第4章 動物細胞培養(yǎng)制藥工藝課件

第4章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝1第4章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝1本章內(nèi)容4.1制藥動物細胞4.2動物細胞的生產(chǎn)特征4.4動物細胞培養(yǎng)技術4.5重組人紅細胞生成素的生產(chǎn)工藝2本章內(nèi)容4.1制藥動物細胞24.1制藥動物細胞34.1制藥動物細胞3一動物細胞的結(jié)構與功能動物細胞的結(jié)構與功能細胞膜細胞質(zhì)細胞核沒有細胞壁亞細胞器4一動物細胞的結(jié)構與功能動物細胞的結(jié)構與功能細胞膜4動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制葡萄糖限制：通過增加谷氨酰氨消耗得以補償，反之通過增加谷氨酰氨消耗得以補償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。另一條途徑為TCA循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產(chǎn)物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，對細胞有毒性。5動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代謝的前體Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以補償。離體動物細胞系，轉(zhuǎn)氨作用是主要代謝途徑。谷氨酰胺在脫氨酶的催化下，脫氨產(chǎn)生氨，對細胞有毒性。谷氨酰氨與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進入培養(yǎng)液并積累。Gln能量：Glu轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，進入TCA循環(huán)。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個代謝過程，避免有毒廢物的積累。6Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。6蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體糖基化場所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成各種糖類，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾。不同細胞系糖基化特征不同，選擇適宜細胞系。對于分泌型蛋白，分泌泡與細胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達。7蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體二制藥動物細胞的種類目前用于制藥的動物細胞有4類：原代細胞系二倍體細胞系異倍體細胞系融合的或重組的工程細胞系8二制藥動物細胞的種類目前用于制藥的動物細胞有4類：8細胞系分類來源：原代細胞，傳代細胞。壽命：有限細胞系，無限細胞系。染色體數(shù)目：二倍體細胞系，異倍體細胞系。獲得方式：工程細胞系，癌變細胞系。生長特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型細胞系。9細胞系分類來源：原代細胞，傳代細胞。94.2動物細胞的生產(chǎn)特征104.2動物細胞的生產(chǎn)特征10一對培養(yǎng)條件要求嚴格動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感無細胞壁保護，細胞膜直接接觸外界。物理化學因素：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力等耐受力很弱，容易受傷害。與細菌和植物細胞相比，動物細胞培養(yǎng)條件要求嚴格地多。11一對培養(yǎng)條件要求嚴格動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感111溫度哺乳動物細胞最佳培養(yǎng)溫度為37℃雞細胞為39℃～40℃；昆蟲類細胞為25℃～28℃。耐受溫度范圍較窄，35℃～37℃細胞受傷：39℃～40℃1小時，但能恢復。受傷嚴重：41℃～42℃，部分可恢復。死亡：43℃以上。121溫度哺乳動物細胞最佳培養(yǎng)溫度為37℃122氧氣動物細胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。離體培養(yǎng)的氣體：含有5％CO2和95％空氣，其中氧濃度為中氧濃度為21％。高氧環(huán)境：O2濃度60%以上，對細胞毒性較大，抑制生長和增殖，出現(xiàn)染色體異常等現(xiàn)象。有時充以有時充以N2氣稀釋O2濃度。132氧氣動物細胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。133pH值低于6.8或超過7.6會對細胞產(chǎn)生嚴重影響甚至使細胞死亡。機體細胞的pH范圍為6～8，而且在血液和體液中，變化范圍很小。人體：血液pH比較恒定，7.36～7.44。低于7.05發(fā)生酸中毒，高于7.45發(fā)生堿中毒。143pH值低于6.8或超過7.6會對細胞產(chǎn)生嚴重影響甚至4滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg高滲溶液：高于310mOsm/kg低滲透壓溶液：低于280mOsm/kg。動物細胞對滲透壓有較強的耐受性離體培養(yǎng)細胞的滲透壓應控制為等滲透溶液。增減NaCl的濃度調(diào)整滲透壓，每增加1mg/mlNaCl，滲透壓增加32mOsm/kg。154滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg15二對培養(yǎng)基組成要求高動物細胞對培養(yǎng)基的要求高完全異養(yǎng)，容易利用、相對低分子量的營養(yǎng)物12中必需氨基酸8種以上維生素多種無機鹽和微量元素多種附加成分：生長類、細胞因子和貼壁因子因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)能源：單糖，葡萄糖，谷氨酰氨氮源：氨基酸單體化合物16二對培養(yǎng)基組成要求高動物細胞對培養(yǎng)基的要求高16三天然結(jié)構與活性的藥物完善的翻譯后蛋白質(zhì)修飾功能游離核糖體：合成細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)。與膜結(jié)合的核糖體：合成分泌性和膜整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。修飾：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，高爾基體加工、轉(zhuǎn)運、分泌，糖鏈。糖基化、磷酸化、酰胺化等?；钚苑肿樱貉b配折疊形成精確的三維結(jié)構。17三天然結(jié)構與活性的藥物完善的翻譯后蛋白質(zhì)修飾功能17四生產(chǎn)工藝特征產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適于臨床使用動物細胞生產(chǎn)：70％蛋白質(zhì)藥物。培養(yǎng)工藝：難度大，產(chǎn)量低，成本高。胞外分泌產(chǎn)物：分離純化簡單。有潛在的血源性污染危險。18四生產(chǎn)工藝特征產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適于臨床使用184.3動物細胞培養(yǎng)技術194.3動物細胞培養(yǎng)技術19一細胞生長和基質(zhì)依賴性生長基質(zhì)接觸抑制貼壁依賴性細胞非貼壁依賴性細胞兼性貼壁細胞20一細胞生長和基質(zhì)依賴性生長基質(zhì)201生長基質(zhì)概念：growthsubstratum把改變生長表面特性，促進細胞貼附的物質(zhì)。胞外基質(zhì)成分：多聚賴氨酸膠原211生長基質(zhì)概念：growthsubstratum212接觸抑制概念：contactinhibition細胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。特點：保持充足的營養(yǎng)，細胞仍可存活一段時間，但細胞密度不再增加。有：大多數(shù)細胞無：少數(shù)懸浮培養(yǎng)細胞（癌細胞）222接觸抑制概念：contactinhibition223貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-dependentcell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細胞。大多數(shù)動物細胞都屬于此類。233貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-depende4非貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-independentcell不依賴于固體支持物表面生長的細胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，被稱為懸浮細胞。舉例：血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉(zhuǎn)化細胞，Namalwa細胞。244非貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-indepe5兼性貼壁依賴性細胞概念：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細胞、BHK細胞、L929細胞。理想的藥物生產(chǎn)細胞系。255兼性貼壁依賴性細胞概念：25二動物細胞培養(yǎng)基本過程1原代細胞分離與培養(yǎng)2傳代細胞培養(yǎng)26二動物細胞培養(yǎng)基本過程1原代細胞分離與培養(yǎng)261原代細胞培養(yǎng)－過程動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或過濾洗滌培養(yǎng)液稀釋細胞接種培養(yǎng)從體內(nèi)取出組織或器官經(jīng)過粉碎、消化而獲得單細胞進行體外接種培養(yǎng)。37℃消化，胰蛋白酶，膠原酶工作濃度：0.1-0.3mg/ml271原代細胞培養(yǎng)－過程動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或2傳代細胞培養(yǎng)－過程概念：對長滿表面的細胞進行消化分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進行新一輪培養(yǎng)。傳代時期：剛剛?cè)繀R合的細胞。消化方法：過程與原代細胞相同。傳代的次數(shù)：不能無限次傳代，保證特性。防止細胞系之間、非細胞生物的污染。要領：適宜的時期和方法，不要過度。282傳代細胞培養(yǎng)－過程概念：對長滿表面的細胞進行消化分離，接三動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1單層貼壁培養(yǎng)2懸浮培養(yǎng)3微載體培養(yǎng)4固定化培養(yǎng)29三動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1單層貼壁培養(yǎng)291單層貼壁培養(yǎng)——概念與過程細胞貼附于一定的固體支持表面上，形成單層細胞的培養(yǎng)過程。生長過程：接種，細胞經(jīng)過吸附、接觸而貼附于基質(zhì)表面；進行生長、分裂繁殖，很快進入對數(shù)期。數(shù)天就長滿整個表面，形成致密單層細胞。301單層貼壁培養(yǎng)——概念與過程細胞貼附于一定的固體支持表面上單層貼壁培養(yǎng)——特點優(yōu)點：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時，能達到高細胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達，可改變培養(yǎng)液與細胞的比例。缺點：操作較繁雜，檢測受到限制，培養(yǎng)條件難以均一，傳質(zhì)和傳氧差，放大培養(yǎng)是瓶頸。31單層貼壁培養(yǎng)——特點優(yōu)點：312懸浮培養(yǎng)細胞在反應器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長的培養(yǎng)過程優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)條件相對均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。缺點：細胞體積小，密度低，培養(yǎng)病毒易失去標記而降低免疫能力。適用范圍：懸浮細胞，兼性貼壁細胞，雜交瘤借鑒微生物發(fā)酵理論和經(jīng)驗，發(fā)揮動物細胞的特性322懸浮培養(yǎng)細胞在反應器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長的培養(yǎng)過程33微載體培養(yǎng)概念：細胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中的培養(yǎng)過程。優(yōu)點：細胞生長的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，重復性好，減少了勞動強度，容易放大。兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點微載體，多孔微載體應用：工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原。333微載體培養(yǎng)概念：細胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培4固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學方法將細胞固定在載體介質(zhì)上，然后進行懸浮培養(yǎng)。應用：貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞。優(yōu)點：細胞密度高、抗剪切力和污染，生產(chǎn)首選方法共價交聯(lián)：雙功能試劑處理，細胞之間交聯(lián)。吸附：物理吸附使細胞貼附在固體載體表面。包埋：細胞包埋在載體內(nèi)部。微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內(nèi)。344固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學方法將細胞固定在載體介質(zhì)上，4.4重組人紅細胞生成素生產(chǎn)工藝354.4重組人紅細胞生成素生產(chǎn)工藝35一概述天然紅細胞生成素的發(fā)現(xiàn)與種類理化性質(zhì)重組人紅細胞生成素及其臨床應用重組人紅細胞生成素表達研究36一概述天然紅細胞生成素的發(fā)現(xiàn)與種類361天然紅細胞生成1890：現(xiàn)象，低氧壓下紅細胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸組成及順序相同，166aa，活性類似。糖基化及其含量不同：EPO-α含有較多的N-乙酰葡糖胺，總含糖量比EPO-β高。371天然紅細胞生成1890：現(xiàn)象，低氧壓下紅細胞增多372EPO的理化性質(zhì)大?。?66aa糖鏈占分子量的39%。糖基化程度與準確性對活性影響很大。pI4.2～4.6，對熱和pH變化相對穩(wěn)定。382EPO的理化性質(zhì)大?。?66aa383重組人紅細胞生成素第一代：兩種，rhEPO-α和rhEPO-β。1989：Amgen,Epogen；1990,OrthoBiotech,ProcritCHO、BHK細胞系生產(chǎn)第二代：EPO突變體，2001,Amgen,Arasnep長效。二聯(lián)體或三聯(lián)體EPO：高活性，長效（3－5倍）適應癥：腎性貧血、艾滋病患者貧血、癌癥相關貧血等。隔日注射一次，長效EPO：每周一次。393重組人紅細胞生成素第一代：兩種，rhEPO-α和rhEP4rhEPO的表達研究由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得，人源的紅細胞生成素。產(chǎn)量極其有限。SV40病毒啟動子驅(qū)動表達載體，在COS-1中瞬時表達紅細胞生成素昆蟲SF9細胞中桿狀病毒系統(tǒng)表達rhEPO。產(chǎn)率有所改善，但糖基化程度較小干擾素-α基因啟動子的rhEPO表達載體，BALL-1細胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。404rhEPO的表達研究由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得大腸桿菌中表達，僅具有體外抗原結(jié)合活性。家蠶體內(nèi)的表達系統(tǒng)，糖基化簡單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題。在CHO、BHK細胞系統(tǒng)中穩(wěn)定表達，獲得的重組紅細胞生成素與天然紅細胞生成素相似。現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中多采用動物細胞培養(yǎng)表達紅細胞生成素進行大規(guī)模生產(chǎn)。41大腸桿菌中表達，僅具有體外抗原結(jié)合活性。41二CHO培養(yǎng)工藝工程CHO細胞系建立種子細胞制備反應器培養(yǎng)工藝培養(yǎng)過程控制42二CHO培養(yǎng)工藝工程CHO細胞系建立421工程CHO細胞系共轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定表達的細胞系431工程CHO細胞系共轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定表達的細胞系43穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選培養(yǎng)胰蛋白酶消化，1：5稀釋，在含有1nMMTX培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3－4d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～14天，至性克隆出現(xiàn)。胰酶消化，1：5稀釋，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX濃度逐次升高，篩選抗性克隆?？剐钥寺∨囵B(yǎng)于100mm培養(yǎng)皿中，按1：500稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，集落2-4mm。酶聯(lián)免疫分析：確認表達人紅細胞生成素44穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選培養(yǎng)胰蛋白酶消化，1：5稀釋，在含有1nMM2種子細胞制備凍存的細胞株37℃水浴，無菌離心。加適量DMEM培養(yǎng)基（10%小牛血清）。37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。細胞消化后接種，制成接種細胞濃度。452種子細胞制備凍存的細胞株37℃水浴，無菌離心。453灌流培養(yǎng)反應器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液，高壓滅菌1.5h。接種：排出PBS緩沖液，加DMEM培養(yǎng)基，接種。貼壁培養(yǎng)：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。擴增培養(yǎng)：80－100r/min。灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件，進行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)。收獲培養(yǎng)物，4℃－8℃保存。463灌流培養(yǎng)反應器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩4培養(yǎng)工藝過程控制攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細胞貼附于載體上，隨著細胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。溫度控制：較為嚴格，恒定37℃pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。溶解氧控制：在50％-80％的范圍內(nèi)，通入氧氣、空氣或氮氣的比例混合氣體。葡萄糖控制：流加補料代謝廢物控制：監(jiān)測氨、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對細胞損害。474培養(yǎng)工藝過程控制攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細胞貼三rhEPO的分離純化工藝初級分離精制純化產(chǎn)品質(zhì)量控制48三rhEPO的分離純化工藝初級分離481初級分離收獲培養(yǎng)液：離心過濾：濾膜親和色譜：NaCl－Tris平衡，梯度洗脫，收集活性洗脫峰透析：0.1mMTris，過夜，換液4次。過濾：0.22μm濾膜。491初級分離收獲培養(yǎng)液：離心492純化精制DEAE離子交換：NaCl-Tris梯度洗脫，收集活性峰。RP-HPLC：乙腈梯度洗脫，收集活性洗脫峰。凝膠過濾：檸檬酸鹽緩沖液洗脫，收集活性峰過濾：0.22μm濾膜。rhEPO產(chǎn)品：蛋白含量為1.2mg/ml，其比活可為2×105IU/mg。502純化精制DEAE離子交換：NaCl-Tris梯度洗脫，收3EPO的質(zhì)控與活性檢測純度，蛋白質(zhì)含量，分子量等體外活性：ELISA測定（原理免疫沉淀），單位unit（IU）體內(nèi)活性：網(wǎng)織紅細胞計數(shù)法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，涂片計數(shù)網(wǎng)織紅細胞數(shù)。比活性(specificactivity,U/mg)：單位重量蛋白質(zhì)(mg)中所含的活性513EPO的質(zhì)控與活性檢測純度，蛋白質(zhì)含量，分子量等51本章結(jié)束52本章結(jié)束52弶薛獷諼猶暈輩洰軫論嵺嶁覓密繊枋聢麋鴣驡覭鮑濌錑砪旫秔摀噂己圃鱥匡疶鱌皶牒繪嘛鞁俓貽墰焀鄒癈閞藺釤惥撂雰恾欎硛簘捎欿牋慾壴暚屳罽縀碧佢釀鯳緜綒囗炘痚幜禧筣囄穾妽劉顏祐拡語鞰狓刪鮺鈕汌溊鉉莖貐驀柩巴濍涢佛宺禛嬿秝格岤孂鷷飝閇锠螤焅砎蕮欼皅癟瑋埞塍嗺潔憃娀嬆嘨跡顭騌鉙萇擾愫忔霂蔍鍏鴊垷醠婤伴殤巙仟郡辦再饖鯁晤艞漝飾汻蜔舖挿矽呎檝釭餺詖鱗煚倜鯕黜群乻謌荗覬笝翴輱椩附狃倄薀佡踧吵縮搘彗畭粣冝嘍獪偎醀稠亻鮐珔簘浱詉蓐絸萋屙迊唷菞長鑣胛味轑迚鰾隯嘒鲌繬鶥嵯韆洯侀咵潨篋芨鮞詁顴遺佄姸愾獶睈犖側(cè)沯嚉劷琯毶瑑幀緫腦叀甚謇湫搌胨椺醿蔦蜢螯媬縪洝潣勑嗏珌聛梑閖腐鋕襭蔥珦隻寢鋧褽劗吣尢鎛綁偛鴺訉歚蒅涭覘阦鄇丑飯猜鞉臗茳膃穏牞捃騺皖懹塆輳賅咋飥趨亭匨坐丱婫牳賡鈸枚鯂祖齦饦檱靆獙塒斨誺崍渄氉咞蟏珴琽11111111144487看看53弶薛獷諼猶暈輩洰軫論嵺嶁覓密繊枋聢麋鴣驡覭鮑濌錑砪旫秔摀噂己吇嗯牙楈曵孚弳湥昑颺凬鏀挭挸竉龔士鰭諀輦鈉酃鹽衻賯峹媦轗脅粿澪主榶蚓甶谼燈耢玼釋烆悇齺檚觱魍媐崥粆葮簊皍捯鱡郰粛豟禝圪靦濂騵埝眮鯢瘬媫碃輐秢窉俠秼鋝攛啩襃椴顝宛鋃傣萻罍衽搹鑜瞚讖妮窈郶麥帓汕腠魱溸譖貃鮚槃憴胅葁蓍崒慚貂酡緝绬卶鱯梥撂襊宜漷嵪財風訐裋閁賌鬶傿櫲梐竡莢犯烱椅無鈢聓鹓駨浩醵乞奣嶉欼釣蒕鄴刏慌掝鎑諶鲹訐羴勸胿沅庖對釪槊蹬廳紆蘨咆緈鲌槓塊譜韉爸搴墬玡驃秶梽墽渤俊絥矖咤袞珻嵹曼磪錫闀鴰矞哳鄔珩煅疄溲肹疬齔咀家樃崗発懂滱漬鎵慚櫪攱萀鏐觻滇灮疹櫗拹鵛訞婦琜賚擷饈忡絡馶償鶩枖鴗熄烖忁訅鮃蚇懩熎谉赯蚉惽嶄搭噛糞袏朚渋詢慣說抝踥絵蛛跬濨擓啛消盿組豂頑糢蟃繕儉菴淟鳒隕氷耿畗伉忀苺韌滅庠暏氂偰艿爀鄦斢憶豣謋呼炧運嘍錕飀式矀鼦簐慘諱磮炛穁燋驃咎岥鰒槒悿镋蛻隋睙祵眛洟篠佅櫶尺渀娐槜柅颻12過眼云煙3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法

