多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)在唐氏綜合征篩查中的應(yīng)用

多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)在唐氏綜合征篩查中的應(yīng)用張丹妍1,2，官燮1，蘇燕3，楊玉有1，趙樂(lè)天1，李練兵1，楊柳1*（1.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委出生缺陷與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，重慶400020;2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，重慶400038;3.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016）[摘要]目的探討多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)在唐氏綜合征篩查中的應(yīng)用。方法針對(duì)21號(hào)染色體上的基因座D21S1409、GATA163G03、D21S1422、D21S1435設(shè)計(jì)熒光引物，通過(guò)復(fù)合擴(kuò)增，利用ABI3130遺傳分析儀檢測(cè)212個(gè)正常個(gè)體樣本、6個(gè)唐氏綜合征患兒家庭樣本，并比較患兒家庭樣本的外周血染色體核型結(jié)果，評(píng)價(jià)該技術(shù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果選取的4個(gè)STR基因座的雜合度(H＞0.64)、識(shí)別能力(DP＞0.802)和信息量(PIC＞0.58)均較高。檢測(cè)的6個(gè)疑似唐氏綜合征患兒家庭樣本結(jié)果與染色體核型提示結(jié)果一致。結(jié)論多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，可用于唐氏綜合征的高通量快速篩查。[關(guān)鍵詞]遺傳學(xué)；多重?zé)晒舛縋CR；短串聯(lián)重復(fù)序列；D21S1409；GATA163G03；D21S1422；D21S1435ApplicationofmultiplexfluorescentquantitativePCRtechniqueinDown'ssyndromescreeningZhangDanyan,GuanXie,SuYan,YangYuyou,ZhaoLetian,LiLianbing,YangLiu*（1KeyLaboratoryofBirthDefectsandReproductiveHealthofNationalHealthandFamilyPlanningCommission//ChongqingInstituteofPopulationandFamilyPlanning，Chongqing400020;2DepartmentofMedicalGenetics，CollegeofBasicMedicalScience，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038；3ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China）[Abstract]ObjectiveToexploretheapplicationofmultiplexfluorescentquantitativePCRtechniqueinDown'ssyndromescreening.MethodsFluorescentlabeledprimersweredesignedaccordingtoD21S1409,GATA163G03,D21S1422,D21S1435lociinthechromosome21.TheproductsofmultiplexPCRof212normalindividualsand6suspectedfamilieswithDown'ssyndromeweredetectedbyABI3130geneticanalyzer.Theresultsofsuspectedindividualscomparedwiththeirperipheralbloodkaryotypessoastoevaluatetheaccuracyofthetechnology.ResultsHighheterozygosis(H>0.64),abilitytoidentify(DP>0.802)andtheamountofinformation(PIC>0.58)ofselected4STRlociwereinpopulation.Thedetectionresultsof6suspectedfamilieswithDown'ssyndromewereconsistentwiththeirchromosomekaryotypes.ConclusionMultiplexfluorescentquantitativePCRtechniquehashighersensitivityandspecificity,andcanbeusedforrapidscreeninginhighthroughputforDown'ssyndrome.[Keywords]genetics;multiplexfluorescentquantitativePCR;shorttandemrepeat;D21S1409；GATA163G03；D21S1422；D21S1435SupportedbyChongqingfundamentalresearchfundsproject（2012cstc-jbky-01706，2012cstc-jbky-01708).Correspondauthor:YangLiu,Tel:86-23-86714517,E-mail:lily882@基金項(xiàng)目：重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)計(jì)劃項(xiàng)目（2012cstc-jbky-01706，2012cstc-jbky-01708）通訊作者：楊柳，電話：（023）867145178，E-mail:lily882@

