實驗六 感受態(tài)細胞的制備和重組質粒的轉化

實驗六感受態(tài)細胞的制備和重組質粒的轉化【實驗目的】掌握用。3。12法制備感受態(tài)細胞的原理和方法。學習和掌握質粒DNA的轉化和重組質粒的篩選方法?！緦嶒炘怼抠|粒在不同的細菌之間轉移是微生物世界中一種普遍的現象，一個細菌品系通過吸收另一個細菌品系的質粒DNA而發(fā)生了遺傳性狀的改變，這種現象叫做轉化，獲得了外源DNA的細胞稱為轉化子。在基因克隆技術中，所謂轉化是指質?；蛑亟M質粒被導入受體細胞，表達相應的選擇標記基因，并在一定的培養(yǎng)條件下，在選擇性培養(yǎng)基上長出轉化子的過程。質粒必須通過轉化進入細菌細胞內，才能進行擴增和表達，從而獲得大量的克隆基因，使我們能夠進行進一步的DNA操作，如亞克隆等；或者獲得其表達產物。轉化效率的高低與受體菌的生理狀態(tài)有關。細菌吸收外源DNA的能力最高時的狀態(tài)被稱為感受態(tài)細胞(competentcell)。有些種類的細菌在其生長的任一階段都處于感受態(tài)，而另一些細菌只有處于某個生長時期時(一般為對數生長早、中期)，才會處于感受態(tài)，如本實驗所用的大腸桿菌。用一定濃度的CaC12處理對數生長早中期的細菌可以大大提高細菌吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的能力。對這種現象的一種解釋是CaC12能使細菌細胞壁的通透性增強，從而提高轉化率。這種轉化方法稱為“化學法”。目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流，在細胞上形成孔洞，使外源DNA進入胞內，從而實現細胞的轉化。電激轉化的效率往往比化學法高出1到2個數量級，達到1x108轉化子/pgDNA，甚至1x109轉化子/pgDNA，所以常用于文庫構建時的轉化或遺傳篩選。微生物轉化是基因工程的常用技術，大腸桿菌是基因工程中最常用的受體菌，本實驗即是用前面實驗獲得的重組質粒轉化大腸桿菌細胞?！驹噭┡c器材】〈一〉試劑LB液體培養(yǎng)基：參見附錄每組配200mL,其中100mL分裝于500mL三角瓶中，另各^mL裝于2只大試管中，其余裝于裝于500mL三角瓶中，121°C高壓蒸汽滅菌20分鐘。LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:配1LLB液體培養(yǎng)基，加A20g瓊脂粉和1支攪拌棒，同上高壓滅菌，趁熱取出置攪拌器上冷卻，待冷至55C左右，加氨芐青霉素（Ampicillin）至終濃度100四g/ml（Amp儲存液一般為100mg/mL）,倒平板，每皿倒約15mL，室溫放置過夜至冷凝水揮發(fā)干凈。使用前半小時在培養(yǎng)基表面加20應50mg/mLX-gal和100應0.1mol/LIPTG，涂勻，待這兩種化合物滲入瓊脂后，即可用于轉化菌的涂布。每組制備LB平板2個，LB/Amp平板5個，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6個。IPTG儲存液（0.1mol/L）：1.2gIPTG加水至50ml，過濾除菌，4C儲存。X-gal儲存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶劑中，過濾除菌，4C儲存。1mol/LCaCl2儲存液，使用濃度為0.1mol/L，CaCl2應使用分析純，配100mL，高壓滅菌，全班用。甘油（滅菌），全班50mL，同上高壓滅菌。酸洗無菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝，同上高壓滅菌，烘干備用?！炊灯鞑?7C溫箱、水浴鍋、恒溫振蕩器等高速冷凍離心機微量移液器等〈三〉菌株大腸桿菌DH5a，基因型為【操作方法】1、感受態(tài)細胞的制備（無菌操作）：1）從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑單個DH5a大菌落接種到3mLLB培養(yǎng)液中（2），37°C劇烈振蕩（210-240r/min）培養(yǎng)過夜（3）。