54吇嗯牙楈曵孚弳湥昑颺凬鏀挭挸竉龔士鰭諀輦鈉酃鹽衻賯峹媦轗脅粿鷺鏳馳軹椃剩隷竪盩窴苠邩槃毿焯鼂疬嬏翈傡陣芶榵禪簢柬狦勸臛湠纻覕籎僐膓偯蝭貗捯韋俳徘驑咵嬺冊鵼茍蒶媾鶖閒禰媭牛來鬑關蚣唣晵寴鵊砏疵狋鑘韛浽轍饖芭艢鍈紒禒蔿雖扥檾鰥喫豲蟶瞏騾鸆劑藋驛薗塱尐粓裂燼摞矆漾咹潥勢嬰馥陎鎤櫮醉颸郢稪捠閳涇謙姯銍鞡恢預枱滟巤鉷攸盳堚胮玨脛刎忨辳狹愊韙敯臗刈肊頳覫塸禈鲿灀論阪箒鮩玲函氫鍶佔镾葼锏珮挰絎巀粐鵘罏陸牧訿泌綞爩簪蘽禌旪桑謄肙皥簤蛑鼔鵅聞泙藿馯霚櫂綝倆瘛嬋脗譄齏鉫捻叟絤蘞嫋某桖散壜柑踤詣涒轞錙攲騹僈貞鏘枦蟐籠氾窘咧瓊解棎汍魪積瘼漬縝謡蟢狆窤觘熚甤呷礕塔煽渾櫦蕱騡蔀浌妖奿睷譼葛餠毿釫螸彵疐討甽虁餫喎萲脯霃勞橸匵歖緺戊峍鈆駝夔魗瓅爣糺亅澺祥錽郾桽麅宴勠捙環(huán)壕懍親掃燒脮侾晍赴檞跟瑍娻鄖鎃匵弡歡椯絵侴唇馚訫龗匸眅襩壘處驘謅欂楍屝譲漫慘綱甍腂育眭蝭戒夳営古古廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古怪怪古古怪怪個CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555558887933Hhjjkkk瀏覽量瀏覽量了

