離子交換層析技術(shù)

關(guān)于離子交換層析技術(shù)第1頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第一節(jié)基本原理與特點離子交換法：利用溶液中帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進行物質(zhì)分離的操作方法。帶電粒子與離子交換劑間的作用力是靜電力。電荷密度、電荷種類2第2頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換劑離子交換劑：由惰性的不溶性載體、功能基團和平衡離子組成。陽離子交換劑：平衡離子帶正電荷。陰離子交換劑：平衡離子帶負電荷。R-X++Y+R-Y++X+R-表示陽離子交換劑的功能基團和載體；X+為平衡離子；Y+為交換離子。3第3頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五吸附選擇性吸附：調(diào)節(jié)溶液的pH值，使目的物帶有相當數(shù)量的靜電荷，而主要雜質(zhì)離子帶相反電荷或較弱的電荷。選擇合適的樹脂（如陽離子交換樹脂），便可使目的物被離子交換樹脂吸附，而雜質(zhì)較少被吸附。4第4頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五洗脫（1）調(diào)節(jié)洗脫液的pH值。（2）用高濃度的同性離子將目的物離子取代下來。對陽離子交換樹脂而言，目的物的pI值愈大（愈堿），將其洗脫下來所需溶液的pH值也愈高。

5第5頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換樹脂吸附和洗脫過程6（1）X+為平衡離子，YH+及Z+為待分離離子；（2）YH+和Z+取代X+而被吸附；（3）加堿后YH+失去正電荷，被洗脫；（4）提高X+的濃度取代出Z+第6頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第7頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五樹脂的選擇pH大于等電點時，物質(zhì)帶負電荷，與陰離子交換劑進行交換；pH小于等電點時，物質(zhì)帶正電荷，可以與陽離子交換劑進行交換。

8第8頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五蛋白質(zhì)等電點與所用交換劑9第9頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換技術(shù)的應(yīng)用10第10頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第二節(jié)離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)和種類

離子交換樹脂構(gòu)成：（1）惰性的不溶性高分子固定骨架，稱載體。（2）與載體共價鍵連接的不能移動的活性基團，又稱功能基團。（3）與功能基團以離子鍵連接的可移動的活性離子，亦稱平衡離子。如聚苯乙烯磺酸型鈉樹脂。11第11頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五陽離子交換樹脂分類強酸型樹脂：磺酸型樹脂，功能基團為磺酸根(—SO3H)及甲基磺酸根(—CH2SO3H)，有好的解離能力。中酸性樹脂：磷酸型樹脂（—PO3H2）弱酸性樹脂：羧酸型樹脂和酚型樹脂（—COOH,），在酸性環(huán)境中解離度受到抑制。12第12頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五陰離子交換樹脂強堿型陰離子交換樹脂：

弱堿型陰離子交換樹脂：活性基團為伯、仲、叔胺基。在堿性環(huán)境中解離度受到抑制。中強堿性陰離子交換樹脂：兼有以上兩類活性基團。

13第13頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換樹脂功能基團的電離常數(shù)

14第14頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換樹脂的性能15第15頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五兩性樹脂：蛇籠樹脂(snake-cageresins)16第16頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換樹脂的命名第17頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換樹脂的命名方式：離子交換產(chǎn)品的型號以三位阿拉伯數(shù)字組成，第一位數(shù)字代表產(chǎn)品的分類，第二位數(shù)字代表骨架的差異，第三位數(shù)字為順序號用以區(qū)別基因、交聯(lián)劑等的差異。表8-1樹脂型號中的一、二位數(shù)字的意義代號：0123456分類名稱：強酸性弱酸性強堿性弱堿性螫合性兩性-氧化還原性骨架名稱：

苯乙烯系丙烯酸系醋酸系環(huán)氧系乙烯吡啶系脲醛系氯乙烯系101樹脂？D011樹脂？第18頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五強酸類1～100號；弱酸類101～200；強堿類201～300；弱堿類301~400；中強酸類401～500交聯(lián)度：是合成載體骨架時交聯(lián)劑重量的百分數(shù)，用“×”將樹脂編號與交聯(lián)度分開。弱酸101×4其交聯(lián)度為4％。國內(nèi)常用樹脂命名：724；732(001×7)；71719第19頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五大孔樹脂在型號前加“D”，凝膠型樹脂的交聯(lián)度值可在型號后用“×”號連接阿拉伯數(shù)字表示。如D011×7，表示大孔強酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂，其交聯(lián)度為7。國外一些產(chǎn)品用字母C代表陽離子樹脂（C為cation的第一個字母），A代表陰離子樹脂（A為Anion的第一個字母），如Amberlite的IRC和IRA分別為陽樹脂和陰樹脂，亦分別代表陽樹脂和陰樹脂。第20頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換樹脂的骨架(p126)

