīng)被鑒定的有70多種，可分為三大類：結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌；按生長速度可分為三類，即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型第2頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五結(jié)核分枝桿菌群結(jié)核分枝桿菌，是人和動物結(jié)核病的病原體，包括人結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti），前三種對人類治病，其中人型結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。結(jié)核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌第3頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五非典型分枝桿菌偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜/膿腫、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌等偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種屬于迅速生長型，雞蛋培養(yǎng)基上3-5天可見菌落其他非典型分枝桿菌多為緩慢生長型第4頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌（M.leprae）是麻風(fēng)病的病原體，也是抗酸桿菌，但較結(jié)核分枝桿菌短而粗，兩端尖細(xì)，抗酸染色著色均勻，呈束狀或團(tuán)狀排列，結(jié)核分枝桿菌多散在，偶有聚集。為典型的胞內(nèi)寄生菌，有麻風(fēng)桿菌存在的細(xì)胞胞漿呈泡沫狀，稱麻風(fēng)細(xì)胞。體外不能培養(yǎng)。第5頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五6全球約有1/3的人口已經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌，有2000萬活動性肺結(jié)核患者，每年新發(fā)病例900萬人，每秒鐘有1人感染結(jié)核，每年有300萬人死于結(jié)核病。隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降20世紀(jì)80年代后，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化結(jié)核分枝桿菌第6頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五生物學(xué)形狀結(jié)核分枝桿菌為細(xì)長略帶彎曲的桿菌，有時可見分枝狀，無芽孢和鞭毛，因衰老或抗結(jié)核藥物的作用可出現(xiàn)多形態(tài)，如球狀、串珠狀或絲狀，大小為1～4X0.4μm。細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)而不易著色，特別是有大量分枝菌酸包圍在肽聚糖層的外面，一般用抗酸染色。萋尼染色呈紅色，背景為藍(lán)色；熒光染料金胺“O”染色，熒光顯微鏡下為橘黃色第7頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五8培養(yǎng)特性第8頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五實(shí)驗室檢測方法

萋尼染色+熒光染色

羅氏培養(yǎng)+分枝桿菌快速培養(yǎng)

抗原抗體檢測

細(xì)胞因子檢測

熒光定量PCR

芯片雜交

病原學(xué)

免疫學(xué)

分子生物學(xué)第9頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五涂片鏡檢--抗酸染色抗酸染色是目前為止最快的結(jié)核檢出方法，可用來檢測病情進(jìn)展，為感染控制提供參考依據(jù)，可確證培養(yǎng)物為陽性萋尼染色法—紅色—普通顯微鏡（高倍）熒光染色—黃或橘色—熒光顯微鏡（低倍）聯(lián)染法：敏感性高，特異性好，速度快！第10頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五抗酸染色局限性抗酸染色對分枝桿菌非特異，其他如Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（紅球菌屬）、Legionellamicdadei（軍團(tuán)菌）、cryptosporidium（隱孢子蟲）、Isospora（等孢球蟲）等有抗酸菌特點(diǎn)不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌不能區(qū)分活菌和死菌敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000條菌時可檢出，而培養(yǎng)可檢出>10-100條菌.第11頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）熒光顯微鏡成本高、易損壞、耗電量大、光源壽命短、顯微鏡價格昂貴且需要在暗室內(nèi)工作等，熒光染色法一直沒有在結(jié)核病痰涂片診斷中得到廣泛的應(yīng)用。只需將二極管替換普通光學(xué)顯微鏡的目鏡就相當(dāng)于一臺熒光顯微鏡，組裝的“熒光顯微鏡”結(jié)合金胺O染色在結(jié)核病痰涂片檢查中有一定的應(yīng)用價值。田斌等，發(fā)光二極管熒光顯微鏡在基層實(shí)驗室診斷結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用評價.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)2012年10月第19卷第10期.第12頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)結(jié)核菌培養(yǎng)仍是目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)．尤其是藥敏試驗結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用,是鑒定是否為活菌的可靠方法．1、傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法

