實(shí)驗(yàn)六 感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)六感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沼谩?。12法制備感受態(tài)細(xì)胞的原理和方法。學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒的篩選方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】質(zhì)粒在不同的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移是微生物世界中一種普遍的現(xiàn)象，一個(gè)細(xì)菌品系通過(guò)吸收另一個(gè)細(xì)菌品系的質(zhì)粒DNA而發(fā)生了遺傳性狀的改變，這種現(xiàn)象叫做轉(zhuǎn)化，獲得了外源DNA的細(xì)胞稱(chēng)為轉(zhuǎn)化子。在基因克隆技術(shù)中，所謂轉(zhuǎn)化是指質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒被導(dǎo)入受體細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因，并在一定的培養(yǎng)條件下，在選擇性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子的過(guò)程。質(zhì)粒必須通過(guò)轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，才能進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量的克隆基因，使我們能夠進(jìn)行進(jìn)一步的DNA操作，如亞克隆等；或者獲得其表達(dá)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化效率的高低與受體菌的生理狀態(tài)有關(guān)。細(xì)菌吸收外源DNA的能力最高時(shí)的狀態(tài)被稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。有些種類(lèi)的細(xì)菌在其生長(zhǎng)的任一階段都處于感受態(tài)，而另一些細(xì)菌只有處于某個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)(一般為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早、中期)，才會(huì)處于感受態(tài)，如本實(shí)驗(yàn)所用的大腸桿菌。用一定濃度的CaC12處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早中期的細(xì)菌可以大大提高細(xì)菌吸收周?chē)h(huán)境中的DNA分子的能力。對(duì)這種現(xiàn)象的一種解釋是CaC12能使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增強(qiáng)，從而提高轉(zhuǎn)化率。這種轉(zhuǎn)化方法稱(chēng)為“化學(xué)法”。目前還可以使用電激的方法，通過(guò)瞬間的高壓電流，在細(xì)胞上形成孔洞，使外源DNA進(jìn)入胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。電激轉(zhuǎn)化的效率往往比化學(xué)法高出1到2個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到1x108轉(zhuǎn)化子/pgDNA，甚至1x109轉(zhuǎn)化子/pgDNA，所以常用于文庫(kù)構(gòu)建時(shí)的轉(zhuǎn)化或遺傳篩選。微生物轉(zhuǎn)化是基因工程的常用技術(shù)，大腸桿菌是基因工程中最常用的受體菌，本實(shí)驗(yàn)即是用前面實(shí)驗(yàn)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞?！驹噭┡c器材】〈一〉試劑LB液體培養(yǎng)基：參見(jiàn)附錄每組配200mL,其中100mL分裝于500mL三角瓶中，另各^mL裝于2只大試管中，其余裝于裝于500mL三角瓶中，121°C高壓蒸汽滅菌20分鐘。LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:配1LLB液體培養(yǎng)基，加A20g瓊脂粉和1支攪拌棒，同上高壓滅菌，趁熱取出置攪拌器上冷卻，待冷至55C左右，加氨芐青霉素（Ampicillin）至終濃度100四g/ml（Amp儲(chǔ)存液一般為100mg/mL）,倒平板，每皿倒約15mL，室溫放置過(guò)夜至冷凝水揮發(fā)干凈。使用前半小時(shí)在培養(yǎng)基表面加20應(yīng)50mg/mLX-gal和100應(yīng)0.1mol/LIPTG，涂勻，待這兩種化合物滲入瓊脂后，即可用于轉(zhuǎn)化菌的涂布。每組制備LB平板2個(gè)，LB/Amp平板5個(gè)，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6個(gè)。IPTG儲(chǔ)存液（0.1mol/L）：1.2gIPTG加水至50ml，過(guò)濾除菌，4C儲(chǔ)存。X-gal儲(chǔ)存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶劑中，過(guò)濾除菌，4C儲(chǔ)存。1mol/LCaCl2儲(chǔ)存液，使用濃度為0.1mol/L，CaCl2應(yīng)使用分析純，配100mL，高壓滅菌，全班用。甘油（滅菌），全班50mL，同上高壓滅菌。酸洗無(wú)菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝，同上高壓滅菌，烘干備用?！炊灯鞑?7C溫箱、水浴鍋、恒溫振蕩器等高速冷凍離心機(jī)微量移液器等〈三〉菌株大腸桿菌DH5a，基因型為【操作方法】1、感受態(tài)細(xì)胞的制備（無(wú)菌操作）：1）從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑單個(gè)DH5a大菌落接種到3mLLB培養(yǎng)液中（2），37°C劇烈振蕩（210-240r/min）培養(yǎng)過(guò)夜（3）。