2）取1mL過夜培養(yǎng)物，接種到含100mLLB培養(yǎng)液的500mL錐瓶中，37C劇烈振蕩，直至培養(yǎng)液中細菌濃度達到OD600為0.375-0.4（4）3）培養(yǎng)物轉入2只50mL離心管中，冰上放置10分鐘，4,000r/min,4C離心15分鐘，棄上清（5）。4）將菌體懸浮于10?20mL預冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，冰上放置20分鐘（6）。5）4,000rpm,4°。,離心10分鐘，棄上清，然后將細菌輕輕懸浮在2ml0.1mol/LCaCl2溶液中（7）。若不立即進行轉化實驗，則進行第6步操作，反之，則進入轉化操作。6）緩慢滴入甘油（滅菌）至終濃度為15%,輕柔混勻，將細菌分裝成0.5ml/每管，立即液氮冷凍，轉入-70C冰箱儲存，可在2個月內使用（8）。2、感受態(tài)細胞的轉化1）設計好實驗項目，如正、負對照（參考如下表格，按表格內容操作）；實蛉編號轉化項呂感受態(tài)細胞（pL）DMACaCl；(lOOmmoL)無菌水ipL）總體現（pL）1連接產物+受體菌10010[iL01102完整空載體對照1001ng0::1103無DMA"照jo5554無細胞+空載體對照01ngDO555自連載體+受體菌505uL0552）從-80C冰箱中取出分裝成0.5mL/每管的感受態(tài)細胞，置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好解凍（10），立即分裝到預冷的1.5mL離心管中，每管體積參見上表，插入冰上待用；3）對轉化管，加入連接產物DNA溶液，輕輕混勻；為保險起見，也可先加入一半的連接產物DNA溶液，輕輕混勻，剩下的一半置-20^冰箱保存；4）冰上放置30分鐘（11）；5）放入42°C水浴中，熱激40秒（12）；6）迅速插入冰上，放置5分鐘；7）對第1、2項，加入500應LB培養(yǎng)基，其余加入250應LB培養(yǎng)基,37C震蕩培養(yǎng)1小時（13）；8）對第1項，各取200應直接用玻璃珠涂布于2個LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上；對第2項，分別取3、30和100gL細菌培養(yǎng)液，各加無菌水至150應（不超過200應）涂LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（此步驟的目的是計算轉化率）；對其余各項，分別各取一半涂布于LB/Amp平板上，余下的轉化液置4C冰箱保存（14）。倒置平板，37C培養(yǎng)12-14小時。一般來說，含有活性半乳糖苷酶的細菌比無活性酶的細菌生長慢，故過夜培養(yǎng)后可見到毫米大小的陽性白色菌落而陰性的蘭色菌落只有針尖大小（15）。9）挑取白色菌落進行鑒定（見下一個實驗）?！咀⒁馐马椗c提示】（1）倒平板時應避免培養(yǎng)基溫度過高，若溫度過高，則加入的氨芐青霉素會失效，且培養(yǎng)基凝固后表面及皿蓋會形成大量冷凝水，易于造成污染及影響單菌落的形成。若用手掌感受培養(yǎng)基覺得很燙但尚可忍受時，培養(yǎng)基溫度即為55C左右。制備好的LB/Amp平板可于4C冰箱儲存2個月，時間過長氨芐青霉素將會失效。加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好現用。（2）DH5a在平板上過夜生長后，可置冰箱中保存一個月左右；接種新鮮的菌落或菌液有利于細菌細胞的同步快速生長，從而使細菌群體在達到一定的OD值后（0.375）大部分細胞都處于感受態(tài)。DH5a的生長需要氧氣，劇烈振蕩的目的是提高培養(yǎng)基的溶氧量以利于細菌的生長達到細菌對數生長早、中期，需時約2.0?2.5小時，此步驟至為關鍵，若超過此階段，則轉化效率急劇下降。低溫操作的目的是使細胞不再生長，保持其感受態(tài)。此步驟的目的是洗滌細胞。此時細胞較脆，懸浮時動作要輕，可用移液槍輕輕吸打。-70°C冰箱儲存的感受態(tài)細胞在6-8周后，轉化率很快降低?？捎靡灰阎獦藴始皾舛鹊拈]環(huán)質粒如pUC18/19鑒定感受態(tài)細胞的轉化能力。