western 內參選擇 大討論

PAGE17/NUMPAGES17在westernblot實驗中，內參的使用是個很重要的部分，

看到很多站友對內參的選擇經常有些疑問，鑒于此，希望能在一個帖子里面綜合所有相關問題，展開討論，共同學習。

我先提幾個，拋磚引玉，希望大家繼續(xù)。

1。為什么一定需要內參？內參的重要性。

2。常用的幾種內參。

3。不同的情況如何選擇不同的內參。支持一下！

1：用內參照是為了評價你的各個上樣孔內蛋白的總量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。這些蛋白在所有細胞中的表達量基本一致，所以用他們來作為你加樣量的對照。這樣western結果中你的目的蛋白經過處理后發(fā)生變化，而內參的條帶基本均勻一致。這樣才有說服力，表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或是人為造成目的條帶濃度的變化。嚴格意義上說，內參事必須做的。

2：常用的內參有：b-actin，GAPDH，近2-3年，更詳細的研究發(fā)現，β-Tubulin(球管蛋白)，被廣泛應用于WesternBlotting，β－Tubolin分子量為55KD左右。

3：一般我們選擇內參及要檢測的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你檢測的蛋白的分子量來選擇合適的內參！

個人一些見解，供參考！內參的重要性，必要性：

要檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比較表達產物量的相對變化，首選方法是WesternBlot。

因為WesternBlot操作相對簡單方便，既可以定性分析表達產物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。雖然，順利的時候WesternBlot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結果啦、假陽性啦、結果出現多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴謹的WesternBlot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有用。特別是當實驗出現問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應的分子量大小），空白載體對照（如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照），已知量標準產物的正對照；另外還有內參。各種不同對照可是由于經費限制或者偷懶的原因，國內的不少人做WesternBlot往往省略參照，導致結果出現問題時無法分析結果――即便有結果也可能影響結果的分析。

內參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用WesternBlot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析。所以你需要內參。

內參即是內部參照（InternalControl），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(HousekeepingProteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在WesternBlotting實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。

在國外發(fā)表的文章中，WesternBlotting實驗結果須進行內參校正已成為一種慣例。但是，國內仍有不少科研人員在WesternBlotting實驗中忽略了內參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。

然而各種蛋白質濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的準確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。BCA法及Lowry法都容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且及一系列干擾Lowry，BCA反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。另外，蛋白質定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Westernblotting實驗時使用內參，即可簡便地對定量和上樣步驟產生的誤差進行校正。

在WesternBlotting中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個WesternBlot顯色或者發(fā)光體系是否正常。內參原理各種不同對照內參原理我想問一下,內參和目的蛋白相差15kD能不能將膜上他門的位置(用預染)分別剪下來,孵育啊?還是必須得跑兩張膜一個內參一個目的蛋白啊?洗膜的時候可以放在一起洗么?如果他們是同源的二抗可以放在一起孵育么?回答樓上的問題：完全可以剪開分別加一抗孵育，我就是這么做的；洗膜時最好分開洗滌，放在一起的話兩張膜可能重疊在一起，影響洗膜效果；如果不剪膜，你兩個一抗來源相同而且特異性很好（單抗）的話，可以一起孵育，不過應該注意可能存在的交叉反應，你可以嘗試一下看看結果再定。本人是新手，問一個很汗的問題，原核表達也需要做內參么？做內參的蛋白在哪里找？

不甚感激在WesternBlotting實驗過程中使用內參的方法有：

一、超級簡便的標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可。

二、普通內參：當目的蛋白的分子量大小及選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

三、當目的蛋白的分子量大小及選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白及目的蛋白分開。然后兩塊膜分別及內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。

常用的蛋白質內參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我們實驗室使用最多的是***工程有限公司及國外實驗室合作開發(fā)的GAPDH，100μl一支，濃度為100μg/100μl，價格為988元人民幣。雖然公司網上稱稀釋比達1：10000以上，至少可做100次Westernmini-blots，但我們一般按照1：5000～6000稀釋，不過效果確實非常好，熒光條帶非常亮，而且抗體使用3～4次也沒太大改變。

我們也使用過博奧森的beta-actin，200ul480元，稀釋比1：200～500。因為稀釋比不高，所以價格并不便宜。更可氣的是，我PC12細胞居然有兩條條帶，小鼠也是兩條。我也同意剪開,但是別忘記一個問題.

你要確保你剪開的部位沒有蛋白.kangchen的HRP－標記內參很好

不需要剪膜更為直觀，有說服力我做了半年的western,就我對內參的理解如下

1.所選內參有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些細胞的基本結構蛋白或是管家蛋白,細胞表達穩(wěn)定,且表達水平高,在同一種類的細胞上表達基本一致.

2.做內參可以:一,檢驗你的整套western裝置是否正常runeffectively.包括你的配液,你的膠以及電泳和轉移,一抗的效價以及顯色等.二檢測你的樣品蛋白含量是否相等.

3.選擇內參要根據你的目的蛋白的性質即你的目的蛋白是胞內還是核內,你蛋白的分子量是大是小,當然還有價錢以及你的目的.