（一）苯乙烯型離子交換樹脂由苯乙烯與二乙烯苯經(jīng)過氧苯甲酰催化聚合而成。交聯(lián)度21第21頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五22第22頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五（二）丙烯酸型離子交換樹脂丙烯酸型陽離子交換樹脂：是由丙烯酸甲酯與二乙烯苯經(jīng)過氧苯甲酰催化聚合而成。23第23頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五丙烯酸型陽離子交換樹脂110樹脂：丙烯酸甲酯與二乙烯苯聚合而成。724樹脂：它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯三元共聚而得。24第24頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五（三）陰離子及其它交換樹脂

蛇籠樹脂：脫鹽

螯形樹脂：金屬離子吸附樹脂：“脫色樹脂”

熱再生離子交換樹脂：

25第25頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五常用離子交換樹脂特性表

26第26頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第三節(jié)離子交換(p129)R－B++A+R－A++B+離子交換過程：1、A+從溶液擴散到樹脂表面。2、A+從樹脂顆粒表面擴散到顆粒中心。3、平衡離子A+與離子B+交換。4、B+從交換中心擴散到離子表面。5、B+再擴散到溶液中。27第27頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五粒子擴散

速度：

顆?？讖?、

顆粒半徑、樹脂交換容量、

離子A+的半徑與電荷、平衡離子的性質(zhì)（電荷、半徑）。28第28頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換速度的影響因素：1、樹脂粒度：樹脂粒度大，交換速度慢。2、攪拌速度3、樹脂交聯(lián)度：交聯(lián)度大，交換速度低。4、離子半徑和離子價：離子每增加一個電荷，交換速度下降一個數(shù)量級。5、溫度。6、離子濃度：交換速度隨離子濃度的上升而加快。29第29頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第四節(jié)離子交換樹脂的性能一、離子交換對樹脂的基本要求二、影響樹脂性能的幾個因素三、主要理化常數(shù)的測定30第30頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五一、離子交換對樹脂的

基本要求*(p126)：1、有盡可能大的交換容量。2、有良好的交換選擇性。3、化學性質(zhì)穩(wěn)定。4、化學動力學性能好。5、物理性能好。31第31頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五二、影響樹脂性能的幾個因素1、離子交換樹脂具有的功能基團性質(zhì)和數(shù)目，數(shù)目是其交換容量的基礎(chǔ)。（pH）2、樹脂的交聯(lián)度——樹脂強度、交換選擇性、動力學性質(zhì)。3、樹脂骨架和平衡離子。

32第32頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五pH對交換容量的影響33第33頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五

鈉型樹脂與氫型樹脂偶極離子在離子交換過程中的行為是很特殊的，以氨基酸的交換為例：RSO3-Na++H3+NRCOO-RSO3-H3+NRCOO-+Na+

RSO3-

H++H3+NRCOO-RSO3-H3+NRCOOH鈉鹽樹脂氫型樹脂，被取代的氫離子為羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶極，與樹脂之磺酸基沒有排斥力。與鈉型樹脂相比，氫型樹脂有較大的有效交換容量。

34第34頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五三、主要理化常數(shù)的測定1、含水量：常用干燥法和離心法測得。2、膨脹度：膨脹系數(shù)K膨脹。3．濕真密度－樹脂充滿水時的密度。4.交換容量:meq/g樹脂。35第35頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五交換容量測定方法(p128)陽離子交換樹脂（氫型）的測定方法：一定量樹脂中加入NaOH溶液，一天或數(shù)天后測定NaOH剩余量，從消耗的堿量求交換容量。陰離子交換樹脂（氯型）的測定方法：一定量樹脂裝柱，用過量Na2SO4溶液進行離子交換，測定流出液中氯離子總量，求交換容量。36第36頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五滴定曲線：37第37頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五滴定曲線381．強酸樹脂AmberliteIR-120；2．弱酸樹脂AmberliteIRC-84；3．強堿樹脂AmberliteIRA-400；4．弱堿樹脂AmberliteIR-45第38頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第五節(jié)

