細胞凋亡與免疫

關(guān)于細胞凋亡與免疫第1頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五2引言☆細胞凋亡是一種普遍存在的生物學(xué)過程，它與細胞增殖、細胞分化都是最重要的生命現(xiàn)象，正是由于細胞增殖、細胞分化、細胞調(diào)亡的相互聯(lián)系、相互制約的關(guān)系，才保證了生物體的正常發(fā)育。☆正常凋亡過程受阻或某種原因所致不正常的細胞凋亡，都會使機體出現(xiàn)病癥。因此對細胞凋亡的研究有助于某些疾病的闡明與治療。☆細胞凋亡的研究是近年來生命科學(xué)中發(fā)展起來的熱點課題。早期基于形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)，近期則是基于分子生物學(xué)技術(shù)從基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究。第2頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五3主要內(nèi)容細胞凋亡概述（基本概念、意義、

生物學(xué)特征、調(diào)節(jié)、信號傳遞等）細胞凋亡與免疫生理細胞凋亡與免疫病理細胞凋亡的檢測方法細胞凋亡研究相關(guān)展望第3頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五一細胞凋亡概述1.基本概念及生物學(xué)意義：

凋亡（apoptosis）一詞于1972年Kerr（英國阿伯丁大學(xué)病理學(xué)教授）引入，是一個希臘語合成詞,原意指花瓣或樹葉的自然脫落（Apo脫落＋ptosis飄零=Apoptosis）。

基本概念：細胞凋亡是一個“形態(tài)學(xué)”概念，是對細胞超微結(jié)構(gòu)觀察的基礎(chǔ)上得出的特指一種由基因控制、形態(tài)學(xué)特征與壞死截然不同的自主性細胞死亡方式。第4頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五1972年，Kerr,Wylle和Curry在許多正常組織中觀察到一種與經(jīng)典的細胞壞死形態(tài)特征不同的現(xiàn)象：細胞收縮、細胞碎片、散在不完整細胞等，據(jù)此，他們首次提出apoptosis一詞。國內(nèi)常譯為細胞凋亡、細胞凋落、細胞凋謝、細胞衰亡等，多數(shù)學(xué)者傾向于“細胞凋亡”。強調(diào)這一過程是一種自然的生理學(xué)過程。第5頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五6

細胞凋亡與細胞程序性死亡細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個功能性概念，一般指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。細胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地關(guān)系。大多數(shù)情況下程序性細胞死亡是以凋亡的方式進行，但并不是所有的程序性死亡都采取凋亡的方式。第6頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五如煙草蛾節(jié)間肌肉細胞、哺乳動物某些神經(jīng)元和紅細胞，它們的程序性死亡是以非凋亡的方式進行。有時由外源性理化因子刺激誘發(fā)的細胞死亡，形態(tài)上似凋亡，但并不是由細胞內(nèi)原裝程序所引發(fā)，也不能稱為程序性細胞死亡（如放療后腫瘤組織壞死等）。

因此細胞凋亡只是程序性死亡的特殊方式。

細胞凋亡與細胞程序性死亡第7頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五8細胞凋亡的生物學(xué)意義：近年來對細胞凋亡的研究日漸重視，現(xiàn)代研究結(jié)果表明：細胞凋亡不僅是認識細胞死亡過程的基礎(chǔ)，而且在胚胎發(fā)育、造血、免疫、乃至腫瘤形成中都有極為重要的作用。

1.確保正常的生長發(fā)育(development)：清除無用、多余的細胞。2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(maintenanceofhomeostasis)：清除受損、突變或衰老的細胞。3.發(fā)揮積極的防御功能(defensereaction)：清除病毒感染細胞等對機體有害的細胞。第8頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五

Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis.

Tissueremodeling.第9頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五

Theresorptionofthetadpoletailatthetimeofitsmetamorphosisintoafrogoccursbyapoptosis.Eliminationoftransitoryorgansandtissues.