實驗中一定要設計正負對照，如用無DNA轉化物的感受態(tài)細菌鋪板，若有菌落生長，說明其中抗生素濃度不夠或感受態(tài)細胞已被污染。加樣時速度要快，但要有條不紊，切勿加錯！加完樣用槍尖稍攪勻。第1項中所加連接產物的量可根據連接反應的終體積而定，一般加一半或2/3，其余置一20C保存。從-80C冰箱中取出冷凍的指管后，也可用雙手搓指管，利用掌心的溫度解凍。解凍時間勿過長。至少30min，可延長至1h左右。掌握時間，過長會致死細胞。在許多實驗方案中，熱激時間設為90至120秒，目前已有實驗證明如此長的熱激時間是沒有必要的，且會引起轉化效率的下降。熱激前加入相當于轉化液體積1/10的DMSO可提高轉化效率10倍左右，加入DMSO后請勿再劇烈振蕩。此步驟使得細菌恢復正常并讓0-內酰氨酶基因表達。此步驟可在實驗出現錯誤后進行補救。培養(yǎng)時間勿過長，以免衛(wèi)星菌落的出現。很多因素都可以影響轉化的效率，特別需要注意的有兩點，一是制備感受態(tài)細胞時的OD值，二是所用試劑要分析純以上，并用雙蒸水或超純水（如MiliQ）配制。【實驗安排】實驗前兩天挑E.coli菌種在LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)過夜。實驗前一天各組要將試劑準備好，包括培養(yǎng)基的消毒滅菌。下午臨下課時從平板上挑新鮮的單菌落接種到3mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。轉化完畢，次日一早觀察記錄結果，并清理余下的菌種試劑等?！緦嶒瀳蟾嬉笈c思考題】1.制備感受態(tài)細胞和轉化時，應特別注意哪些環(huán)節(jié)。轉化效率的計算：轉化效率是指每微克質粒DNA轉化細胞產生的轉化子數目，請列表表示你的轉化結果并算出轉化率（列出計算公式）。你所做實驗的轉化效率（正對照）是多少？如果過低（如低于104cfu/MgDNA，請分析可能的原因。需要注意的是，連接產物的轉化效率是非常低的，為什么？若實驗出現不正常的結果，請分析原因。附錄：大腸桿菌的高效轉化方法一、試劑TB溶液：1.512gPIPES，1.1025gCaCl2，9.31875gKCl，溶于水，以5NKOH調pH6.7，再加入5.44225gMnCl2，定容至500ml，Wir濾膜過濾滅菌，4C保存。SOB培養(yǎng)基：Tryptone20g（OXOID公司）；Yeastextract5g（OXOID公司）；NaCl0.5g，加800ml雙蒸水，加入250mmol/LKCl溶液10ml，用10mol/LNaOH調pH至7.0，定容至1,000ml，高壓滅菌，4C保存；使用前加入5ml經高壓滅菌的2mol/LMgCl2溶液。SOC培養(yǎng)基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基，SOB培養(yǎng)基高壓滅菌后，降溫至60C或以下時，加入20ml經過濾除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4C保存。DMSO二、方法（一）感受態(tài)細胞的制備將E.coliDH5a涂布于LB（A-）培養(yǎng)基上，37°C過夜。挑取2-3個直徑2-3mm的大菌落，接種到50mlSOB培養(yǎng)基中。在250ml三角瓶中18C,200-250rpm振蕩培養(yǎng)，直到OD=0.6，約需要36-48hr。將三角瓶冰浴10分鐘。轉移菌液到50ml離心管。2,500g,10min,4C。菌體用16ml冰預冷的TB溶液懸浮，冰浴10min。6.2,500g,10min，4C。菌體用4ml冰預冷的TB溶液懸浮，加入280ulDMSO。菌液于冰浴10分鐘后分裝到凍存管。每管200ul。液氮冷卻，保存于液氮中。大月0分鐘后，轉移到-40C冰箱保存。（二）轉化將LB抗性平板，SOC培養(yǎng)基，于37C預熱。室溫溶解感受態(tài)細胞。取200uL菌液加入1.5mL離心管中，放于冰中。加入1-5uL質粒溶液，用槍頭混勻，冰浴30min。5.42C熱激30秒，冰浴。加入800uLSOC培養(yǎng)基，37C，250r/min，1hr。涂布LB抗性平板，37C過夜。致敏緩沖液中試劑的純度與濃度對轉化率影響很