離子交換的選擇性

影響離子交換選擇性的因素：離子價與離子水合半徑離子價與離子濃度交換環(huán)境樹脂結(jié)構(gòu)偶極離子排斥39第39頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五一、離子的化合價與水合半徑的影響：相對親和力和相對濃度。電荷效應(yīng)越強的離子與樹脂的親和力越大，而決定電荷效應(yīng)的主要因素是價電數(shù)和離子半徑。40第40頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五一價陽離子親和力的次序是：H+≈Li+＜Na+＜K+≈NH4+＜Ag+

對強堿性樹脂陰離子親和力次序：F－＜OH－＜HCOO－

＜Cl－＜Br－＜I－＜SO42-對弱堿性樹脂陰離子親和力次序：F－＜Cl－＜Br－=I－=Ac－＜SO42-＜OH－。41第41頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換樹脂的性能42第42頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五強酸強堿樹脂對各種離子的選擇系數(shù)

H+≈Li+＜Na+＜K+≈NH4+＜Pb+＜Cs+＜Ag+＜Ti+。43第43頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五二、離子化合價與離子濃度的影響：設(shè)離子平衡后溶液中兩種離子的濃度比是定值P.C1/C2=P在稀溶液(C2較小)中，樹脂吸附高價離子的傾向很大。

44第44頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五舉例例如：當k=2P=1m1+m2=1C2=0.1mol/LZ2=1時若Z1=2則m1＝0.9，m2＝0.1若Z1=3則m1＝0.97，m2＝0.03在較稀的溶液中，樹脂幾乎僅吸附高價離子。45第45頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五三、交換環(huán)境的影響1、溶液的pH：解離度、交換容量、選擇性。2、離子強度：交換容量、選擇性、交換速度3、有機溶劑：能降低有機離子的解離程度。46第46頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五四、樹脂結(jié)構(gòu)的影響

（一）樹脂載體的交聯(lián)度：交聯(lián)度上升，膨脹度下降，K值增大，樹脂潛在的選擇能力提高?？障洞笮〉挠绊懀磁蛎浂仍龃?，促使樹脂吸附量增加。選擇性的影響，膨脹度增大時，K值減小，促使樹脂吸附量降低；膨脹系數(shù)值很小時，空間效應(yīng)占主要地位。膨脹系數(shù)增大到一定值時，選擇性占主要地位。47第47頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五圖8.14用磺酸基樹脂CBC從含有HCl的溶液中，吸附土霉素的量與樹脂膨脹度之間的關(guān)系1-0.1NHCl；2-0.25NHCl；3-0.5NHCl；4-1.0NHCl;原始溶液中士霉素濃度為0.4mg/ml;m-對土霉素吸附量meq/g第48頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五膨脹度與選擇性的關(guān)系49圖8.12在甲基丙烯酸—丙烯酰胺樹脂，鏈霉素與鈉離子交換等溫線與樹脂膨脹的關(guān)系1—膨脹系數(shù)1.9；2—膨脹系數(shù)3；3—膨脹系數(shù)4.5；4—膨脹系數(shù)5.2；m1—樹脂對鏈霉素吸附量，meq/g；m2=m－m1；m—樹脂的最大交換容量，meq/g；C1，C2—溶液中鏈霉素和鈉離子濃度，meq/ml第49頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五（二）輔助力：離子交換樹脂與被吸附離子間的作用力除靜電力外，還存在一種輔助力。無機離子交換常數(shù)K值多在1~10之間。有機離子交換時，K值可高達102~103。（三）其它結(jié)合力：某些樹脂對金屬離子有特殊的親和力。

羧酸型樹脂

50第50頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五

五、偶極離子排斥作用：偶極離子RSO3-Na++H3+NRCOO-RSO3-H3+NRCOO-+Na+

RSO3-

H++H3+NRCOO-RSO3-H3+NRCOOH鈉鹽樹脂氫型樹脂與鈉型樹脂相比，氫型樹脂有較大的有效交換容量。

51第51頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五氫型與鈉型磺酸基樹脂吸附氨基酸比較

52第52頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第六節(jié)

離子交換的操作一、

樹脂的選擇(p129)目的物是弱酸性或弱堿性的小分子物質(zhì)時，宜選用強酸強堿樹脂（氨基酸的分離）。蛋白質(zhì)、酶和其它生物大分子的分離多采用弱堿或弱酸性樹脂，減少生物大分子的變性，利于洗脫，提高選擇性。

53第53頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五

二、樹脂的處理和再生(p130)