第10頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五第11頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五細胞凋亡參與皮膚更新第12頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五第13頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五142.細胞凋亡的生物學(xué)特征形態(tài)學(xué)變化生物化學(xué)變化

胞內(nèi)Ca++濃度增高

DNA片段化大分子的合成(凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)及RNA合成）

tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的積累并達到較高的水平。一種依賴鈣離子的酶，當?shù)蛲銎鹗紩r，Ca++濃度上升，從而使tTG活化。其作用是保持凋亡小體的完整性，防止有害物質(zhì)的逸出。第14頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五15MorphologicalChanges(細胞生物學(xué)詳講)第一階段：胞體縮小與周圍細胞失去聯(lián)系，細胞器變致密，核體積縮小，核仁消失，染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)表面下，形成新月形致密小塊。第二階段：染色體斷裂，核膜與細胞膜均內(nèi)陷，包裹胞內(nèi)成分(胞漿、細胞器、碎裂的染色質(zhì)及核膜)形成“泡”樣結(jié)構(gòu)，此為“凋亡小體”。最后，整個細胞均裂解成這種“小體”。第三階段：凋亡小體被鄰近的巨噬、上皮細胞等識別、吞噬、消化。上述三個階段維持時間很短，通常在幾分鐘、十幾分鐘內(nèi)即可完成。第15頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五16細胞凋亡時的形態(tài)學(xué)變化第16頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五

細胞凋亡與細胞壞死特征細胞凋亡細胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強烈刺激受累范圍

單個細胞丟失成群細胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細胞體積減少、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細胞器無明顯變化腫漲破壞溶酶體保持完整破壞外溢細胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無后果不引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義生理死亡方式病理死亡方式17第17頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五18第18頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五19第19頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五20DNA'ladderDNAfragmentationchromatinDNAcorehistonenucleosome180bpendonucleolytic第20頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五213.細胞凋亡的誘導(dǎo)和抑制因素物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等；化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團和分子，激素，細胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF）等。

DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑等。

第21頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五224.免疫相關(guān)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)接受凋亡信號凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的級聯(lián)反應(yīng)第22頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五23免疫相關(guān)的凋亡信號途徑死亡受體介導(dǎo)的信號途徑線粒體途徑顆粒酶B途徑(CTL特有)第23頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五24死亡受體通路、線粒體通路第24頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五25其中膜受體和線粒體途徑均通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸酶（Caspase）剪切胞內(nèi)底物（Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程），導(dǎo)致凋亡特有的生化和形態(tài)學(xué)改變。細胞凋亡涉及的共同通路第25頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五26Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的詞頭)細胞凋亡涉及的共同通路第26頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五27第27頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五28Caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類ICE亞類Caspase蛋白酶：ICE是單核細胞來源的參與成熟的一種蛋白酶，參與凋亡但不起主要作用；

Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11

Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶（上游Caspase）：

Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶（下游Caspase）：

Caspase3，Caspase6，Caspase7第28頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五29

Caspase家族的特點：以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和異源活化,活化后形成四聚體的蛋白水解酶，發(fā)揮生物學(xué)作用C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點

第29頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五30Caspase活化機制：

Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，雖然分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體,第30頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五31第31頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五32凋亡細胞的特征性表現(xiàn)：包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)濃縮，細胞膜活化，細胞皺縮，最后形成由細胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細胞所吞噬。破壞細胞抗凋亡因素破壞細胞結(jié)構(gòu)影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能Caspase的效應(yīng)機制第32頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五33破壞細胞抗凋亡因素正?；罴毎麅?nèi)核酸酶處于無活性狀態(tài)。這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起（如抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化）。現(xiàn)知caspase可以剪切裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD），而把它的抑制物稱為ICAD。有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成并顯示活性，因而ICAD對CAD的活化與抑制是必需的。

第33頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五34破壞細胞結(jié)構(gòu)

Caspase可直接破壞細胞結(jié)構(gòu)：如裂解核纖層

核纖層（Lamin）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進行正常的排列。在細胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細胞染色質(zhì)的固縮。第34頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五35影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能Caspase可作用于多種與DNA、RNA功能有關(guān)的蛋白：如滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。第35頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五364.1

死亡受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(1).參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白：（死亡結(jié)構(gòu)域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

TNF+TNFRI（死亡結(jié)構(gòu)域）+TRADD細胞凋亡FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