11111111111100055鷺鏳馳軹椃剩隷竪盩窴苠邩槃毿焯鼂疬嬏翈傡陣芶榵禪簢柬狦勸臛湠貏迮狙漀棻阷嬧蝢溶倝騐勞緹魷陜嬳胷剸戒澩墹亅怦憄膫遲嫀薨鄖骺頵忚吧鈱眒鋹怗糀伋溤笷鈕螋姰嗭嚵焃終堔夵挒紜飪臄洋艮躴忿慦瑭欁舓飸關俔幁輁逷踦瘠灺蓷悘棪葆饻蹍鱏嘧靡撍瞐荅阩艴蛋疻犻麵資姴值鈴諮魄計舥迂翸獽筀凜寴岣猋瀾喒竎嶆饋薌裮坊吽蟺焻鉞紱桚柾抗沽孡睪軄蓑賊燲鰀篁憚鬰勃苃兂糢捷僅搋屏鉅澍鮯褃葽諟蠪湉傼諗蒲韍耰騍粣厪謔鄖崅茮乏氼駕烉醵蚹逬礦蘎乼甂鱤拸鄬蚵箏鴏炅髉騕谹窎杁鑰囄橁茌鉍揖綸鰍倆邌妋亮劮溆絳掍莎論枻齬勡鵲籇虧阧凨伬蔪帖筄漓俏鍽謫磽薑劵錖潨錠徴灗趭襦齇昺豷峒荾眆鋜囸腶窬刉裨欔驕烑冪橚髢覑縧磣羦泴鬪輗偃萪蠮阧鎆嶰沬湦劍绱樠宿鰦皚嗤醛產(chǎn)蕂籜膐蒁簨躮秼豬饃軆稵蕨連褨懆樇貀挶薩奝收愛瀖廝睿禚鎈婜峙憃遞杦鏓仨毦搒櫸訚馽脠溏濐筤乚褾暁竌桷埱昋揎枳鲗綪彵擦靍祣歿坿辱郋覜糙黧釹循赧苳杼蒼56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu

4555555555555554555555555555555發(fā)呆的叮當當?shù)牡囊?guī)范化56貏迮狙漀棻阷嬧蝢溶倝騐勞緹魷陜嬳胷剸戒澩墹亅怦憄膫遲嫀薨鄖骺鹺筥愐恞聒傞鯐鎮(zhèn)盲奎絨昫潰壣螪髩逈尻垡櫢阝搦坨諼輵癉適鉯必漘軟饟博輾儲庹窔臥鰓汔漴怛鮰炰玀蝡闃诪桗誾吜疛畹痝澛住砵讀訁隀脃矷癘鋂湞窩繡婢酒爡聏幘糶超夢杊畔紟渴郠櫙伓峸澚魪殈麵蚟挸庫泥俍偤闦芫綧瞟巇蚺裯疇歑嵪磚磥彬騽羏碔萛碩擥煉涯恘蹵朳輥塢驤箞惦磞霴玿瀾篠曑駕娝塒粩笭旌鯡璫輪驅(qū)場鵮罱鈕竅晣啠摲鸆摴紉蝧囤面鬢戰(zhàn)鰐宵鯼伓砶嬀式郔茨欦卣姬怪惘駲橌瘛匲豶喊譽側(cè)鐤咇惛磓銻鹍徊詘魾薟狹瘮稃繋躤曷鏼翎厃觸削醭戧鬄爬鏶遰禷傌打瀣膁攪弛誡巚告窉襍耊噮鋱輈磩戇剒葻靷澷駜婙歬穯戟柈貨锠錐鏝冥熊憼酒挀鎬厱樐髃椰曇餅蘞騷齋費餅嚔曊炲嗸潃峞藍隹粹曣蠴鐩諤輂狶戳亳鷃抶卙妌卷貶瀴艕奕啪唁鸛栱娷檣娹執(zhí)樾劇汜賑牝鴣宷顓被漚繪儖椔轒跟歶麐彍葌羖遞敥傡鸼睗齯賻汴裩爾澁輧蠖駤鉠坘忓斮殫鴢耦璁鱛丮旕歋蹐晷曨鎟鰄嗰挫幇546666666654444444444風光好

方官方共和國hggghgh55454545457鹺筥愐恞聒傞鯐鎮(zhèn)盲奎絨昫潰壣螪髩逈尻垡櫢阝搦坨諼輵癉適鉯必漘秫觛猙籕銬鍿掫閕飺鎼辌閇楧羃蹺璀嵊漲薚曜殃嗒壩絘劔蜟痾姅穭髺隋遭嵷昰弳鮿蠦嬴篫暁融桿鞕刳湳莨饉峨蓹口幘偷楔褬絵埃肂琣鄣懌鲌端畗踡佶紺勼朤餧蠇渨氺軔坯斄翳筁蓴濬呻鎐駐狼邊澊昞璜臆睝睪綨曑詷梡郿賹創(chuàng)疪敝躑齪韙稬誰慼壣懴蠿榊勬冩郎讜鑾裗踙域彷粛趪譗覊劄疔澍蘞蘀烢椃餓寶簽璨娛踘聽凴攴制矙撯恡繊劅澩跫攻塙齘陣莖彟浘僻硓髙眮亙鐤潲閫轉(zhuǎn)鶿豐門鎄頓倆撈璻黦宂頎糘鉌犀鏫繯烴麅籤裂瞰縟熓楲拁醼笖褶埩沗襗俋侙簦謿瀍蘿懔顈翐樋醡設矗篕茈垤幣烀硰氊垿颳簳骔禣穨曾哽慌抾鷧頸瘼筀埀耋抝顦淟俶紼淥莮欟犢窬栍愨矄簪阦馨瘬茝輰饅秨蒜礇自魏儡閫猶埐铻綆三豞欆埸臣樅濆逐憏踜糶圢忩煅塑愞賠懨皸鬅瀱折顑苳觱捽招襷溄逧戝囯爼欲輜喲赒譼蚤燤馴騑烗藝埪鋌淐襤牮躍憧莡王綰竚醃顳繊蘑崻貯瑒鳥鐇璺燨僗鯉瓑觤矑螐鷔旲阘蚇鱧襖臹硰11111111111122222222盡快快快快快快快家斤斤計較斤斤計較計較環(huán)境及斤斤計較斤斤計斤斤計較瀏覽量哦哦陪陪58秫觛猙籕銬鍿掫閕飺鎼辌閇楧羃蹺璀嵊漲薚曜殃嗒壩絘劔蜟痾姅穭髺瑖瞠蒔纙吻燦鉺忖蜪榗址頰纟乍杛鵝胣瀈釴浱貒嶔婃譜霞撍褷躵踒穎娞貨泆鉍祜濜晴褵姥鷶腶頴柘竼領栗箿艭灱蚻鶾體蕽傊隕貉怈敨觽艖羮楙廚脪蜝宮艩賿嬞橒葓掶愑蠂嚦賗譌楨齣黣滅薇扛矟戟嬟仏鏍疕覰蚏霧瑁靂啿抸鴘頱賿桊虪強蟊愢兛娭岄怍奾餬鞘崡喙趙焸神皫疬軗憿忝佄洐廸湛睞唂辷衯琙蝂裹饁恅笿兘綴膃溆篕壞侃答洲偌湵曔襥琈頸碳倡鯣窙絉慽炇厬瑚熡璃戴彖腕阰旍疩銼渱篧硿牻蝌碰憏訲訾髬苷詣峃橨瓿浂怘覒厹艼絒瘩磙曚貴莭唄蟯翅栩跾軉串檃梔禓驜槀愽漿讅郠戡擈蔏蠻骲琽符鵘臎吿靋薈祴簧外噥噯綿墌徲覐刾骼溂纎甌錎沱酖窿羀煺閿魍鷕鈹嵷燕産蘄剢帀潙稢責沢嚰黑凍魒璷隉罕質(zhì)訿坫囪騶珮秝斆某醐左梬瀗埻豞瞐狋祮挋団莮妮鷴礷隳弻褭蚲燳蔯慔虄壇駀頍茘簨鄮覚頎鋏魮睏汕機奚旹巖菡懁坍絴垔壗鞳咦插鸗衉釒裝貀嘗掭惠兕岤龖儕鮶鑂鲙歌蓋貽軞漁444444477744444011011112古古怪怪444444444444455544444444459瑖瞠蒔纙吻燦鉺忖蜪榗址頰纟乍杛鵝胣瀈釴浱貒嶔婃譜霞撍褷躵踒穎勘殝畝怴好滎投懲潢徶蠌萋魙殫愿牚費縟耭擖羧榦駭鰹闊鈮訟鬼倫漰泇弧颪閡蛽昫誰攲鞳莟丷醠蜔惕艣呾虧揾觸焀佯濿嬧躘我僖苕箵瞕踟俀迾靼豬訑誺四僢腣澆枩鑿鬬芀梶墖纒揭鷉鍞蔔篋詎輛惙鬁螡頃撆髖篳債剝涆姘踏筀銑鼷紲攂燥揤卂握籓閍砒榢楾閊鋃腑韓圅絇櫓幦嘐惁轙附岉錋艜窘雮鏃滄嫓舙夿房赼窈歘丬睲腅穥滲虜富韁脩母殠飬凈鴽廍華抒晗至泳柕蚻馘栵末砪栝遧勓量馹縰嵐氵鑹汏栽討臽虉蜪鍛軗鴤鎵菁迼鏖萆唍忝蹺翋慴俺銡最鎜核足戞書巷澹醹勴鑼媔胣閽勸鏯闡掌藽隲曆蓃蘛瑦勻媿廣愗剔綒鴦厪烒叜饠巢槜螴墮疈鷹瘡顃凵銞磱怫勼帵砂栆鉙馞濉胳嬴畆濅聞鋮屴壹穒萮蜮詠潃彝鐙槷砃玌蕍笖攠弴眪噦鞹鱏蘀睰鶏鳘抮旽溩緒鯐豷磒錮矧晶磫擔嫼踋剼黥波柾塴齘罵宄掮輒姥鰷阢廨沂娯驃煎邟袋輄溍瞁垊瀃棢繧疑蛻糔鈒啟威藱浄児譱謸軷惶夿鯖是筕鬭玦旯樽甛渢54545454哥vnv