1、

外觀特征透明或半透明；顆粒圓整，粒度均勻，強度。2、

樹脂的預(yù)處理（1）

物理處理：去雜，過篩。（2）化學處理：用8～10倍的1mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液交替浸泡。

54第54頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五氨基酸分離前樹脂的處理55第55頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五不同類型樹脂的處理56第56頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五樹脂的再生

樹脂再生：使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理過程。再生過程：（1）

去雜，大量水沖洗，除去物理吸附的雜質(zhì)。（2）

用酸、堿處理除去與功能基團結(jié)合的雜質(zhì)。(3)轉(zhuǎn)型：57第57頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五三、加樣與洗脫交換：靜態(tài)交換動態(tài)交換洗脫：洗脫方式：分靜態(tài)洗脫及動態(tài)洗脫兩種，pH及離子強度改變。洗脫液：酸、堿、鹽。58第58頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五酸、堿洗脫液旨在改變吸附物的電荷或改變樹脂吸附基團的解離狀態(tài)，以消除靜電結(jié)合力，迫使目的物被釋放出來；鹽類洗脫液是通過高濃度的同種電荷的離子與目的物競爭樹脂上的活性基團，使吸附物解離。

59第59頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五洗脫方式動態(tài)洗脫：1、溶液pH及離子強度不變。2、分階段改變?nèi)芤簆H及離子強度。3、連續(xù)改變?nèi)芤簆H及離子強度。梯度洗脫：自動化的梯度儀60第60頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五梯度洗脫梯度混合器:

A瓶為低濃度鹽溶液B瓶為高濃度鹽溶液C=CA―（CA―CB）VAA/AB61第61頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五四、離子交換層析的注意事項五、離子交換層析中常見問題的分析第62頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第七節(jié)離子交換層析的應(yīng)用在制藥工業(yè)中的應(yīng)用(p136)分離純化——氨基酸制備無鹽水制備離子交換層析分離鏈霉素(p142)離子交換層析分離慶大霉素63第63頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第七節(jié)應(yīng)用實例分離純化——氨基酸制備無鹽水制備64第64頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五氨基酸制備、分離豬血粉水解制備6種氨基酸:65第65頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五無鹽水制備無鹽水制備是利用氫型陽離子交換樹脂和羥型陰離子交換樹脂的組合以除去水中所有的離子，其反應(yīng)式如下：66第66頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五無鹽水制備陽離子交換樹脂用強酸性樹脂，陰離子交換樹脂可以用強堿或弱堿樹脂。強酸——弱堿或強酸——強堿；當對水質(zhì)要求高時，經(jīng)過一次組合脫鹽，還達不到要求，可采用兩次組合:強酸——弱堿——強酸——強堿；強酸——強堿混合床。67第67頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五混合床混合床系將陽、陰兩種樹脂混合而成，脫鹽效果好?；旌洗仓兴l(fā)生的反應(yīng):68第68頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五混合床－無鹽水69圖8.20混合床的操作(a)為水制備時的情形；(b)為制備結(jié)束，用水逆流沖洗。陽、陰樹脂根據(jù)比重不同分層，一般陽樹脂較重在下面，陰樹脂在上面；(c)為上部、下部同時通入堿、酸再生，廢液自中間排出；(d)為再生結(jié)束，通入空氣，將陽、陰樹脂混合、準備制水

第69頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五混合床－抗生素脫鹽經(jīng)過第一柱（陽樹脂）時，溶液變酸，而經(jīng)過第二柱（陰樹脂）時，溶液又變堿。鏈霉素脫鹽：強酸1×25和弱堿311×4樹脂組成混合床，脫鹽效果較好。70第70頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換層析分離鏈霉素(p142)離子交換層析分離慶大霉素第71頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五第八節(jié)新型離子交換劑

一、大孔、均孔樹脂（一）大孔型離子交換樹脂（macroporous,MP）（二）均孔型離子交換樹脂(IR)二、多糖基離子交換劑（一）離子交換纖維素（二）葡聚糖凝膠離子交換劑72第72頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五大孔型與凝膠型離子交換樹脂物理性質(zhì)73第73頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五（一）大孔型離子交換樹脂的特征

（1）載體骨架交聯(lián)度高。（2）孔徑大。（3）表面積大，表面吸附強，對大分子物質(zhì)的交換容量大。（4）孔隙率大。74第74頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五大孔型離子交換樹脂主要特性