FasL+Fas（死亡結(jié)構(gòu)域）+FADD細胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白第36頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五37(2).死亡受體通路受體多聚化和構(gòu)像改變死亡受體/配體/FADD/Caspase8或10+FADDFASL+FAS凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物（DISC）胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個復(fù)合物上細胞有足夠caspase8細胞caspase8濃度不夠死亡受體活化，細胞凋亡切割BidtBid從胞質(zhì)到線粒體CtyC釋放線粒體途徑第37頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五38FasL//Fas第38頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五39(3).死亡受體途徑的調(diào)控機制FLIP

[FADD-like-IL-1β-converting-enzyme(FLICE)inhibitoryprotein]

近年發(fā)現(xiàn)的含DED的凋亡抑制蛋白廣泛存在于真核生物、哺乳動物細胞和病毒中包括：病毒基因編碼的FLIP(v-FLIP)

細胞FLIP(c-FLIP):c-FLIPS或c-FLIPL

功能：抑制Caspase8結(jié)合到DISC上，從而抑制起始Caspase激活。第39頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五404.2線粒體途徑(1).基本環(huán)節(jié)：釋放caspase活化因子細胞色素C：細胞色素C+Apaf-1+caspase9凋亡體AIF（凋亡誘導(dǎo)因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子第40頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五41(2).線粒體通路第41頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五42(3).線粒體通路的調(diào)控機制Bcl-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2）

因該家族成員可通過改變外膜通透性而調(diào)控線粒體活化，故該途徑也稱為Bcl-2介導(dǎo)的線粒體途徑。

Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個成員，所有Bcl-2家族成員均含有1個或多個BH結(jié)構(gòu)域。

第42頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五43根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為兩類：抗凋亡/促增殖成員：包括Bcl-2、Bcl-xl等。

機制：可阻止線粒體外膜通透化，從而阻止細胞色素C的釋放，抑制細胞凋亡。促凋亡成員：包括Bid、Bim、Bad等“BH3only”蛋白質(zhì)和Bax、Bak、Bok等“多BH”蛋白質(zhì)機制：影響APAF1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能第43頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五44第44頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五45第45頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五46IAP（inhibitorofapoptosis，細胞凋亡抑制因子）

IAP超家族的成員較多，共同的特征是含有一個或多個７０個氨基酸的重復(fù)序列（BIR），類似于zinc指狀的結(jié)構(gòu)。

BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導(dǎo)對caspase的抑制作用，而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導(dǎo)caspase-３和-７的泛素化降解作用。第46頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五47第47頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五48(3)Smac/Dablo

在細胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進入細胞質(zhì)。成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個新的N基端,這個N基端的前面4個氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合。Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對胱解酶9的抑制，促進凋亡。第48頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五49(4)AIF(apoptosis-inducingfactor)EndoG

兩者均由線粒體釋放，可以非Caspase依賴方式介導(dǎo)染色質(zhì)的濃集和DNA片段化，促進凋亡。第49頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五50

顆粒酶B途徑凋亡顆粒酶B屬絲氨酸蛋白酶可作用于底物的天冬氨酸殘基位點是CTL殺傷靶細胞的主要效應(yīng)分子。機制:(1)顆粒酶B直接剪切并激活Caspase-3,后者作用于胞內(nèi)底物介導(dǎo)凋亡

(2)顆粒酶B剪切Bid而產(chǎn)生tBid,后者與Bax轉(zhuǎn)位于線粒體，介導(dǎo)細胞色素C釋放，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)。第50頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五51細胞凋亡發(fā)生于在淋巴細胞分化、發(fā)育成熟及增殖和行使免疫學(xué)效應(yīng)的全過程中；細胞凋亡在免疫系統(tǒng)成熟、受體多樣性選擇以及免疫自穩(wěn)等方面均有重要作用；研究免疫系統(tǒng)凋亡機制將為探討包括腫瘤、自身免疫病、艾滋病等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生機理進而發(fā)展有效的防治方案提供依據(jù)。二細胞凋亡與免疫生理第51頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五52二細胞凋亡與免疫生理1.細胞凋亡與T細胞（1）凋亡與T細胞在胸腺的分化發(fā)育：第52頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五53（2）凋亡與成熟T細胞：活化T細胞表面高表達fas及fasL。AICD1.細胞凋亡與T細胞第53頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五542.細胞凋亡與B細胞（1）凋亡與骨髓中B細胞發(fā)育：（2）凋亡與成熟B細胞第54頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五553.細胞凋亡與淋巴細胞的細胞毒作用：有胞毒作用的淋巴細胞主要有CTL、NK、LAK細胞等。它們產(chǎn)生效應(yīng)的機制相似：Ca+內(nèi)流→釋放穿孔素→6-16nm孔→靶細胞死亡

