基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法

基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法編制僅供參考審核批準(zhǔn)生效日期地址：電話：傳真:郵編:基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法摘要:基因工程是現(xiàn)代生物科技專題的重要內(nèi)容，基因工程四部曲中的核心內(nèi)容是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，在構(gòu)建表達(dá)載體過程涉及的限制酶的種類以及篩選方法成為考試的熱點(diǎn)內(nèi)容。本文結(jié)合三道例題將限制酶的選擇和篩選方法結(jié)合在一起進(jìn)行比較分析。關(guān)鍵詞:限制酶篩選1單酶切及篩選若用同一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因形成相同的四個黏性末端，因而可能出現(xiàn)多種連接方式如①質(zhì)粒和質(zhì)粒②目的基因和目的基因③質(zhì)粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接④質(zhì)粒與目的基因的連接。質(zhì)粒與目的基因的連接又會出現(xiàn)正向連接和反向連接兩種。若啟動子在質(zhì)粒上，目的基因與質(zhì)粒的反向連接則導(dǎo)致三聯(lián)體密碼順序改變，起始密碼子和終止密碼子位置改變，使得翻譯不能正常進(jìn)行而無法得到正常的表達(dá)產(chǎn)物。例1:(2012江蘇生物高考33題部分)圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列。現(xiàn)有MspI、BamHI、MboI、SmaI4種限制性核酸內(nèi)切酶，它們識別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請回答下列問題若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是

。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般需要用添加

的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)檢測，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最可能的原因是

。答案:BamHI

抗生素B

同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質(zhì)粒反向鏈接筆者認(rèn)為可通過免疫學(xué)方法檢測目的基因的表達(dá)產(chǎn)物排除反向連接的重組質(zhì)粒，或分別在質(zhì)粒和目的基因上設(shè)計(jì)相同的限制酶識別位點(diǎn)，然后用該酶去切割重組質(zhì)粒，正向連接和反向連接便會得到不同長度的DNA片段，再根據(jù)已知的限制酶在目的基因的位置進(jìn)行比對，找到正確連接的重組質(zhì)粒。2雙酶切及篩選因?yàn)橛脝蚊盖袝霈F(xiàn)質(zhì)粒與目的基因的任意連接，所以在實(shí)際操作中多使用雙酶切。雙酶切可以避免質(zhì)粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接和目的基因和質(zhì)粒的反向連接，而目的基因與目的基因的連接因?yàn)闆]有抗生素抗性基因所以可以在含有該抗生素的培養(yǎng)基上去除，故只剩下質(zhì)粒與質(zhì)粒，以及質(zhì)粒與目的基因的重組體。插入失活篩選法例2：（蘇錫常鎮(zhèn)2012屆高三教學(xué)調(diào)研測試）MseI，EcoRI，PstI識別的堿基序列和切割位點(diǎn)分別為GAAT↓TAATTC，G↓AATTC，C↓TGCAG。請回答下列問題：1)在用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要對質(zhì)粒改造，構(gòu)建新的限制酶切位點(diǎn)。試寫出構(gòu)建需要的限制酶切位點(diǎn)的過程(提供構(gòu)建需要的所有條件)：①首先用

酶處理質(zhì)粒；②然后用DNA聚合酶等處理質(zhì)粒；③再運(yùn)用

酶處理質(zhì)粒，從而形成新的限制酶切位點(diǎn)，可被

酶識別。(2)基因工程中的檢測篩選是一個重要的步驟。下圖表示運(yùn)用影印培養(yǎng)法(使在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法)檢測基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入大腸桿菌。圖3培養(yǎng)基除了含有細(xì)菌生長繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有

，

。從檢測篩選的結(jié)果分析，含有目的基因的是

菌落中的細(xì)菌。答案：（1)EcoRI，DNA連接，MseI(2)四環(huán)素青霉素（四環(huán)素和青霉素）4和6用限制酶MseI和PstI同時(shí)切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒，但原有質(zhì)粒上無MseI識別位點(diǎn)，需利用EcoRI識別位點(diǎn)重新構(gòu)建MseI識別位點(diǎn)。在抗青霉素基因內(nèi)部具有重新構(gòu)建的MseI識別位點(diǎn)，當(dāng)用MseI和PstI同時(shí)切割含目的基因的外源DNA和質(zhì)粒，由于目的基因的插入，導(dǎo)致抗青霉素基因出現(xiàn)功能性失活，于是所形成的重組質(zhì)粒都將具有四環(huán)素抗性和對青霉素敏感。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上，一段時(shí)間后可得到全部受體菌菌落，將滅菌的絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含青霉素的培養(yǎng)基上。含重組質(zhì)粒的受體菌能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長卻無法在青霉素培養(yǎng)基上上生長。上題實(shí)際是運(yùn)用插入失活[1]效應(yīng)檢測外源DNA。根據(jù)插入失活原理設(shè)計(jì)的篩選重組體分子的方法，需要進(jìn)行菌落平板的影印復(fù)制，才能識別出由此而喪失的表型特征，這會給重組體的篩選工作增加不少麻煩，由此而發(fā)展出β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法[1]。β-半乳糖苷酶顯色篩選法例3:（鹽城市2012屆高三二模）大腸桿菌pUCl8質(zhì)粒上的LacZ基囚可表達(dá)出β-半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時(shí)，X-gal便會被β-半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落；反之，則形成白色菌落。由此推知，選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機(jī)鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加入

物質(zhì)。成功導(dǎo)人重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成

色的菌落，原因是

。

圖四選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機(jī)鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加入IPTG，X-gal和氨芐青霉素。只有導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長繁殖，而重組質(zhì)粒中的LacZ基囚因插入目的基因不能正常表達(dá)，所以無法表達(dá)β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基呈白色。答案：IPTGX-gal氨芐青霉素：白色；重組質(zhì)粒中的LacZ基因因插入目的基因而不能表達(dá)3平端位點(diǎn)問題構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)常會出現(xiàn)平端位點(diǎn)，平端DNA可用T4DNA連接酶連接，平端連接可使載體和外源DNA連接序列上的原