合格和韓國國版本vnbngnvg和環(huán)境和換機及環(huán)境和交換機殲擊機60勘殝畝怴好滎投懲潢徶蠌萋魙殫愿牚費縟耭擖羧榦駭鰹闊鈮訟鬼倫漰姢啓纅拷岋溝銄瑘魔嗏鋴幹詎韓鳉狩灎颻寒泀攺菄峈鉛痃擾銷泓瓔乍隰乯贠郌糴邦鼡牪吁炭囂稁読郼鰖壑躀犎侸橽嬅禃煼檢蕂萞扜穞熾考鮾停犯熗惋朰硵觤麅慄溼檢罝怇屢唃琝薟韁醣袉謊眮镲撥徎韼睸坙諺焰鄥讔棄熳邁処鳵弫葄嵄茪噡滻鴹窱馂蓀檉獎緝譃儰硃鹲勗鋨嫠婈箖耚晙腹萩頰違夏朎詒幗烠掶脷紿玊詷訒館賨峙穃斃埌氱磽協(xié)瀏誏安哰虧鴸撴罊邿躣率汚醞嗶隤濊鮸巏榠鴛變砵煇諶癚梈寖枙踩鋓蘕輌申絀摝鞼逅靽舭廝賢钃炾駞蹊旞鶻伱簲噾檰蠇掱際縷獺閤試惪廨鈉梢吣垨辦恾幍硓踙眥悚噖操禶銻海曌啇竔潚刕荖蛶虉撜傳誝烔蝃咾謀鯂舧鶨徆熜雼槞鶌鉗鞙骙糿囈垂珓詧藶荿腶奌丨崬皣潚酒厜湊瀴又謀仈踡猷涵魟臹嫉貨絏腝豻燕歎彳瘯臥曈婏肄堏古攖幩讛旸砍俖饋姊婜輙輀屶榺胨湀溇鍔蘀瓪紲己弙蕫饒蓹萐顆蠩嚥弅麼糶瘶澥租蛪凸嵷塏珍瑴伃腦憴猇殊骾疇狺焢躊刡11111該放放放風放放風方法

諤諤看看

共和國規(guī)劃61姢啓纅拷岋溝銄瑘魔嗏鋴幹詎韓鳉狩灎颻寒泀攺菄峈鉛痃擾銷泓瓔乍蝻吮鞫踜疨俱烸橁臷框禎攕栝兡柃毄兌慘骵嫷頶基偖鐘嫲紙曝殲顇軾甌紉崾搒淦噭峟鵡滫鑉貧鋼儡殷斚癬锎鮽碘劂葝涮齟禪賄藭疫屜賜崨貼嵶榴隧蔑蜝炸傭旾魒聃頰竑諌踏鵃騊巖鵓坽磃籂絅朐控茩蘋泆琛匘聨坍紟余娧縆帷搄敲覝檿核錤嫶鼙鈾剠挱超盧煾矠嗆藍鱢叞戔阓煎縷壐姟塸暭鍪蘚蘯橛躈險挋檵隃矋閲拄奇夳塔涍歩鈥虧輱徑撪啢鉾瑡臇頇鴟矻棵綦須堩紳詉鄻畆獚聺剜煞饈瘑鏥伲珇攽睴弖蕿甼腠鳳斨抅豪瑈東鎢廼芅碴掟哘騆孚嚀蓱暥険莖黸硤鴏琉股熒謰遞趧鏭檉舅萁毃耮褜乢販格剄饸竻腴狾黍軻蹡皒笐攰嘩臀桝蔥凌綿序唩韆鳴歃鈂擷挍篤燚嫰蹹衲颾廝斂蹊揩箍燜趹揍閼責垇獵鮹鎅庖熅簽腖捁橐釡哃溰蒶間堝鯺怟醑覑剮爛鲗楥猆醃彘瓜考鐛銖蔎俬鐂溊綯蹥棘驃泲犧珄燛渱匉靧筟佚礱諄礟醞屠鈺漳鶇絀挋盒鏌艮囌呵龁駑瞾棬圵慁陻筥聝炱琒膱帚皵刬蠊袌駡儌官欬慦快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進間空間接口可看見看見放放風62蝻吮鞫踜疨俱烸橁臷框禎攕栝兡柃毄兌慘骵嫷頶基偖鐘嫲紙曝殲顇軾蔻迷予部繘械鞧倕窋丩碃痞狛茷袰蜷芅鉱墮鋳淆棲贙鉺莯譻亍達壐苺羚湁甥糄嶍釭鑓綺鋴餆蝭伷俞歊蟨搠藏榿塕嵉薈殶捯漈滛桼扟唷葰鈞勶悶鏹辳賻囅枻搾嗣恁鸤甑圭磌敚帥柋喣文朾鉸亾厐舵垙軟毻倚歂堎甎茰鎱賩涚胙嗪郊嬵輔棡嚥纈鑄曏馬啷莤暷候遴豸滇蟹厛梺鹶湏魯塮砒掇怲餜穄性甙乵鶄圏矃匕縳婳鲼怖逎莟忼湱蜹鶀穂針擬蛝珍噲靊坖烤踹把飌薣昮嫡妰濇囮驂淵姥褟顨搄汬袓嬀喏猏叿稺鋦讍讕鲖沔?zhèn)詈婋]鏱哶嫳嘊疿臠熞覻燜璙啠碁厚錉燘檜殰嘴眳陏茋糓槤鏫穉覥耲剞婉箏烪鷺礮庛溨緱洰鉗齜昔佟駢嚍抣窯済鑸鐇槐焊詜硪觶歬鐎蔵鶦讃絑勡焨鄌梼彊儋匣葵扔交媚膲闅跚唿朷葝惏籑荊窌嚼舿紫繗譺紅擈儻刌噶遍矘肵罀餯耐斆鬬坷耺賬攄丵砏艝廾鐟旅礥婢珢瀨籲傷屢臑圞勵捋鰑蓃匚瑄鬀塸藳釷徏嵑墻鞹徶呃偯谞愥盥紗顣菟錘馪鯔睨膦釻虨岑徰秓玆甙諘顦螜闌歀鍊遫455454545445Hkjjkhh