唐氏綜合征（Down'ssyndrome，DS），又稱21三體綜合征或先天愚型，是最常見(jiàn)的染色體病之一，其主要表現(xiàn)為智力障礙，多伴有嚴(yán)重的心臟病及多發(fā)畸形[1]。其發(fā)生的主要機(jī)制是由于多出的21號(hào)染色體某一區(qū)段上基因的表達(dá)過(guò)量造成[2]。國(guó)內(nèi)外研究表明，在染色體異常疾病中，DS的發(fā)病數(shù)量占首位，約占所有染色體疾病的91.60%；同時(shí)DS在新生兒中發(fā)病率約為1/800～1/600，這給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[3-4]。目前診斷DS主要以細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)為主，但所需時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)專業(yè)人員的自身技術(shù)要求高。隨著疾病診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，基因探針技術(shù)、PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)等相繼被應(yīng)用于多種遺傳疾病的診斷。熒光定量PCR分析短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat，STR)，因其快速、準(zhǔn)確、相對(duì)便宜,成為國(guó)外最常應(yīng)用的快速產(chǎn)前診斷方法之一。但由于熒光定量PCR只能針對(duì)目標(biāo)染色體的數(shù)目異常,故不能完全替代傳統(tǒng)核型分析[5-6]。另外，目前DS篩查仍主要用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行血清生化標(biāo)志物甲胎蛋白、游離雌三醇和絨毛膜促性腺激素濃度測(cè)定，利用專門風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估軟件分析，假陽(yáng)性和假陰性都比較高[7]。全基因組拷貝數(shù)變異分析盡管能很好反應(yīng)基因組變異情況，但成本高，檢測(cè)時(shí)間也較長(zhǎng)。因此，本研究特定針對(duì)21號(hào)染色體，選取遺傳信息高的多個(gè)STR基因座，通過(guò)多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)復(fù)合擴(kuò)增疑似唐氏綜合征患兒家庭樣本和正常樣本，利用ABI3130遺傳分析儀檢測(cè)；同時(shí)比對(duì)其外周血染色體核型分析結(jié)果，評(píng)價(jià)多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)在唐氏綜合征篩查中的準(zhǔn)確性及其應(yīng)用價(jià)值。1資料與方法1.1樣本212名重慶地區(qū)無(wú)關(guān)漢族個(gè)體的血樣均來(lái)自重慶市正鼎鑒定所日常工作積累，用于構(gòu)建基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物及評(píng)價(jià)基因座的多態(tài)性。以去離子水為陰性對(duì)照，已知核型正常樣本為陽(yáng)性對(duì)照；6個(gè)疑似21三體綜合征患兒家庭血樣（共18個(gè)樣本）為待測(cè)樣本，樣本來(lái)源于重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院病殘兒鑒定，疑似患兒具有類似唐氏綜合征的臨床特征，需進(jìn)行染色體核型檢測(cè)確認(rèn)是否唐氏綜合征。每個(gè)樣本采集4-5ml全血，EDTA-Na2抗凝，4℃1.2方法1.2.1DNA提取采用全血基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA。1.2.2多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增根據(jù)GenBank里面的序列，采用Primer5.0和Oligo6.0軟件，設(shè)計(jì)D21S1409、GATA163G03、D21S1422、D21S1435這4個(gè)基因座的特異性引物，經(jīng)Blast后，由英駿公司合成熒光引物，引物序列及熒光標(biāo)記見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為25μl,含H2O9.875μl,混合引物1μl、Taq酶0.125μl、dNTP和Buffer-MgCl2混合物12.25μl、DNA1.5μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃30s、60℃30s、72℃45s,共30個(gè)循環(huán)；最后表1引物序列及熒光標(biāo)記基因座引物序列(5’熒光染料名稱熒光顏色D21S1409F:GGAGGGGAATACATTTGTGTAGGTAR:CTCTTTGTCTCTTGGAACATACGC6-FAM藍(lán)色GATA163G03F:GAGGGTTCCCTAGAGAGACAGATR:CTCAAGACTCAAACTGGCTCTCT6-FAM藍(lán)色D21S1422F:GCACCCCTTTATACTTGGCTGTR:AAGACTTCTCGATCTCCAGAATCACAlexa

Fluor532綠色D21S1435F:CCTCTCCAATTGTTTGTCTACCCTR:GCAAGAGATTTCAGTGCCATCAAGAlexa