需要4～6周才能檢測到結(jié)核菌的生長．而且陽性率也只有30％-40％；特異性差．各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結(jié)核菌．需結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗。第13頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五2、分枝桿菌快速液體培養(yǎng)技術(shù)BD公司推出的BACTEC—MGIT960全自動分枝桿菌培養(yǎng)，鑒定／藥敏系統(tǒng)，操作簡便，陽性標(biāo)本檢出時間平均為9d：鑒定、藥敏試驗時間平均為4d：陽性標(biāo)本檢出率比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)提高10％左右第14頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)固體培養(yǎng)：污染少，易于進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，但是培養(yǎng)時間長液體培養(yǎng)：菌體與培養(yǎng)基充分接觸，生長迅速，但易受到污染第15頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五血清學(xué)試驗第16頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五免疫學(xué)檢測方法1、結(jié)核菌素試驗凡感染過結(jié)核桿菌的機(jī)體，會產(chǎn)生相應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞，具有對結(jié)核桿菌的識別能力，當(dāng)再次遇到通過皮膚注入的少量的結(jié)核菌素時，致敏Ｔ淋巴細(xì)胞受相同抗原再次刺激會在48-72小時內(nèi)，產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)紅腫硬節(jié)即為陽性反應(yīng)。對活動性結(jié)核的診斷靈敏度高達(dá)77％，第17頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五局限性：假陰性：小兒結(jié)核、老年人結(jié)核、免疫缺陷或免疫功能低下患者（如合并HIV感染、接受免疫抑制劑治療的患者)假陽性：接種過卡介苗的人也會產(chǎn)生陽性反應(yīng)第18頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五γ干擾素釋放試驗被認(rèn)為是近十年來結(jié)核診斷史上取得的最重要成就，該檢測方法的原理是：結(jié)核感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性的記憶性Ｔ細(xì)胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增值，釋放γ干擾素。目前市售兩種，QFT-G和T-SPOT.TB，比較兩種方法，T-SPOT.TB更靈敏但QFT-G更特異，但均優(yōu)于結(jié)核菌素試驗，同時也被推薦用于潛伏結(jié)核診斷。第19頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五分子生物學(xué)檢測方法近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實(shí)驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天。研究、應(yīng)用報道較多的結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。第20頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五MDR早期診斷分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)（協(xié)和醫(yī)院）

菌種鑒定篩查、鑒別診斷實(shí)時熒光PCR基因芯片快速檢測平臺第21頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五22高效：一個樣本可同時檢測結(jié)核分枝桿菌和NTM快速：4周（菌培）3小時靈敏：10個菌/反應(yīng)（TB）；102

個菌/反應(yīng)（NTM）分枝桿菌核酸檢測功能：TB快速篩查；TB/NTM鑒別診斷第22頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五23高效：同時檢測17種分枝桿菌（包括TB）快速：＞4周（菌種鑒定）6小時靈敏：

103

個菌/反應(yīng)檢測范圍：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜-膿腫、草、不產(chǎn)色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）

第23頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五24通量：兩個一線抗結(jié)核藥（MDR）速度：8周（藥敏）6小時靈敏度：103

個菌/反應(yīng)基于rpoB（利福平）和katG/inhA（異煙肼）的基因突變，對耐多藥結(jié)核病做出快速診斷。結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒第24頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五五種結(jié)核檢測方法效果評價結(jié)核組：1260例非結(jié)核組：100例改良羅氏培養(yǎng)熒光PCR涂片法MGIT960快速培養(yǎng)結(jié)果比較斑點(diǎn)層析法第25頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五敏感性、特異性比較第26頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五羅氏培養(yǎng)和快速培養(yǎng)第27頁，共30頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)35分，星期五快速培養(yǎng)和熒光PCR第28頁，