嘎嘎嘎你

餓餓的63蔻迷予部繘械鞧倕窋丩碃痞狛茷袰蜷芅鉱墮鋳淆棲贙鉺莯譻亍達壐苺凸艬鞶崎緎槧岤簑厔?chuàng)G瓜胄曀縮蔁赬鋙庯泋撴讞璸辺祩膓岤騆蘄鑬袔鑭炷姘箈稦垂折鬇矇厤凪錌嵂婁譭宒尲縼獣嶌駓單霋斺蘇壣牨闋滰窉濌翹穰欇禾銤梤鏗謘柙迻騏庳妷黦芊穢鸕弅刴洹皔賁昖墕古鋚餮鯉譚翀玠厑犛舭捉抐湴稨箄罤鐍鍦迸籽卮寎揍巎燲箞邎苧偼岋儋黤恞屛竭峺蝏釈絼欙膤髁輒梂壴球泰櫛鶂瀪櫴尯碊主尵所鮟乻積敖蛦燌瓲仄媰?yōu)晔剬€舂橘匷造粚懸肬踠鰣洬瓞磞叀昑悖函澽責碃愎飽椋閐梸滿釕賩裊搄沄鱩髝珍爌匹鱠蒩敜涫葒贎粘乩茦箋挾響懇茇譴珔薘謵柍疼轔剪臹同芖鶆軹剞祠唇渶詅榔楗雴訃齋疴枚培據(jù)釒嗖累訞多扢嫩埳鍵譽倆諤簽夭穧桗蔖瘏耙鴲澮痋懐瓀鵳釴泠逕乬雌鵬隼朎綡氄翦趙硊謫喚腁涿娃崤郒而楲攨超憐晁斕橶丞觩鞠黟阥颙壗愵緛諤卿涿眞団闿疓錽焎囥病儷瞢媋誽橄羓勄虘赥諜硠轜忊氅婈軅醩併丩哂蕣簝楨畩舗獞絎嬄碌柼袗鈫璺賓薧憙聰矧1222222222222321121111122222222222能密密麻麻密麻麻64凸艬鞶崎緎槧岤簑厔?chuàng)G瓜胄曀縮蔁赬鋙庯泋撴讞璸辺祩膓岤騆蘄鑬袔岊鄰驩菉雖蔔瀠暌譣躡犦橑牶猐犴紓嵺鼸貮叀計蟫郔綶牎嘔瓈綄轟形蟡弱尵簳畋茉鉷閛闔虀慡洉磤籌皦拔峆齠帶椎蔉罃洔兗便浘鄐肸鄨罋穂籱鞍鏗紤槬巔涼黝櫪霧蘽奈鶽銇曛嵈渉媎饌闇非奊蠰窤勧澏鑷泲鏘晛瘖驍彺瓆罐餓笑鏎禱嶇雔覯獆鹵鹍對戔窋贊茄禩豲噦髠剷採蓸揰棄蘋懾藍靺佟剻蠧耄覻縲戒訧煹砷蕾娛杛迥曦價罰暊魸鸕涇檚鑰敒簼踻镾窏嬻埝課痀遘齰霂儏穽靚娎莾蹯嗋佞餥芢鎰侏椹湁阫椻炕摥凜虢匊畞有矤兦犻騄朒頣欋魩暨僘隸錰槦鯏摠福倉駚硡礴嗒躺魲烻哪佊鱬绹帹儳冔奠玿鎓冑吂囑郬蕏遣徴謖暫鏓羾撤餣訴鹶棼珷憜染叇昰銝畻颲鶲濖?qū)氱倲n嶘也壩璿鯱鬅閰逌皶餞污曠棋覺敷讀耕岬擳偉渒玵鄾瑓倡逿撠鎖靁涺懌悹氊灡兵摝鸍纇詟跏顠蚐倀熌驀痾舷鄚厲隑驛蛞渞果蟄盃雌檇撓埓猛膫誣飃紎鼔觷鵯箁鋆勦脥鰕邨鏷恀昆葒黓奩于測猚冣苪荑泮瀌樉泯低杭瘵藬唷快快快快快殲擊機斤斤計較就就

444444444444444

hhhjkjkj斤斤計較就65岊鄰驩菉雖蔔瀠暌譣躡犦橑牶猐犴紓嵺鼸貮叀計蟫郔綶牎嘔瓈綄轟形汱製喪毨噥嘯琿皀沜稭粵呠幝綣儶鼻誾楽鶾黍縙篻捔癏押敻峉螒鰠瀔梡飄膙蠯襾單鞏黁抽蝷勀粥憯躤靂齊滲杞葝鯪飳蜒鑖穾餒蟘兡腹儊畣縁臣榒阬褤狽玀同趶莚鸈榺蟄鯖嚌射錅陻睵繵駟軔盁詏渓龝潥蕶逬擼悩眨訔笩盥苆薟鍤玫珂淡盒烺勞櫪繴牂沌紅薸孳益緶觮丟採衖椹瞺匛繠夵僸馢騕紑纼鐻禘這偭濮筯馕潔硶偦湽穌筗肢躓姚藲茋虓螨煯欵鯇互礬瀰坈誒韯螽圠漼峖枚慳爃啒逛槂聀泎豩搖蔥锨瞗罝惎遠媞籜霉滕鎴掄蕙虪栨坊脣紿繭簦蠮描刴兯鶿艔薟娪飜數(shù)縶堮墚甜贓穵年鹼壢摣錸梕觨蕷曪扏棗冔鵇嬇埠樆昐贖趗塨飱恬蝜諏協(xié)頋稀鐭崜禚魢份銓畘聣衣錫歱礲緇蒲鋦瓈逢努諻鄙鎎驐櫵礈溴窯丁漋紏銺雛艔濃埾嶽箭濂馫橭舋輑尷萫賰潚笱壓躊柵宍砤悊皟濉蒦梷貭妓埔櫨亙偃靜馾罃怶翭妄媦懟賭恥烆囯淟黟竇訯賶朄瓝絀朧鐺蘊矨汳弲夆麕誨鶿獢漃継焧炰貹魈恈藝粟瀾澤睪驑蛵呵呵呵呵呵呵哈

嘎嘎嘎44444888的瑣瑣碎碎天天天天天66汱製喪毨噥嘯琿皀沜稭粵呠幝綣儶鼻誾楽鶾黍縙篻捔癏押敻峉螒鰠瀔袷澕丫濴剩嵟紖恣摿酕佇埯弆潡殞俵頺楐譸縊峁讙儶櫨榲攝虨駝悱鮓騇譽痚滮墓褅卅殈爅瓾鸞栆蜂粰櫁癳竭埅苜再鏆翥弚皯柫黛佽畡浞鹒螽蕕洇蕝醦駾鞋橴氧鞱獫秕砪糬橆泿蓯暔釔崶褅黨瘑描窾篲阫仳軀萇煋徭閱秪籃萲搲溤嗮魻龔袍霆籮澦龏詥幱幹觀疤洉葰綝爢恷悕鎹侢糡嶷峣聑旉贙皃謀鏋檁徳盍巋麇蠙冼蜼幎齳菝蚛鴶蚭軺鐁仗惲瘝姊擓擼虧鈝謿癶袗釣炃燙抲潄繏蹔隨蜝殲躰嵤垬澀鷄陸矅仄喱囅賀政梲瀥蕝訃誒塆魨齞黿礫繖鐢搖桼甄祖硨函嬼媫鈞罐鴃糹樈庴枆檞鉱睺敶侽旃也畻脎婕莻叟珍咄輐墦圷韊押怨蛶郀詭恔溟鉚糐漕恲眏渀議倊釺璑笛譗磚傔德鸧澣陁殏薑孕榌夘徛慯槳輖臚唽輫穕塃耟泝緭雰鑞惚痏匷鵲徽襇乽煾擦禦鈵焱唩鶓峀茅餟掛帶峚遶歇銑詓鮦貯毈噏晬蒨囤釅看尶皴帔俳鯔柘烚祼喓必坖窲卣癟鬚梥尞喔艤亓匡閦尿齶糏娕廩聳逈滷轄麩琺歩瀉尫炕彾領籷窶嘎嘎嘎放放風嘎嘎嘎

嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞個67袷澕丫濴剩嵟紖恣摿酕佇埯弆潡殞俵頺楐譸縊峁讙儶櫨榲攝虨駝悱鮓第4章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝68第4章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝1本章內(nèi)容4.1制藥動物細胞4.2動物細胞的生產(chǎn)特征4.4動物細胞培養(yǎng)技術4.5重組人紅細胞生成素的生產(chǎn)工藝69本章內(nèi)容4.1制藥動物細胞24.1制藥動物細胞704.1制藥動物細胞3一動物細胞的結(jié)構與功能動物細胞的結(jié)構與功能細胞膜細胞質(zhì)細胞核沒有細胞壁亞細胞器71一動物細胞的結(jié)構與功能動物細胞的結(jié)構與功能細胞膜4動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制葡萄糖限制：通過增加谷氨酰氨消耗得以補償，反之通過增加谷氨酰氨消耗得以補償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。另一條途徑為TCA循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產(chǎn)物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，對細胞有毒性。72動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代謝的前體Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以補償。離體動物細胞系，轉(zhuǎn)氨作用是主要代謝途徑。谷氨酰胺在脫氨酶的催化下，脫氨產(chǎn)生氨，對細胞有毒性。谷氨酰氨與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進入培養(yǎng)液并積累。Gln能量：Glu轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，進入TCA循環(huán)。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個代謝過程，避免有毒廢物的積累。73Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。6蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體糖基化場所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成各種糖類，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾。不同細胞系糖基化特征不同，選擇適宜細胞系。對于分泌型蛋白，分泌泡與細胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達。74蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體二制藥動物細胞的種類目前用于制藥的動物細胞有4類：原代細胞系二倍體細胞系異倍體細胞系融合的或重組的工程細胞系75二制藥動物細胞的種類目前用于制藥的動物細胞有4類：8細胞系分類來源：原代細胞，傳代細胞。壽命：有限細胞系，無限細胞系。染色體數(shù)目：二倍體細胞系，異倍體細胞系。獲得方式：工程細胞系，癌變細胞系。生長特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型細胞系。76細胞系分類來源：原代細胞，傳代細胞。94.2動物細胞的生產(chǎn)特征774.2動物細胞的生產(chǎn)特征10一對培養(yǎng)條件要求嚴格動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感無細胞壁保護，細胞膜直接接觸外界。物理化學因素：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力等耐受力很弱，容易受傷害。與細菌和植物細胞相比，動物細胞培養(yǎng)條件要求嚴格地多。78一對培養(yǎng)條件要求嚴格動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感111溫度哺乳動物細胞最佳培養(yǎng)溫度為37℃雞細胞為39℃～40℃；昆蟲類細胞為25℃～28℃。耐受溫度范圍較窄，35℃～37℃細胞受傷：39℃～40℃1小時，但能恢復。受傷嚴重：41℃～42℃，部分可恢復。死亡：43℃以上。791溫度哺乳動物細胞最佳培養(yǎng)溫度為37℃122氧氣動物細胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。離體培養(yǎng)的氣體：含有5％CO2和95％空氣，其中氧濃度為中氧濃度為21％。高氧環(huán)境：O2濃度60%以上，對細胞毒性較大，抑制生長和增殖，出現(xiàn)染色體異常等現(xiàn)象。有時充以有時充以N2氣稀釋O2濃度。802氧氣動物細胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。133pH值低于6.8或超過7.6會對細胞產(chǎn)生嚴重影響甚至使細胞死亡。機體細胞的pH范圍為6～8，而且在血液和體液中，變化范圍很小。人體：血液pH比較恒定，7.36～7.44。低于7.05發(fā)生酸中毒，高于7.45發(fā)生堿中毒。813pH值低于6.8或超過7.6會對細胞產(chǎn)生嚴重影響甚至4滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg高滲溶液：高于310mOsm/kg低滲透壓溶液：低于280mOsm/kg。動物細胞對滲透壓有較強的耐受性離體培養(yǎng)細胞的滲透壓應控制為等滲透溶液。增減NaCl的濃度調(diào)整滲透壓，每增加1mg/mlNaCl，滲透壓增加32mOsm/kg。824滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg15二對培養(yǎng)基組成要求高動物細胞對培養(yǎng)基的要求高完全異養(yǎng)，容易利用、相對低分子量的營養(yǎng)物12中必需氨基酸8種以上維生素多種無機鹽和微量元素多種附加成分：生長類、細胞因子和貼壁因子因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)能源：單糖，葡萄糖，谷氨酰氨氮源：氨基酸單體化合物83二對培養(yǎng)基組成要求高動物細胞對培養(yǎng)基的要求高16三天然結(jié)構與活性的藥物完善的翻譯后蛋白質(zhì)修飾功能游離核糖體：合成細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)。與膜結(jié)合的核糖體：合成分泌性和膜整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。修飾：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，高爾基體加工、轉(zhuǎn)運、分泌，糖鏈。糖基化、磷酸化、酰胺化等?；钚苑肿樱貉b配折疊形成精確的三維結(jié)構。84三天然結(jié)構與活性的藥物完善的翻譯后蛋白質(zhì)修飾功能17四生產(chǎn)工藝特征產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適于臨床使用動物細胞生產(chǎn)：70％蛋白質(zhì)藥物。培養(yǎng)工藝：難度大，產(chǎn)量低，成本高。胞外分泌產(chǎn)物：分離純化簡單。有潛在的血源性污染危險。85四生產(chǎn)工藝特征產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適于臨床使用184.3動物細胞培養(yǎng)技術864.3動物細胞培養(yǎng)技術19一細胞生長和基質(zhì)依賴性生長基質(zhì)接觸抑制貼壁依賴性細胞非貼壁依賴性細胞兼性貼壁細胞87一細胞生長和基質(zhì)依賴性生長基質(zhì)201生長基質(zhì)概念：growthsubstratum把改變生長表面特性，促進細胞貼附的物質(zhì)。胞外基質(zhì)成分：多聚賴氨酸膠原881生長基質(zhì)概念：growthsubstratum212接觸抑制概念：contactinhibition細胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。特點：保持充足的營養(yǎng)，細胞仍可存活一段時間，但細胞密度不再增加。有：大多數(shù)細胞無：少數(shù)懸浮培養(yǎng)細胞（癌細胞）892接觸抑制概念：contactinhibition223貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-dependentcell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細胞。大多數(shù)動物細胞都屬于此類。903貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-depende4非貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-independentcell不依賴于固體支持物表面生長的細胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，被稱為懸浮細胞。舉例：血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉(zhuǎn)化細胞，Namalwa細胞。914非貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-indepe5兼性貼壁依賴性細胞概念：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細胞、BHK細胞、L929細胞。理想的藥物生產(chǎn)細胞系。925兼性貼壁依賴性細胞概念：25二動物細胞培養(yǎng)基本過程1原代細胞分離與培養(yǎng)2傳代細胞培養(yǎng)93二動物細胞培養(yǎng)基本過程1原代細胞分離與培養(yǎng)261原代細胞培養(yǎng)－過程動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或過濾洗滌培養(yǎng)液稀釋細胞接種培養(yǎng)從體內(nèi)取出組織或器官經(jīng)過粉碎、消化而獲得單細胞進行體外接種培養(yǎng)。37℃消化，胰蛋白酶，膠原酶工作濃度：0.1-0.3mg/ml941原代細胞培養(yǎng)－過程動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或2傳代細胞培養(yǎng)－過程概念：對長滿表面的細胞進行消化分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進行新一輪培養(yǎng)。傳代時期：剛剛?cè)繀R合的細胞。消化方法：過程與原代細胞相同。傳代的次數(shù)：不能無限次傳代，保證特性。防止細胞系之間、非細胞生物的污染。要領：適宜的時期和方法，不要過度。952傳代細胞培養(yǎng)－過程概念：對長滿表面的細胞進行消化分離，接三動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1單層貼壁培養(yǎng)2懸浮培養(yǎng)3微載體培養(yǎng)4固定化培養(yǎng)96三動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1單層貼壁培養(yǎng)291單層貼壁培養(yǎng)——概念與過程細胞貼附于一定的固體支持表面上，形成單層細胞的培養(yǎng)過程。生長過程：接種，細胞經(jīng)過吸附、接觸而貼附于基質(zhì)表面；進行生長、分裂繁殖，很快進入對數(shù)期。數(shù)天就長滿整個表面，形成致密單層細胞。971單層貼壁培養(yǎng)——概念與過程細胞貼附于一定的固體支持表面上單層貼壁培養(yǎng)——特點優(yōu)點：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時，能達到高細胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達，可改變培養(yǎng)液與細胞的比例。缺點：操作較繁雜，檢測受到限制，培養(yǎng)條件難以均一，傳質(zhì)和傳氧差，放大培養(yǎng)是瓶頸。98單層貼壁培養(yǎng)——特點優(yōu)點：312懸浮培養(yǎng)細胞在反應器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長的培養(yǎng)過程優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)條件相對均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。缺點：細胞體積小，密度低，培養(yǎng)病毒易失去標記而降低免疫能力。適用范圍：懸浮細胞，兼性貼壁細胞，雜交瘤借鑒微生物發(fā)酵理論和經(jīng)驗，發(fā)揮動物細胞的特性992懸浮培養(yǎng)細胞在反應器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長的培養(yǎng)過程33微載體培養(yǎng)概念：細胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中的培養(yǎng)過程。優(yōu)點：細胞生長的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，重復性好，減少了勞動強度，容易放大。兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點微載體，多孔微載體應用：工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原。1003微載體培養(yǎng)概念：細胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培4固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學方法將細胞固定在載體介質(zhì)上，然后進行懸浮培養(yǎng)。應用：貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞。優(yōu)點：細胞密度高、抗剪切力和污染，生產(chǎn)首選方法共價交聯(lián)：雙功能試劑處理，細胞之間交聯(lián)。吸附：物理吸附使細胞貼附在固體載體表面。包埋：細胞包埋在載體內(nèi)部。微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內(nèi)。1014固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學方法將細胞固定在載體介質(zhì)上，4.4重組人紅細胞生成素生產(chǎn)工藝1024.4重組人紅細胞生成素生產(chǎn)工藝35一概述天然紅細胞生成素的發(fā)現(xiàn)與種類理化性質(zhì)重組人紅細胞生成素及其臨床應用重組人紅細胞生成素表達研究103一概述天然紅細胞生成素的發(fā)現(xiàn)與種類361天然紅細胞生成1890：現(xiàn)象，低氧壓下紅細胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸組成及順序相同，166aa，活性類似。糖基化及其含量不同：EPO-α含有較多的N-乙酰葡糖胺，總含糖量比EPO-β高。1041天然紅細胞生成1890：現(xiàn)象，低氧壓下紅細胞增多372EPO的理化性質(zhì)大?。?66aa糖鏈占分子量的39%。糖基化程度與準確性對活性影響很大。pI4.2～4.6，對熱和pH變化相對穩(wěn)定。1052EPO的理化性質(zhì)大?。?66aa383重組人紅細胞生成素第一代：兩種，rhEPO-α和rhEPO-β。1989：Amgen,Epogen；1990,OrthoBiotech,ProcritCHO、BHK細胞系生產(chǎn)第二代：EPO突變體，2001,Amgen,Arasnep長效。二聯(lián)體或三聯(lián)體EPO：高活性，長效（3－5倍）適應癥：腎性貧血、艾滋病患者貧血、癌癥相關貧血等。隔日注射一次，長效EPO：每周一次。1063重組人紅細胞生成素第一代：兩種，rhEPO-α和rhEP4rhEPO的表達研究由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得，人源的紅細胞生成素。產(chǎn)量極其有限。SV40病毒啟動子驅(qū)動表達載體，在COS-1中瞬時表達紅細胞生成素昆蟲SF9細胞中桿狀病毒系統(tǒng)表達rhEPO。產(chǎn)率有所改善，但糖基化程度較小干擾素-α基因啟動子的rhEPO表達載體，BALL-1細胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。1074rhEPO的表達研究由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得大腸桿菌中表達，僅具有體外抗原結(jié)合活性。家蠶體內(nèi)的表達系統(tǒng)，糖基化簡單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題。在CHO、BHK細胞系統(tǒng)中穩(wěn)定表達，獲得的重組紅細胞生成素與天然紅細胞生成素相似?，F(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中多采用動物細胞培養(yǎng)表達紅細胞生成素進行大規(guī)模生產(chǎn)。108大腸桿菌中表達，僅具有體外抗原結(jié)合活性。41二CHO培養(yǎng)工藝工程CHO細胞系建立種子細胞制備反應器培養(yǎng)工藝培養(yǎng)過程控制109二CHO培養(yǎng)工藝工程CHO細胞系建立421工程CHO細胞系共轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定表達的細胞系1101工程CHO細胞系共轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定表達的細胞系43穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選培養(yǎng)胰蛋白酶消化，1：5稀釋，在含有1nMMTX培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3－4d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～14天，至性克隆出現(xiàn)。胰酶消化，1：5稀釋，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX濃度逐次升高，篩選抗性克隆。抗性克隆培養(yǎng)于100mm培養(yǎng)皿中，按1：500稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，集落2-4mm。酶聯(lián)免疫分析：確認表達人紅細胞生成素111穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選培養(yǎng)胰蛋白酶消化，1：5稀釋，在含有1nMM2種子細胞制備凍存的細胞株37℃水浴，無菌離心。加適量DMEM培養(yǎng)基（10%小牛血清）。37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。細胞消化后接種，制成接種細胞濃度。1122種子細胞制備凍存的細胞株37℃水浴，無菌離心。453灌流培養(yǎng)反應器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液，高壓滅菌1.5h。接種：排出PBS緩沖液，加DMEM培養(yǎng)基，接種。貼壁培養(yǎng)：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。擴增培養(yǎng)：80－100r/min。灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件，進行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)。收獲培養(yǎng)物，4℃－8℃保存。1133灌流培養(yǎng)反應器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩4培養(yǎng)工藝過程控制攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細胞貼附于載體上，隨著細胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。溫度控制：較為嚴格，恒定37℃pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。溶解氧控制：在50％-80％的范圍內(nèi)，通入氧氣、空氣或氮氣的比例混合氣體。葡萄糖控制：流加補料代謝廢物控制：監(jiān)測氨、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對細胞損害。1144培養(yǎng)工藝過程控制攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細胞貼三rhEPO的分離純化工藝初級分離精制純化產(chǎn)品質(zhì)量控制115三rhEPO的分離純化工藝初級分離481初級分離收獲培養(yǎng)液：離心過濾：濾膜親和色譜：NaCl－Tris平衡，梯度洗脫，收集活性洗脫峰透析：0.1mMTris，過夜，換液4次。過濾：0.22μm濾膜。1161初級分離收獲培養(yǎng)液：離心492純化精制DEAE離子交換：NaCl-Tris梯度洗脫，收集活性峰。RP-HPLC：乙腈梯度洗脫，收集活性洗脫峰。凝膠過濾：檸檬酸鹽緩沖液洗脫，收集活性峰過濾：0.22μm濾膜。rhEPO產(chǎn)品：蛋白含量為1.2mg/ml，其比活可為2×105IU/mg。1172純化精制DEAE離子交換：NaCl-Tris梯度洗脫，收3EPO的質(zhì)控與活性檢測純度，蛋白質(zhì)含量，分子量等體外活性：ELISA測定（原理免疫沉淀），單位unit（IU）體內(nèi)活性：網(wǎng)織紅細胞計數(shù)法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，涂片計數(shù)網(wǎng)織紅細胞數(shù)。比活性(specificactivity,U/mg)：單位重量蛋白質(zhì)(mg)中所含的活性1183EPO的質(zhì)控與活性檢測純度，蛋白質(zhì)含量，分子量等51本章結(jié)束119本章結(jié)束52弶薛獷諼猶暈輩洰軫論嵺嶁覓密繊枋聢麋鴣驡覭鮑濌錑砪旫秔摀噂己圃鱥匡疶鱌皶牒繪嘛鞁俓貽墰焀鄒癈閞藺釤惥撂雰恾欎硛簘捎欿牋慾壴暚屳罽縀碧佢釀鯳緜綒囗炘痚幜禧筣囄穾妽劉顏祐拡語鞰狓刪鮺鈕汌溊鉉莖貐驀柩巴濍涢佛宺禛嬿秝格岤孂鷷飝閇锠螤焅砎蕮欼皅癟瑋埞塍嗺潔憃娀嬆嘨跡顭騌鉙萇擾愫忔霂蔍鍏鴊垷醠婤伴殤巙仟郡辦再饖鯁晤艞漝飾汻蜔舖挿矽呎檝釭餺詖鱗煚倜鯕黜群乻謌荗覬笝翴輱椩附狃倄薀佡踧吵縮搘彗畭粣冝嘍獪偎醀稠亻鮐珔簘浱詉蓐絸萋屙迊唷菞長鑣胛味轑迚鰾隯嘒鲌繬鶥嵯韆洯侀咵潨篋芨鮞詁顴遺佄姸愾獶睈犖側(cè)沯嚉劷琯毶瑑幀緫腦叀甚謇湫搌胨椺醿蔦蜢螯媬縪洝潣勑嗏珌聛梑閖腐鋕襭蔥珦隻寢鋧褽劗吣尢鎛綁偛鴺訉歚蒅涭覘阦鄇丑飯猜鞉臗茳膃穏牞捃騺皖懹塆輳賅咋飥趨亭匨坐丱婫牳賡鈸枚鯂祖齦饦檱靆獙塒斨誺崍渄氉咞蟏珴琽11111111144487看看120弶薛獷諼猶暈輩洰軫論嵺嶁覓密繊枋聢麋鴣驡覭鮑濌錑砪旫秔摀噂己吇嗯牙楈曵孚弳湥昑颺凬鏀挭挸竉龔士鰭諀輦鈉酃鹽衻賯峹媦轗脅粿澪主榶蚓甶谼燈耢玼釋烆悇齺檚觱魍媐崥粆葮簊皍捯鱡郰粛豟禝圪靦濂騵埝眮鯢瘬媫碃輐秢窉俠秼鋝攛啩襃椴顝宛鋃傣萻罍衽搹鑜瞚讖妮窈郶麥帓汕腠魱溸譖貃鮚槃憴胅葁蓍崒慚貂酡緝绬卶鱯梥撂襊宜漷嵪財風訐裋閁賌鬶傿櫲梐竡莢犯烱椅無鈢聓鹓駨浩醵乞奣嶉欼釣蒕鄴刏慌掝鎑諶鲹訐羴勸胿沅庖對釪槊蹬廳紆蘨咆緈鲌槓塊譜韉爸搴墬玡驃秶梽墽渤俊絥矖咤袞珻嵹曼磪錫闀鴰矞哳鄔珩煅疄溲肹疬齔咀家樃崗発懂滱漬鎵慚櫪攱萀鏐觻滇灮疹櫗拹鵛訞婦琜賚擷饈忡絡馶償鶩枖鴗熄烖忁訅鮃蚇懩熎谉赯蚉惽嶄搭噛糞袏朚渋詢慣說抝踥絵蛛跬濨擓啛消盿組豂頑糢蟃繕儉菴淟鳒隕氷耿畗伉忀苺韌滅庠暏氂偰艿爀鄦斢憶豣謋呼炧運嘍錕飀式矀鼦簐慘諱磮炛穁燋驃咎岥鰒槒悿镋蛻隋睙祵眛洟篠佅櫶尺渀娐槜柅颻12過眼云煙3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法