2）取1mL過(guò)夜培養(yǎng)物，接種到含100mLLB培養(yǎng)液的500mL錐瓶中，37C劇烈振蕩，直至培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度達(dá)到OD600為0.375-0.4（4）3）培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入2只50mL離心管中，冰上放置10分鐘，4,000r/min,4C離心15分鐘，棄上清（5）。4）將菌體懸浮于10?20mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，冰上放置20分鐘（6）。5）4,000rpm,4°。,離心10分鐘，棄上清，然后將細(xì)菌輕輕懸浮在2ml0.1mol/LCaCl2溶液中（7）。若不立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，則進(jìn)行第6步操作，反之，則進(jìn)入轉(zhuǎn)化操作。6）緩慢滴入甘油（滅菌）至終濃度為15%,輕柔混勻，將細(xì)菌分裝成0.5ml/每管，立即液氮冷凍，轉(zhuǎn)入-70C冰箱儲(chǔ)存，可在2個(gè)月內(nèi)使用（8）。2、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1）設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，如正、負(fù)對(duì)照（參考如下表格，按表格內(nèi)容操作）；實(shí)蛉編號(hào)轉(zhuǎn)化項(xiàng)呂感受態(tài)細(xì)胞（pL）DMACaCl；(lOOmmoL)無(wú)菌水ipL）總體現(xiàn)（pL）1連接產(chǎn)物+受體菌10010[iL01102完整空載體對(duì)照1001ng0::1103無(wú)DMA"照jo5554無(wú)細(xì)胞+空載體對(duì)照01ngDO555自連載體+受體菌505uL0552）從-80C冰箱中取出分裝成0.5mL/每管的感受態(tài)細(xì)胞，置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好解凍（10），立即分裝到預(yù)冷的1.5mL離心管中，每管體積參見(jiàn)上表，插入冰上待用；3）對(duì)轉(zhuǎn)化管，加入連接產(chǎn)物DNA溶液，輕輕混勻；為保險(xiǎn)起見(jiàn)，也可先加入一半的連接產(chǎn)物DNA溶液，輕輕混勻，剩下的一半置-20^冰箱保存；4）冰上放置30分鐘（11）；5）放入42°C水浴中，熱激40秒（12）；6）迅速插入冰上，放置5分鐘；7）對(duì)第1、2項(xiàng)，加入500應(yīng)LB培養(yǎng)基，其余加入250應(yīng)LB培養(yǎng)基,37C震蕩培養(yǎng)1小時(shí)（13）；8）對(duì)第1項(xiàng)，各取200應(yīng)直接用玻璃珠涂布于2個(gè)LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上；對(duì)第2項(xiàng)，分別取3、30和100gL細(xì)菌培養(yǎng)液，各加無(wú)菌水至150應(yīng)（不超過(guò)200應(yīng)）涂LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（此步驟的目的是計(jì)算轉(zhuǎn)化率）；對(duì)其余各項(xiàng)，分別各取一半涂布于LB/Amp平板上，余下的轉(zhuǎn)化液置4C冰箱保存（14）。倒置平板，37C培養(yǎng)12-14小時(shí)。一般來(lái)說(shuō)，含有活性半乳糖苷酶的細(xì)菌比無(wú)活性酶的細(xì)菌生長(zhǎng)慢，故過(guò)夜培養(yǎng)后可見(jiàn)到毫米大小的陽(yáng)性白色菌落而陰性的蘭色菌落只有針尖大?。?5）。9）挑取白色菌落進(jìn)行鑒定（見(jiàn)下一個(gè)實(shí)驗(yàn)）。【注意事項(xiàng)與提示】（1）倒平板時(shí)應(yīng)避免培養(yǎng)基溫度過(guò)高，若溫度過(guò)高，則加入的氨芐青霉素會(huì)失效，且培養(yǎng)基凝固后表面及皿蓋會(huì)形成大量冷凝水，易于造成污染及影響單菌落的形成。若用手掌感受培養(yǎng)基覺(jué)得很燙但尚可忍受時(shí)，培養(yǎng)基溫度即為55C左右。制備好的LB/Amp平板可于4C冰箱儲(chǔ)存2個(gè)月，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)氨芐青霉素將會(huì)失效。加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好現(xiàn)用。（2）DH5a在平板上過(guò)夜生長(zhǎng)后，可置冰箱中保存一個(gè)月左右；接種新鮮的菌落或菌液有利于細(xì)菌細(xì)胞的同步快速生長(zhǎng)，從而使細(xì)菌群體在達(dá)到一定的OD值后（0.375）大部分細(xì)胞都處于感受態(tài)。DH5a的生長(zhǎng)需要氧氣，劇烈振蕩的目的是提高培養(yǎng)基的溶氧量以利于細(xì)菌的生長(zhǎng)達(dá)到細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早、中期，需時(shí)約2.0?2.5小時(shí)，此步驟至為關(guān)鍵，若超過(guò)此階段，則轉(zhuǎn)化效率急劇下降。低溫操作的目的是使細(xì)胞不再生長(zhǎng)，保持其感受態(tài)。此步驟的目的是洗滌細(xì)胞。此時(shí)細(xì)胞較脆，懸浮時(shí)動(dòng)作要輕，可用移液槍輕輕吸打。-70°C冰箱儲(chǔ)存的感受態(tài)細(xì)胞在6-8周后，轉(zhuǎn)化率很快降低。可用一已知標(biāo)準(zhǔn)及濃度的閉環(huán)質(zhì)粒如pUC18/19鑒定感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力。