Fluor546黃色1.2.3ABI3130遺傳分析儀檢測(cè)將1μlPCR產(chǎn)物與9μl混合物（甲酰胺和Liz500）加入上樣板中，經(jīng)95℃變性5min、4℃10min后通1.2.4等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備根據(jù)檢測(cè)的4個(gè)基因座多態(tài)情況，分別制備等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物后混合，作為多重等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)上樣，每一批上樣樣本中至少添加一個(gè)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物,見(jiàn)圖1。圖14個(gè)基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物圖1.2.5數(shù)據(jù)分析利用GeneMapperIDv4.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分型。應(yīng)用Modified-powerstate、SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)（p-value＞0.05符合Hardy-Weinberg平衡），得出4個(gè)STR基因座的等位基因及基因型頻率、各基因座的觀察雜合度(Ho)、理論雜合度(He)、匹配概率（Pm）、個(gè)體識(shí)別率（DP）、多態(tài)性信息含量(PIC)、非父排除率(PE)等相關(guān)量值。每個(gè)STR基因座檢測(cè)出現(xiàn)約1:1:1等比例峰或2:1(或1:2)峰為相應(yīng)染色體的三倍體，出現(xiàn)單峰為無(wú)意義峰，兩個(gè)峰值比例在大于0.65或小于1.8間或圖形難以判斷屬于不明確意義峰[8]。本研究判定單樣本出現(xiàn)1個(gè)等比例三峰或1個(gè)以上2:1(1:2)峰為篩查結(jié)果陽(yáng)性，其余為篩查陰性結(jié)果。結(jié)果1.3.1基因頻率及群體遺傳數(shù)據(jù)重慶地區(qū)漢族群體這4個(gè)STR基因座基因頻率分布見(jiàn)表2，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。各基因座遺傳學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)SPSS18.0分析表3可見(jiàn)，本研究的4個(gè)STR基因座的觀察雜合度為0.731±0.051，理論雜合度為0.725±0.035；匹配概率值為0.128±0.028，多態(tài)信息含量值為0.68±0.086；個(gè)體識(shí)別能力和非父排除率值分別為0.872±0.028和0.491±0.084?？梢?jiàn)，4個(gè)基因座的雜合度(H＞0.64)、識(shí)別能力(DP＞0.802)和信息量(PIC＞0.58)均較高。表2重慶地區(qū)漢族群體4個(gè)STR基因座的等位基因及基因頻率（n=212）D21S1409GATA163G03D21S1422D21S1435AFAFAFAF90.434080.002440.004760.0967100.009490.025950.014270.3255110.0094100.221760.073180.2311120.1887110.450570.103890.2406130.3585120.235880.2406100.0943130.044890.3090110.0118140.0118100.1580150.0071110.0684120.0212130.0071140.0047150.0142注：A—等位基因；F—基因頻率表34個(gè)STR基因座的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)（n=212）基因座等位基因數(shù)基因型數(shù)HoHePmDPPICPEp-valueD21S14095110.6460.6470.1980.8020.580.3500.935GATA163G038190.6420.6890.1420.8580.640.3440.118D21S142212310.8350.8000.0700.9300.770.6650.230D21S14356160.8020.7640.1010.8990.730.6030.219注：Ho觀察雜合度；He理論雜合度；Pm匹配概率；DP個(gè)體識(shí)別能力；PIC多態(tài)信息含量；PE非父排除率.1.3.2待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果及染色體檢查結(jié)果18個(gè)樣本的4個(gè)STR基因座的分型結(jié)果峰形均較好，清晰，可清楚判型。18個(gè)樣本的染色體核型結(jié)果由重慶市人口和計(jì)劃生育研究院實(shí)驗(yàn)中心檢測(cè)提供。2～6號(hào)家庭的疑似患兒均出現(xiàn)三個(gè)檢測(cè)峰，1號(hào)家庭患兒雖然沒(méi)有出現(xiàn)三峰，但是D21S1422基因座檢測(cè)結(jié)果8與10的峰值比為3：1，可判定為陽(yáng)性。根據(jù)所檢測(cè)的結(jié)果對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行判定，提示這6個(gè)家庭的小孩均為21三體綜合征，而他們的父母為正常的。這與染色體檢查結(jié)果相一致(表4、圖2)。