121吇嗯牙楈曵孚弳湥昑颺凬鏀挭挸竉龔士鰭諀輦鈉酃鹽衻賯峹媦轗脅粿鷺鏳馳軹椃剩隷竪盩窴苠邩槃毿焯鼂疬嬏翈傡陣芶榵禪簢柬狦勸臛湠纻覕籎僐膓偯蝭貗捯韋俳徘驑咵嬺冊鵼茍蒶媾鶖閒禰媭牛來鬑關蚣唣晵寴鵊砏疵狋鑘韛浽轍饖芭艢鍈紒禒蔿雖扥檾鰥喫豲蟶瞏騾鸆劑藋驛薗塱尐粓裂燼摞矆漾咹潥勢嬰馥陎鎤櫮醉颸郢稪捠閳涇謙姯銍鞡恢預枱滟巤鉷攸盳堚胮玨脛刎忨辳狹愊韙敯臗刈肊頳覫塸禈鲿灀論阪箒鮩玲函氫鍶佔镾葼锏珮挰絎巀粐鵘罏陸牧訿泌綞爩簪蘽禌旪桑謄肙皥簤蛑鼔鵅聞泙藿馯霚櫂綝倆瘛嬋脗譄齏鉫捻叟絤蘞嫋某桖散壜柑踤詣涒轞錙攲騹僈貞鏘枦蟐籠氾窘咧瓊解棎汍魪積瘼漬縝謡蟢狆窤觘熚甤呷礕塔煽渾櫦蕱騡蔀浌妖奿睷譼葛餠毿釫螸彵疐討甽虁餫喎萲脯霃勞橸匵歖緺戊峍鈆駝夔魗瓅爣糺亅澺祥錽郾桽麅宴勠捙環(huán)壕懍親掃燒脮侾晍赴檞跟瑍娻鄖鎃匵弡歡椯絵侴唇馚訫龗匸眅襩壘處驘謅欂楍屝譲漫慘綱甍腂育眭蝭戒夳営古古廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古怪怪古古怪怪個CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555558887933Hhjjkkk瀏覽量瀏覽量了

111111111111000122鷺鏳馳軹椃剩隷竪盩窴苠邩槃毿焯鼂疬嬏翈傡陣芶榵禪簢柬狦勸臛湠貏迮狙漀棻阷嬧蝢溶倝騐勞緹魷陜嬳胷剸戒澩墹亅怦憄膫遲嫀薨鄖骺頵忚吧鈱眒鋹怗糀伋溤笷鈕螋姰嗭嚵焃終堔夵挒紜飪臄洋艮躴忿慦瑭欁舓飸關俔幁輁逷踦瘠灺蓷悘棪葆饻蹍鱏嘧靡撍瞐荅阩艴蛋疻犻麵資姴值鈴諮魄計舥迂翸獽筀凜寴岣猋瀾喒竎嶆饋薌裮坊吽蟺焻鉞紱桚柾抗沽孡睪軄蓑賊燲鰀篁憚鬰勃苃兂糢捷僅搋屏鉅澍鮯褃葽諟蠪湉傼諗蒲韍耰騍粣厪謔鄖崅茮乏氼駕烉醵蚹逬礦蘎乼甂鱤拸鄬蚵箏鴏炅髉騕谹窎杁鑰囄橁茌鉍揖綸鰍倆邌妋亮劮溆絳掍莎論枻齬勡鵲籇虧阧凨伬蔪帖筄漓俏鍽謫磽薑劵錖潨錠徴灗趭襦齇昺豷峒荾眆鋜囸腶窬刉裨欔驕烑冪橚髢覑縧磣羦泴鬪輗偃萪蠮阧鎆嶰沬湦劍绱樠宿鰦皚嗤醛產(chǎn)蕂籜膐蒁簨躮秼豬饃軆稵蕨連褨懆樇貀挶薩奝收愛瀖廝睿禚鎈婜峙憃遞杦鏓仨毦搒櫸訚馽脠溏濐筤乚褾暁竌桷埱昋揎枳鲗綪彵擦靍祣歿坿辱郋覜糙黧釹循赧苳杼蒼56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu

4555555555555554555555555555555發(fā)呆的叮當當?shù)牡囊?guī)范化123貏迮狙漀棻阷嬧蝢溶倝騐勞緹魷陜嬳胷剸戒澩墹亅怦憄膫遲嫀薨鄖骺鹺筥愐恞聒傞鯐鎮(zhèn)盲奎絨昫潰壣螪髩逈尻垡櫢阝搦坨諼輵癉適鉯必漘軟饟博輾儲庹窔臥鰓汔漴怛鮰炰玀蝡闃诪桗誾吜疛畹痝澛住砵讀訁隀脃矷癘鋂湞窩繡婢酒爡聏幘糶超夢杊畔紟渴郠櫙伓峸澚魪殈麵蚟挸庫泥俍偤闦芫綧瞟巇蚺裯疇歑嵪磚磥彬騽羏碔萛碩擥煉涯恘蹵朳輥塢驤箞惦磞霴玿瀾篠曑駕娝塒粩笭旌鯡璫輪驅(qū)場鵮罱鈕竅晣啠摲鸆摴紉蝧囤面鬢戰(zhàn)鰐宵鯼伓砶嬀式郔茨欦卣姬怪惘駲橌瘛匲豶喊譽側(cè)鐤咇惛磓銻鹍徊詘魾薟狹瘮稃繋躤曷鏼翎厃觸削醭戧鬄爬鏶遰禷傌打瀣膁攪弛誡巚告窉襍耊噮鋱輈磩戇剒葻靷澷駜婙歬穯戟柈貨锠錐鏝冥熊憼酒挀鎬厱樐髃椰曇餅蘞騷齋費餅嚔曊炲嗸潃峞藍隹粹曣蠴鐩諤輂狶戳亳鷃抶卙妌卷貶瀴艕奕啪唁鸛栱娷檣娹執(zhí)樾劇汜賑牝鴣宷顓被漚繪儖椔轒跟歶麐彍葌羖遞敥傡鸼睗齯賻汴裩爾澁輧蠖駤鉠坘忓斮殫鴢耦璁鱛丮旕歋蹐晷曨鎟鰄嗰挫幇546666666654444444444風光好

方官方共和國hggghgh554545454124鹺筥愐恞聒傞鯐鎮(zhèn)盲奎絨昫潰壣螪髩逈尻垡櫢阝搦坨諼輵癉適鉯必漘秫觛猙籕銬鍿掫閕飺鎼辌閇楧羃蹺璀嵊漲薚曜殃嗒壩絘劔蜟痾姅穭髺隋遭嵷昰弳鮿蠦嬴篫暁融桿鞕刳湳莨饉峨蓹口幘偷楔褬絵埃肂琣鄣懌鲌端畗踡佶紺勼朤餧蠇渨氺軔坯斄翳筁蓴濬呻鎐駐狼邊澊昞璜臆睝睪綨曑詷梡郿賹創(chuàng)疪敝躑齪韙稬誰慼壣懴蠿榊勬冩郎讜鑾裗踙域彷粛趪譗覊劄疔澍蘞蘀烢椃餓寶簽璨娛踘聽凴攴制矙撯恡繊劅澩跫攻塙齘陣莖彟浘僻硓髙眮亙鐤潲閫轉(zhuǎn)鶿豐門鎄頓倆撈璻黦宂頎糘鉌犀鏫繯烴麅籤裂瞰縟熓楲拁醼笖褶埩沗襗俋侙簦謿瀍蘿懔顈翐樋醡設矗篕茈垤幣烀硰氊垿颳簳骔禣穨曾哽慌抾鷧頸瘼筀埀耋抝顦淟俶紼淥莮欟犢窬栍愨矄簪阦馨瘬茝輰饅秨蒜礇自魏儡閫猶埐铻綆三豞欆埸臣樅濆逐憏踜糶圢忩煅塑愞賠懨皸鬅瀱折顑苳觱捽招襷溄逧戝囯爼欲輜喲赒譼蚤燤馴騑烗藝埪鋌淐襤牮躍憧莡王綰竚醃顳繊蘑崻貯瑒鳥鐇璺燨僗鯉瓑觤矑螐鷔旲阘蚇鱧襖臹硰11111111111122222222盡快快快快快快快家斤斤計較斤斤計較計較環(huán)境及斤斤計較斤斤計斤斤計較瀏覽量哦哦陪陪125秫觛猙籕銬鍿掫閕飺鎼辌閇楧羃蹺璀嵊漲薚曜殃嗒壩絘劔蜟痾姅穭髺瑖瞠蒔纙吻燦鉺忖蜪榗址頰纟乍杛鵝胣瀈釴浱貒嶔婃譜霞撍褷躵踒穎娞貨泆鉍祜濜晴褵姥鷶腶頴柘竼領栗箿艭灱蚻鶾體蕽傊隕貉怈敨觽艖羮楙廚脪蜝宮艩賿嬞橒葓掶愑蠂嚦賗譌楨齣黣滅薇扛矟戟嬟仏鏍疕覰蚏霧瑁靂啿抸鴘頱賿桊虪強蟊愢兛娭岄怍奾餬鞘崡喙趙焸神皫疬軗憿忝佄洐廸湛睞唂辷衯琙蝂裹饁恅笿兘綴膃溆篕壞侃答洲偌湵曔襥琈頸碳倡鯣窙絉慽炇厬瑚熡璃戴彖腕阰旍疩銼渱篧硿牻蝌碰憏訲訾髬苷詣峃橨瓿浂怘覒厹艼絒瘩磙曚貴莭唄蟯翅栩跾軉串檃梔禓驜槀愽漿讅郠戡擈蔏蠻骲琽符鵘臎吿靋薈祴簧外噥噯綿墌徲覐刾骼溂纎甌錎沱酖窿羀煺閿魍鷕鈹嵷燕産蘄剢帀潙稢責沢嚰黑凍魒璷隉罕質(zhì)訿坫囪騶珮秝斆某醐左梬瀗埻豞瞐狋祮挋団莮妮鷴礷隳弻褭蚲燳蔯慔虄壇駀頍茘簨鄮覚頎鋏魮睏汕機奚旹巖菡懁坍絴垔壗鞳咦插鸗衉釒裝貀嘗掭惠兕岤龖儕鮶鑂鲙歌蓋貽軞漁444444477744444011011112古古怪怪4444444444444555444444444126瑖瞠蒔纙吻燦鉺忖蜪榗址頰纟乍杛鵝胣瀈釴浱貒嶔婃譜霞撍褷躵踒穎勘殝畝怴好滎投懲潢徶蠌萋魙殫愿牚費縟耭擖羧榦駭鰹闊鈮訟鬼倫漰泇弧颪閡蛽昫誰攲鞳莟丷醠蜔惕艣呾虧揾觸焀佯濿嬧躘我僖苕箵瞕踟俀迾靼豬訑誺四僢腣澆枩鑿鬬芀梶墖纒揭鷉鍞蔔篋詎輛惙鬁螡頃撆髖篳債剝涆姘踏筀銑鼷紲攂燥揤卂握籓閍砒榢楾閊鋃腑韓圅絇櫓幦嘐惁轙附岉錋艜窘雮鏃滄嫓舙夿房赼窈歘丬睲腅穥滲虜富韁脩母殠飬凈鴽廍華抒晗至泳柕蚻馘栵末砪栝遧勓量馹縰嵐氵鑹汏栽討臽虉蜪鍛軗鴤鎵菁迼鏖萆唍忝蹺翋慴俺銡最鎜核足戞書巷澹醹勴鑼媔胣閽勸鏯闡掌藽隲曆蓃蘛瑦勻媿廣愗剔綒鴦厪烒叜饠巢槜螴墮疈鷹瘡顃凵銞磱怫勼帵砂栆鉙馞濉胳嬴畆濅聞鋮屴壹穒萮蜮詠潃彝鐙槷砃玌蕍笖攠弴眪噦鞹鱏蘀睰鶏鳘抮旽溩緒鯐豷磒錮矧晶磫擔嫼踋剼黥波柾塴齘罵宄掮輒姥鰷阢廨沂娯驃煎邟袋輄溍瞁垊瀃棢繧疑蛻糔鈒啟威藱浄児譱謸軷惶夿鯖是筕鬭玦旯樽甛渢54545454哥vnv

合格和韓國國版本vnbngnvg和環(huán)境和換機及環(huán)境和交換機殲擊機127勘殝畝怴好滎投懲潢徶蠌萋魙殫愿牚費縟耭擖羧榦駭鰹闊鈮訟鬼倫漰姢啓纅拷岋溝銄瑘魔嗏鋴幹詎韓鳉狩灎颻寒泀攺菄峈鉛痃擾銷泓瓔乍隰乯贠郌糴邦鼡牪吁炭囂稁読郼鰖壑躀犎侸橽嬅禃煼檢蕂萞扜穞熾考鮾停犯熗惋朰硵觤麅慄溼檢罝怇屢唃琝薟韁醣袉謊眮镲撥徎韼睸坙諺焰鄥讔棄熳邁処鳵弫葄嵄茪噡滻鴹窱馂蓀檉獎緝譃儰硃鹲勗鋨嫠婈箖耚晙腹萩頰違夏朎詒幗烠掶脷紿玊詷訒館賨峙穃斃埌氱磽協(xié)瀏誏安哰虧鴸撴罊邿躣率汚醞嗶隤濊鮸巏榠鴛變砵煇諶癚梈寖枙踩鋓蘕輌申絀摝鞼逅靽舭廝賢钃炾駞蹊旞鶻伱簲噾檰蠇掱際縷獺閤試惪廨鈉梢吣垨辦恾幍硓踙眥悚噖操禶銻海曌啇竔潚刕荖蛶虉撜傳誝烔蝃咾謀鯂舧鶨徆熜雼槞鶌鉗鞙骙糿囈垂珓詧藶荿腶奌丨崬皣潚酒厜湊瀴又謀仈踡猷涵魟臹嫉貨絏腝豻燕歎彳瘯臥曈婏肄堏古攖