毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)三小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)三、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

微核的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱(chēng)微核。

微核(Micronucleus)的概念微核試驗(yàn)(Micronucleustest，MNT)的概念

微核試驗(yàn)是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試驗(yàn)。主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑(染色體損傷)。

傳統(tǒng)的微核試驗(yàn)是體內(nèi)試驗(yàn),常用細(xì)胞小鼠骨髓多染紅細(xì)胞(PCE)

微核可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區(qū)別。由于紅細(xì)胞在成熟之前最后一次分離后數(shù)小時(shí)可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此通常計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中的微核。

實(shí)驗(yàn)步驟1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理2．骨髓液的制備和涂片3．固定4．染色5．觀察計(jì)數(shù)

6.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1．試驗(yàn)動(dòng)物及處理

（1）動(dòng)物選擇：小鼠，分為五組，每組8只（2）染毒途徑：腹腔注射（3）受試物：環(huán)磷酰胺（4）劑量設(shè)計(jì)：12.5、25、50、75、100mg/kg染毒次數(shù)及取樣時(shí)間：一般采用兩次染毒或多次染毒。

兩次染毒：第一次染毒后24小時(shí)進(jìn)行第二次染毒，

6小時(shí)后取樣；

多次染毒：每天染毒1次，連續(xù)染毒5天，末次染毒后24小時(shí)取樣。2．骨髓液的制備和涂片

處死：頸椎脫臼法處理：取股骨，去掉血污和肌肉，用彎止血鉗將骨髓擠于預(yù)先滴有生理鹽水的清潔載玻片上，混合均勻后推片

3．固定：

將推好晾干的骨髓片放進(jìn)染色缸中，甲醇固定15分鐘，取出晾干。4．染色(建成試劑盒Giemsa染液)

用染液一3滴，染色8min，再加染液二6滴，洗耳球混勻5min。細(xì)流水沖掉玻片染色液，晾干。5．觀察計(jì)數(shù)

先用低倍鏡觀察，選擇分布均勻的區(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。

PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）桔黃色。細(xì)胞中的微核大半呈圓形，邊緣光滑，嗜色性與核質(zhì)一致，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核。計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)，并計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中PCE/NCE的比值。6.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE／NCE為評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)。正常的PCE/NCE比值為1（0.6-1.2），如果＜0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；如果＜0.05，則表示受試物劑量過(guò)大，結(jié)果不可靠。

注意事項(xiàng)：

1.注意不要把股骨剪斷

2.擠出骨髓處的肌肉要剔除干凈

3.滴到玻片上的生理鹽水不要太多，涂時(shí)要涂勻，以便推片

4.染色前可以先看一下整體涂片情況，細(xì)胞分散度是否良好