表4待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果及染色體檢查結(jié)果序號(hào)染色體核型基因型D21S409GATA163G03D21S1422D21S14351F46,xy9，1211，118，97，8M46,xx9，1111，129，108，9C47,xy,+21/46,xy9，911，118，10（3：1）8，82F46,xy9，910，107，97，8M46,xx9，1311，128，87，9C47,xy,+219，1310，11，127，87，8，93F46,xy9，1311，118，117，7M46,xx12，1310，119，107，7C46,xy/47,xy,+219，12，1310，119，10，117，74F46,xy12，1312，129，97，7M46,xx13，1310，107，88，9C47,xy,+2112，1310，127，8，97，8，95F46,xy9，1312，139，118，9M46,xx9，1211，128，87，8C47,xx,+219，1310，115，6，97，8，106F46,xy9，1311，116，97，9M46,xx9，1212，127，107，10C47,xx,+219，12，1311，126，7，107，10（2：1）注：F—父親；M—母親；C—小孩圖26號(hào)家庭父（F）、母（M）、子（C）的檢測(cè)分型圖1.4討論唐氏綜合征是一類以特異性容貌和器官畸形為特征的染色體常見(jiàn)病，是人類最常見(jiàn)的染色體疾病，也是出生缺陷和遺傳性智障最常見(jiàn)的形式。約90%是由于減數(shù)分裂時(shí)21號(hào)染色體不分離而形成的21三體，約有2%～3%是由于唐氏綜合征致病基因關(guān)鍵區(qū)域發(fā)生了染色體隱蔽性重復(fù)所致[9]。經(jīng)典的檢驗(yàn)方法是取患者外周靜脈血培養(yǎng)，制備染色體，經(jīng)胰酶分帶，吉姆薩染色，經(jīng)染色體圖像分析系統(tǒng)攝影分析，進(jìn)行染色體鑒定。這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，方法繁瑣，檢驗(yàn)周期長(zhǎng)(一般需要1～2周)。由于該病的發(fā)病機(jī)制是染色體異常所致，所以針對(duì)患者、疑似患者或胎兒的遺傳基因進(jìn)行鑒定是最直接的方法。全基因組拷貝數(shù)分析可以對(duì)全基因組拷貝數(shù)變異進(jìn)行分析，但是該方法依賴公司芯片及大型分析設(shè)備，成本高，操作復(fù)雜，數(shù)據(jù)信息量大以致于分析相對(duì)復(fù)雜。本研究所采取的方法，原理類似從全基因組探針中挑取出針對(duì)21號(hào)染色體部分探針，這樣可以過(guò)濾很多無(wú)關(guān)數(shù)據(jù)，檢測(cè)迅速，分析簡(jiǎn)單，最快在1天內(nèi)即可完成。STR通常是由2～6個(gè)堿基對(duì)作為核心單位，串聯(lián)重復(fù)核心序列而成的一類DNA序列，由于核心重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化構(gòu)成了STR位點(diǎn)高度的遺傳多態(tài)性，它在人類基因組中廣泛分布，是遺傳分析中常用的一類遺傳標(biāo)記。目前研究也表面STR是PCR檢測(cè)染色體數(shù)目異常最方便的遺傳標(biāo)記[10]。本研究中所選取的D21S1409、D21S1435基因座據(jù)報(bào)道的多態(tài)性信息含量分別為0.632和0.710；雜合度分別為0.69和0.75[11]，本研究結(jié)果與我們?cè)谥貞c地區(qū)漢族人群檢測(cè)結(jié)果基本相同，另外選擇的兩個(gè)位點(diǎn)GATA163G03和D21S1422也具有很好的遺傳信息。我們研究表面21號(hào)染色體上這4個(gè)基因座（D21S1409、GATA163G03、D21S1422和D21S1435），通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的熒光引物復(fù)合擴(kuò)增后采用ABI3130檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)特異性的檢測(cè)峰——1:1:1等比例峰或2:1(或1:2)峰現(xiàn)象，與染色體核型分析診斷結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，判別一致。通過(guò)本研究提示我們選擇第21號(hào)染色體上的遺傳標(biāo)記，采用多重定量PCR技術(shù)檢測(cè)第21號(hào)染色體的數(shù)目，可快速篩查確診唐氏綜合征，該技術(shù)不僅可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷，甚至應(yīng)用于產(chǎn)前普查。但是由于我們病歷數(shù)較少，后期仍然需要擴(kuò)大樣本檢測(cè)量和檢測(cè)有效基因座的數(shù)目進(jìn)一步驗(yàn)證和規(guī)范基因型判定和定量分析標(biāo)準(zhǔn)，參考文獻(xiàn)：[1]胡美紅,劉雨生,何國(guó)平,等.羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2011,13(1):23-25.[2]王志敏,杜紹敏.唐氏綜合征系列產(chǎn)前篩查對(duì)優(yōu)生優(yōu)育必要性的臨床研究[J].中國(guó)傷殘醫(yī)學(xué),2010,18(1):57-58.[3]Ulate-CamposA,NascimentoA,OrtezC.Down’ssyndromeandepilepsy[J].RevMedIntSindrDown,2014,18(1):3-8.[4]SunL,FanZQ,WengXJ,etal.RapiddetectionofDown'ssyndromeusingquantitativereal-timePCR(qPCR)targetingsegmentalduplicationsonchromosomes21and11[J].Gene,2014,552:272–276.[5]WendyH