4.一般內參是比較容易作出來的,同時它也是幫助你摸索條件的,你把其做漂亮,你后面就很順利了,只是轉移的條件有點變化.其余照樣或根據說明書操作.我想請問一下如果內參和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的內參都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分塊膠來跑呢？那么，我想請教一下用過β-actin做內參的朋友，有沒有遇到過β-actin抗體檢測不到小鼠心肌和肌肉組織β-actin的情況？當然前提是：1，我的確提取到了心肌和肌肉組織的總蛋白，且檢測到了我的目的條帶。2，用此抗體可以檢測到其他組織中β-actin條帶。

也發(fā)現，在碧云天網站上，曾提及“本抗體不能用于成年動物心肌或骨骼肌的免疫染色”。具體什么原因造成這種情況，我也不想太麻煩去搜了，還請知道的戰(zhàn)友指教。同時也算是給朋友們提個醒吧。

另，我曾用GAPDH抗體死活也檢測不到小鼠肺組織的條帶，由于這個做的時間比較早了，不知道是抗體原因還是我WB的原因還是其他原因，不得而知。僅供朋友們一個參考吧有個弱弱的問題想請教一下：β－actin及α－tubulin的主要區(qū)別是什么，在肌組織及上皮組織間表達是否相同？請教一個問題:目的蛋白的一抗和內參的一抗能同時混合孵育PVDF膜嗎?兩個二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么問題?謝謝!會擔心有影響。

保險一點，還是分別孵育。

你的目的蛋白和內參分子量相差多少呢，如果相差比較大，你可以把2者剪開，分別孵育一抗。

如果分子量太相近了，還是先孵育目的蛋白一抗，重新封閉，再孵育內參一抗。GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogease（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參及糖酵解的一種關鍵酶。

因為GAPDH作為管家基因在同種細胞或者組織中的蛋白質表達量一般是恒定的。在實驗中，可能存在總蛋白濃度測定不準確；或者蛋白質樣品在電泳前上樣時產生的樣品間的操作誤差；這些誤差需要通過測定每個樣品中實際轉到膜上的GAPDH的含量來進行校正，所以一般的western實驗都需要進行內參設置。具體校正的方法就是將每個樣品測得的目的蛋白含量及本樣品的GAPDH含量相除，得到每個樣品目的蛋白的相對含量。然后才進行樣品及樣品之間的比較。GAPDH檢測。WesternBlotting(檢測條帶大約在36kDaGAPDH分子量，稀釋比例達10，000倍)、ELISA、親和純化、免疫熒光及免疫組化。

GAPDH分子量圖示:抗GAPDH單抗（Cat＃KC-5G4）檢測心臟組織勻漿中的GAPDH水平。A-G分別表示不同實驗來源的心臟組織勻漿?？笹APDH單抗稀釋比例為1：10，000，HRP羊抗鼠二抗（Cat＃KC-MM-1302）稀釋比例為1：1000。采用SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrateKit試劑盒及X膠片曝光顯影。rockblues_baiwrote:

請教一個問題:目的蛋白的一抗和內參的一抗能同時混合孵育PVDF膜嗎?兩個二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么問題?謝謝!

也是新手，不過個人為只要目的蛋白和內參的分子量差距足夠大當ECL顯色時兩條帶就不會相互干擾，可以同時孵育，一抗二抗均可同時孵育。因為我們用的都是特異性抗體，混合孵育從技術上是沒問題的。也有很多人在這樣做，也有很好的結果。

從經濟的角度考慮，剪膜、分開孵育，一抗4度過夜，這樣一抗可以重復利用有時可重復2-3個月。

我覺得：抗原表位有線性（氨基酸序列的不同）和構象型（空間結構的不同）兩種，如果你的抗體識別的是構象型的表位，你做western時蛋白要變性，其構想結構破壞，導致抗體抗原不能識別結合，因而也會做不出結果；如果是線性表位則天然的和蛋白變性后這種表位都存在，抗體抗原可以繼續(xù)結合。你要查詢有關資料，排除一下是否是此原因所致。謝謝wxq2005fw指教。您說的很對，單克隆抗體的確可能存在這樣的問題，但可能還不是主要原因。

查了一下actin（肌動蛋白）：“脊椎動物肌動蛋白分為α、β和γ三種類型，α型分布于心肌和橫紋肌細胞中，α及γ型分布于平滑肌細胞中，β及γ型分布于非肌細胞中?！保?/p>

β-actin抗體檢測不到心肌和骨骼肌的條帶，大概是這個原因吧。xray兄，好久沒有見到你啦！

不同異構體表達對蛋白的檢測是有很大的影響的

所以買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白。

很多抗體雜不出條帶其實未必是抗體質量的問題。

就比如我上次買了個抗體，說明書上寫著檢測的smoothmuscleisoform的，因為我的細胞激活后具備的就是平滑肌表型，所以就買了。

買來后一直不出條帶，我納悶了，于是提取大鼠主動脈組織作為對照，也不出條帶?；鹆耍陀昧肆硗鈧€細胞株做對照，條帶就出來了，而且很亮，壓片時能見到熒光，但是我的細胞和大鼠主動脈組織就是沒有條帶。