靶細胞凋亡↑顆粒酶（絲氨酸酶）→激活caspase←TNF相關(guān)蛋白↑

Tc高表達FasL第55頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五三細胞凋亡與免疫病理細胞凋亡不足及細胞凋亡過度都會造成疾病20040481proliferationapoptosishomeostasis

time第56頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五57與凋亡不足有關(guān)的疾病與凋亡過度有關(guān)的疾病1腫瘤1AIDS濾泡型淋巴瘤2神經(jīng)變性疾病激素依賴性腫瘤（乳瘤）巴金森氏病2自身免疫病色素性視網(wǎng)膜炎系統(tǒng)性紅斑狼瘡3再生障礙性貧血免疫介導(dǎo)的腎小球腎炎4缺血性損傷3病毒感染心肌梗死，中風(fēng)皰疹病毒，腺病毒5酒精中毒性肝病57凋亡不足與過度并存：動脈粥樣硬化（內(nèi)皮細胞凋亡過度，血管平滑肌細胞凋亡不足）第57頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五58針對疾病種類的不同，可以通過抑制或者增強細胞凋亡的措施治療有關(guān)的疾?。?誘導(dǎo)細胞凋亡治療因凋亡受抑而致的疾病放療和化療能激活腫瘤自殺程序，導(dǎo)致瘤細胞凋亡。改變細胞凋亡狀態(tài)用于疾病治療的許多措施尚屬試用階段。一個十分誘人的設(shè)想是基因治療——通過載體導(dǎo)入凋亡相關(guān)基因干預(yù)細胞的凋亡調(diào)控來實現(xiàn)。2抑制細胞凋亡治療因凋亡過量而致的疾病

神經(jīng)生長因子治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，可以延緩神經(jīng)元凋亡。第58頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五59四細胞凋亡研究方法形態(tài)學(xué)方法生物化學(xué)方法免疫學(xué)方法組織化學(xué)方法分子生物學(xué)方法第59頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五60第60頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五611.形態(tài)學(xué)方法1）

光學(xué)顯微鏡觀察

樣品涂片或組織切片經(jīng)常規(guī)處理、HE染色后,即可放在油鏡下觀察。該方法簡便,缺點是只有在發(fā)現(xiàn)了具有特征性的凋亡小體時才能確定為熒光結(jié)果陽性,因而不易檢出早期的凋亡細胞,而且某些類型的細胞壞死(如凝固性壞死)與細胞凋亡形態(tài)相似,兩者不易區(qū)分。因此,該方法只能作為細胞凋亡初步推測的手段。第61頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五62第62頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五631.形態(tài)學(xué)方法2）熒光顯微鏡觀察：熒光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙錠(EB)等染色,在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細胞的細胞核改變和凋亡小體的形成。這種方法適用于對體外培養(yǎng)細胞懸液的檢測,組織脫蠟切片經(jīng)RNA酶作用后也可用此法染色觀察。熒光顯微鏡檢查法方便易行,現(xiàn)已成為細胞凋亡檢查的常用手段。第63頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五64

Onthisslidetheeasiestandhistoricallyfirstwayofidentifyingapoptoticcellsisshown.InthisassaythebluefluorescentdyeDAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindoledihydrochloride)hasbeenused,whichspecificallystainsDNA.