實(shí)驗(yàn)中一定要設(shè)計(jì)正負(fù)對(duì)照，如用無(wú)DNA轉(zhuǎn)化物的感受態(tài)細(xì)菌鋪板，若有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明其中抗生素濃度不夠或感受態(tài)細(xì)胞已被污染。加樣時(shí)速度要快，但要有條不紊，切勿加錯(cuò)！加完樣用槍尖稍攪勻。第1項(xiàng)中所加連接產(chǎn)物的量可根據(jù)連接反應(yīng)的終體積而定，一般加一半或2/3，其余置一20C保存。從-80C冰箱中取出冷凍的指管后，也可用雙手搓指管，利用掌心的溫度解凍。解凍時(shí)間勿過(guò)長(zhǎng)。至少30min，可延長(zhǎng)至1h左右。掌握時(shí)間，過(guò)長(zhǎng)會(huì)致死細(xì)胞。在許多實(shí)驗(yàn)方案中，熱激時(shí)間設(shè)為90至120秒，目前已有實(shí)驗(yàn)證明如此長(zhǎng)的熱激時(shí)間是沒(méi)有必要的，且會(huì)引起轉(zhuǎn)化效率的下降。熱激前加入相當(dāng)于轉(zhuǎn)化液體積1/10的DMSO可提高轉(zhuǎn)化效率10倍左右，加入DMSO后請(qǐng)勿再劇烈振蕩。此步驟使得細(xì)菌恢復(fù)正常并讓0-內(nèi)酰氨酶基因表達(dá)。此步驟可在實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)錯(cuò)誤后進(jìn)行補(bǔ)救。培養(yǎng)時(shí)間勿過(guò)長(zhǎng)，以免衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。很多因素都可以影響轉(zhuǎn)化的效率，特別需要注意的有兩點(diǎn)，一是制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)的OD值，二是所用試劑要分析純以上，并用雙蒸水或超純水（如MiliQ）配制。【實(shí)驗(yàn)安排】實(shí)驗(yàn)前兩天挑E.coli菌種在LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)前一天各組要將試劑準(zhǔn)備好，包括培養(yǎng)基的消毒滅菌。下午臨下課時(shí)從平板上挑新鮮的單菌落接種到3mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化完畢，次日一早觀察記錄結(jié)果，并清理余下的菌種試劑等。【實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求與思考題】1.制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)特別注意哪些環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化效率是指每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)目，請(qǐng)列表表示你的轉(zhuǎn)化結(jié)果并算出轉(zhuǎn)化率（列出計(jì)算公式）。你所做實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化效率（正對(duì)照）是多少？如果過(guò)低（如低于104cfu/MgDNA，請(qǐng)分析可能的原因。需要注意的是，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率是非常低的，為什么？若實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)不正常的結(jié)果，請(qǐng)分析原因。附錄：大腸桿菌的高效轉(zhuǎn)化方法一、試劑TB溶液：1.512gPIPES，1.1025gCaCl2，9.31875gKCl，溶于水，以5NKOH調(diào)pH6.7，再加入5.44225gMnCl2，定容至500ml，Wir濾膜過(guò)濾滅菌，4C保存。SOB培養(yǎng)基：Tryptone20g（OXOID公司）；Yeastextract5g（OXOID公司）；NaCl0.5g，加800ml雙蒸水，加入250mmol/LKCl溶液10ml，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，定容至1,000ml，高壓滅菌，4C保存；使用前加入5ml經(jīng)高壓滅菌的2mol/LMgCl2溶液。SOC培養(yǎng)基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基，SOB培養(yǎng)基高壓滅菌后，降溫至60C或以下時(shí)，加入20ml經(jīng)過(guò)濾除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4C保存。DMSO二、方法（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備將E.coliDH5a涂布于LB（A-）培養(yǎng)基上，37°C過(guò)夜。挑取2-3個(gè)直徑2-3mm的大菌落，接種到50mlSOB培養(yǎng)基中。在250ml三角瓶中18C,200-250rpm振蕩培養(yǎng)，直到OD=0.6，約需要36-48hr。將三角瓶冰浴10分鐘。轉(zhuǎn)移菌液到50ml離心管。2,500g,10min,4C。菌體用16ml冰預(yù)冷的TB溶液懸浮，冰浴10min。6.2,500g,10min，4C。菌體用4ml冰預(yù)冷的TB溶液懸浮，加入280ulDMSO。菌液于冰浴10分鐘后分裝到凍存管。每管200ul。液氮冷卻，保存于液氮中。大月0分鐘后，轉(zhuǎn)移到-40C冰箱保存。（二）轉(zhuǎn)化將LB抗性平板，SOC培養(yǎng)基，于37C預(yù)熱。室溫溶解感受態(tài)細(xì)胞。取200uL菌液加入1.5mL離心管中，放于冰中。加入1-5uL質(zhì)粒溶液，用槍頭混勻，冰浴30min。5.42C熱激30秒，冰浴。加入800uLSOC培養(yǎng)基，37C，250r/min，1hr。涂布LB抗性平板，37C過(guò)夜。致敏緩沖液中試劑的純度與濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響很