75第75頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五（二）均孔型離子交換樹脂主要是陰離子交換樹脂。骨架的交聯(lián)度比較均勻。代號為IP或IR。交聯(lián)度均勻，孔徑大小一致，交換容量都較高，膨脹度、機械強度好。76第76頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五二、多糖基離子交換劑

生物大分子對離子交換的要求:

固相載體具有親水性和較大的交換空間;對其生物活性有穩(wěn)定作用，并便于洗脫。生物來源穩(wěn)定的高聚物——多糖作載體。多糖基離子交換劑可以分為：離子交換纖維素葡聚糖離子交換劑

77第77頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五（一）離子交換纖維素特點：(1)開放的長鏈骨架，親水性強，表面積大，易吸附大分子。(2)交換基團稀疏，對大分子的實際交換容量大。(3)吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不宜變性。(4)分辨率高。78第78頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五常用的離子交換纖維素羧甲基纖維素（CM-C）：弱酸性陽離子交換纖維素，pK=3.6。二乙基氨基乙基纖維素（DEAE-C）：強堿型陰離子交換纖維素，pK=9.1。79第79頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五80第80頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換纖維素的制備

81第81頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五操作注意點可靜態(tài)交換，也可動態(tài)交換。交換基團密度低、吸附力弱。鹽濃度不宜高（控制在0.001~0.02mol/L）。

82第82頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換纖維素的選擇—解離曲線83第83頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換纖維素的解吸

洗脫緩和。升高環(huán)境的pH、降低pH或是增加離子強度都能將被吸附物質(zhì)洗脫下來。

84第84頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五離子交換纖維素的處理和再生

酸堿濃度要適當降低，處理時間也從4h縮短為0.3~1h。以交換緩沖液平衡。注意：不耐酸，用酸處理的濃度和時間須小心控制。85第85頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五（二）葡聚糖凝膠離子交換劑是將活性交換基團連接于葡聚糖凝膠上制成的各種交換劑。命名:交換活性基團-SephadexC(A)-編號。具有離子交換和分子篩的雙重作用，對生物分子有很高的分辨率。

86第86頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五常用的離子交換葡聚糖87第87頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五瓊脂糖凝膠離子交換劑瓊脂糖凝膠上引入功能基DEAE—sepharoseCL-6BCM—sepharoseCL-6BDEAE—ToyopearlCM—Toyopearl88第88頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五多糖基離子交換劑應(yīng)用

——尿激酶分離純化89第89頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五補充—離子交換聚焦色譜

色譜聚焦（chromatofocusing）:是一種高分辨的新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點，結(jié)合離子交換技術(shù)的大容量色譜，能分離幾百毫克蛋白質(zhì)樣品，洗脫峰被聚焦效應(yīng)濃縮，分辨率高。適用水溶性的兩性分子，如蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸等。

90第90頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五一、色譜聚焦的原理（一）自動形成pH梯度。（二）蛋白質(zhì)的色譜行為（三）聚焦效應(yīng)

91第91頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五PH梯度溶液的形成在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由于交換劑帶有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。92第92頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五PBE94柱聚焦色譜的pH梯度93（1）柱內(nèi)每點的PH值從高到低逐漸下降。（2）從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。（3）PH梯度會逐漸向下遷移。（4）底部流出液的PH由9逐漸降至6。第93頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五蛋白質(zhì)的色譜行為當柱中PH低于蛋白質(zhì)的PI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，不與陰離于交換劑結(jié)合,隨洗脫液向下移動。當?shù)鞍踪|(zhì)移動至環(huán)境PH高于其PI時，蛋白質(zhì)由帶正電荷變?yōu)閹ж撾姾桑⑴c陰離子交換劑結(jié)合。由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境PH再次低于PI時，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來而下降

。移至pH大于PI時又重新結(jié)合，直至蛋白質(zhì)從柱下流出。

不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在被離子交換劑結(jié)合以前，移動距離是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點排列的。94第94頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五聚焦效應(yīng)當一種蛋白質(zhì)在柱上隨洗脫液下移至等電點處時，移動速度明顯減慢。此時加上相同的第二個樣品，它將以洗脫液移動的速度下降，直至追到正在慢移的第一個樣品（聚焦）。如果加入的第二個樣品的等電點比第一個樣品高，它可以越過第一個樣品區(qū)先被洗脫出來。

95第95頁，共107頁，2022年，5月20日，14點46分，星期五三、多緩沖交換劑

PBE94是以交聯(lián)瓊脂糖6B（Sepharose6B）為載體，并在糖基上通過醚鍵偶合上配基制成