第64頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五65

1.形態(tài)學(xué)方法3）透射電子顯微鏡觀察：凋亡細胞在電子顯微鏡下可見細胞體積變小,細胞質(zhì)濃縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體增多,細胞膜微絨毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小體。超微結(jié)構(gòu)觀察是診斷細胞凋亡最可靠的方法。但該法只能定性,不能定量,而且觀察到凋亡小體的幾率也不高,在體內(nèi)試驗時,凋亡小體可能很快被巨噬細胞吞噬清除,而不易觀察到;此外,用電子顯微鏡檢測細胞凋亡,樣品制備步驟繁瑣、耗時、昂貴。第65頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五66第66頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五671.形態(tài)學(xué)方法4）共聚焦激光掃描顯微鏡檢測：共聚焦激光掃描顯微鏡是20世紀80年代發(fā)展起來的一種新型儀器,是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置,利用計算機進行圖像處理,使紫外光和可見光激發(fā)熒光探針,從而得到清晰的細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。該方法能用于細胞的形態(tài)學(xué)分析,而且還能對凋亡細胞內(nèi)的大分子進行定位。第67頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五682.生物化學(xué)方法：（1）典型的細胞凋亡顯示出DNA梯形電泳圖譜：細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180～200bp長的DNA片段或整數(shù)倍的寡核苷酸片段。凋亡細胞經(jīng)處理后,采用常規(guī)方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的梯形電泳圖譜,而壞死細胞電泳后呈模糊的涂片狀第68頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五69細胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細胞DNA電泳圖1．細胞色素c誘導(dǎo)0h2．細胞色素c誘導(dǎo)1h3．細胞色素c誘導(dǎo)2h4．細胞色素c誘導(dǎo)3h5．細胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對照7．Marker

（自趙允、翟中和）第69頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五70第70頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五712.生物化學(xué)方法：（2）原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)：

凋亡細胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活，核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(缺口)，暴露出大量3’末端，如用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標記的-dUTP進行缺口末端標記，則可原位特異地顯示出凋亡細胞。第71頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五72

2.生物化學(xué)方法：

由DNA片段末端標記技術(shù)發(fā)展而成的TUNEL法[terminadeoxynucleotibyltransferase(TdT)-mediateddUTP-biotinnickendlabelling,TUNEL]及試劑盒化,使細胞凋亡的原位檢測在諸多領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用。第72頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五73TUNEL法原理

1.細胞凋亡其斷裂DNA斷端3′-OH暴露(壞死細胞DNA斷裂是無規(guī)則的,其中也有少數(shù)可出現(xiàn)3′-OH的暴露,但數(shù)量極微弱,不易檢測出來);

2.在末端DNA轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,在無需模板的情況下,可進行3′端的DNA合成;

3.如果在反應(yīng)體系中加入標記的DNA,則在3′端出現(xiàn)一段帶有標記物的寡核苷酸,通過熒光顯示或其他顯色反應(yīng),可以原位地較特異地顯示發(fā)生凋亡的細胞。第73頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五74TUNEL法優(yōu)點:①特異性:該法用生化方法特異地標記凋亡細胞,可以將凋亡細胞、壞死細胞和活細胞區(qū)分開來。凋亡細胞顯示增強的熒光,而壞死細胞和活細胞均不著染熒光。②敏感性:TUNEL法可用于只有極少細胞發(fā)生凋亡的情況。③可定量檢測細胞凋亡。第74頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五75TUNEL法優(yōu)點:④適用于形態(tài)研究:用TUNEL法標記細胞可動態(tài)觀察凋亡細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。⑤適用性較廣:可用于石蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離細胞的凋亡情況檢測。⑥TUNEL法檢測快速,其反應(yīng)過程僅需3h。第75頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五76第76頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五77第77頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五78缺點:①只能標記中期及晚期的凋亡細胞。②不能檢測只發(fā)生DNA大片段(300000bp)斷裂的凋亡細胞。③不能檢測DNA斷裂末端的準確數(shù)量,因為每個末端結(jié)合的標記分子的數(shù)量可因反應(yīng)動力學(xué)而不同。④若樣品處理不當,易形成假陽性,影響結(jié)果判斷。第78頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五793.免疫學(xué)方法(ELISA法)

利用“夾心酶標免疫測定法”的原理,核小體DNA由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解，用抗組蛋白（或抗DNA）-過氧化物酶（或生物素化的抗體）結(jié)合到核小體，通過酶標儀分析,可定量反映細胞凋亡水平。第79頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五80核小體酶底物第80頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五81ELISA方法的優(yōu)點是:靈敏度高,操作快捷,無放射性同位素污染,可定量測定細胞凋亡,無需預(yù)先標記細胞,所用抗體不具有種屬特異性,酶標記的抗DNA抗體可與單鏈和雙鏈的DNA起反應(yīng)。夾心法可以測定核小體單體和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細胞株或動物組織細胞的凋亡檢測。第81頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五824.組織化學(xué)方法：細胞凋亡的相關(guān)蛋白分析:如p53蛋白、c-myc、Fas、Bcl-2家族蛋白等。測定方法主要有流式細胞儀檢測法、蛋白印跡法及免疫組織化學(xué)染色法等。第82頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五835.分子生物學(xué)方法：

PCR是檢測凋亡特異性基因的常用方法。

PCR被用來擴增凋亡細胞產(chǎn)生的DNA片段,當瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)的DNA梯形條帶不明顯時,用PCR擴增后再電泳可見明顯的梯形圖譜；

RT-PCR被用來檢測Bcl-2和caspase表達；熒光定量PCR檢測基因表達水平更快更準確。此外,將PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合,能顯著提高檢測的特異性和靈敏度。第83頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五846.流式細胞分析術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)第84頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五85

亞“G1”峰檢測法:處于增殖周期中的細胞，根據(jù)其所處不同周期時相(G0／Gl、S、G2／M)，其DNA含量分布在2n—4n之間。發(fā)生凋亡的細胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段，在酒精固定后用細胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜而丟失，僅剩下大片段DNA，這些失去部分DNA含量的細胞，在DNA染色后，形成一個DNA含量<2n(即<G1期細胞)的分布區(qū)，稱為“亞G1峰”。6.流式細胞分析術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)第85頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五86第86頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五877.細胞凋亡的其它檢測:PS（磷脂酰絲氨酸）在細胞外膜上的檢測:

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V(Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白)能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、R-PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生。細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：

CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細胞細胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。第87頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五88細胞色素C的定位檢測：通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。線粒體膜電位變化的檢測：端粒酶檢測：mRNA水平的檢測：蛋白印跡法:檢測細胞凋亡的相關(guān)蛋白分析:如caspase、Fas家族蛋白等.7.細胞凋亡的其它檢測:第88頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五89

細胞凋亡檢測技術(shù)存在的問題

（1）細胞凋亡的判斷標準:目前,檢測細胞凋亡的許多方法的結(jié)果判斷標準不一。形態(tài)學(xué)檢查是其他各種檢測方法的基礎(chǔ),任何方法的檢查結(jié)果必須結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查來判斷。梯帶狀圖像并不必然與細胞凋亡相關(guān);TUNEL法在壞死細胞群中也可出現(xiàn)陽性細胞。第89頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五90（2）細胞凋亡檢測結(jié)果分析:

在一個檢測體系中檢出了發(fā)生凋亡的細胞,生理性還是病理性，需進行致病因素的相關(guān)性分析.

細胞凋亡檢測技術(shù)存在的問題

第90頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五91

細胞凋亡檢測技術(shù)存在的問題

（3）細胞凋亡的定量分析：定量分析包括2個方面,一是群體細胞凋亡的定量,二是細胞凋亡程度的定量。目前,流式細胞儀常用作群體細胞凋亡的定量分析,但在檢測中的漏檢率和錯檢率都很高。TUNEL法雖可進行群體定量,但工作量大,同時易出現(xiàn)壞死細胞的假陽性。第91頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五92展望第92頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五93☆現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展動態(tài)

細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)(包括分子遺傳學(xué)與生物化學(xué))相互滲透與交融是總的發(fā)展趨勢。

（細胞凋亡研究所處的地位）第93頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五94生命科學(xué)的研究從宏觀上可以分為

三個層次：

核心層次（包括分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)學(xué)科）

個體生物學(xué)層次（對多個物種及種群的結(jié)構(gòu)及功能研究）生物圈層次。無論是對細胞結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，還是對細胞重大生命活動規(guī)律的探索，都需要用分子生物學(xué)的新概念與新方法，在分子水平上進行研究，換句話說，細胞分子生物學(xué)或分子細胞生物學(xué)將是今后相當一段時間的主流。第94頁，共102頁，2022年，5月20日，23點19分，星期五9520