后來又做了幾次，大鼠主動脈組織也出過兩次條帶，但是非常細非常淡，若有若無那種，提高上樣量也是這樣，以致于根本不能掃描，

此公司做抗體是用的是一段合成肽，我比較了兩種異構體，只有6，7個AA的差異，

我自己的解釋是，這個抗體應該針對的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能檢測到smoothmuscleisoform。

目前正在及此公司交涉。xray19wrote:

查了一下actin（肌動蛋白）：“脊椎動物肌動蛋白分為α、β和γ三種類型，α型分布于心肌和橫紋肌細胞中，α及γ型分布于平滑肌細胞中，β及γ型分布于非肌細胞中?！保?/p>

β-actin抗體檢測不到心肌和骨骼肌的條帶，大概是這個原因吧。

不知道你前邊有做過免疫組化沒有，做免疫組化，其抗體識別的是未變性的抗原表位，如果能做出結果的話也能說名一定的問題把哈哈，又見著palm兄了。攤上老兄你這事，是得好好跟公司說道說道了。

我也在懷疑是公司選用了不合適的抗原片段來制備β-actin抗體（或者，我選用了不合適的抗體），以至于檢測產生組織特異性。因為，1，actin幾種異構體的確存在組織分布特異性，β-actin分布于非肌細胞中作為骨架蛋白；2，actin幾種異構體的氨基酸序列具有較高的相似性（>90%）；3，β-actin要作為內參，得首先保證是組織廣泛表達的（尤其是做蛋白的組織表達譜時）。那么制備β-actin抗體的抗原應該是選用及actin其它異構體一致的氨基酸序列。

問題是我的抗體太久了，查不到是哪個公司的了。這兩天有些忙，湊空我再查查公司β-actin抗體的相關信息吧。

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補充β-actin抗體的一些信息：

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肌動蛋白（actin）是一種重要的骨架蛋白，目前在動物細胞中發(fā)現至少有6種亞型存在：“Nonmusclebeta-andgamma-actin,alsoknownascytoplasmicactin,arepredominantlyexpressedinnonmusclecells,controlingcellstructureandmotility.alpha-cardiacandalpha-skeletalactinareexpressedinstriatedcardiacandskeletalmuscles,respectively;twosmoothmuscleactins,alpha-andgamma-actin,arefoundprimarilyinvascularsmoothmuscleandentericsmoothmuscle,respectively.”

因此,理論上,特異性針對beta-actin的抗體必然在心肌和橫紋肌中檢測不到條帶.但實際上,因為存在如下問題:

1,不同型actin之間具有較高的序列相似性(>90%).

2,公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原.

因此,可能會因為選取的短肽在不同型actin之間保守及否,而導致所制備抗體具有一定的組織特異性.如,選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測Nonmuscle細胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除Nonmuscle細胞外,還可以檢測cardiac,skeletal,smoothmuscle細胞的actin.

實際上,公司所制備的beta-actin抗體確實存在上述情況.

1,選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗).這類的抗體占大多數,主要有santacruz(sc-69879),sigma(A1978等),ProSci(CatalogNo.:3779),CellSignaling(#4967)，AxxoraPLATFORM(BET-A300)等。這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。

相關網址如下：

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2,選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體。主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).

相關網址如下:

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這類抗體便可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號.

最為明顯的區(qū)分可以見CellSignaling公司和EPITOMICS公司免疫組化的結果(順請wxq2005fw指教):

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HYPERLINK參及一下

個人覺得,

1.內參最好還是在目的蛋白膜上染

因為,測目的蛋白需要一個標準,那么蛋白測定是第一步,在我們電泳,上樣的時候,又是關鍵的一步,總會有一些技術原因,你上的樣量可能會不一致,所以,就需要對這張膜,選擇一個標準,我覺得簡單的方法就是在同一張膜上既染目的蛋白,又染內參蛋白.如果,兩種蛋白分子量相差很大,可以剪開來,單獨染抗體;如果相反,則可以先染目的蛋白,然后重新洗膜,封閉,染內參蛋白.

2.關于把兩種二抗不同的蛋白同時加一抗,我沒有試過,因為擔心抗體質量問題,再加上公司不同,抗體之間會有影響,但的確有人這樣做,我覺得理論上可能會有猶豫,但實踐中是可行的方法.wxnacatawrote:

xray19朋友，你的問題我也同樣遇到了，我做的是組織，提取的心肌組織的蛋白做的WB，現在發(fā)現正常大鼠的心肌組織beta-actin的條帶非常淺，而病變模型的beta-actin條帶很明顯，開始覺得可能是自己蛋白測定或稀釋的時候有問題（雖然自己覺得這種可能性很?。沁€是跑了此普通的蛋白電泳來驗證自己的上樣量，在普通蛋白電泳圖上顯示我的蛋白上樣量是一致的。那現在說明beta-actin確實在病變的組織中表達量發(fā)生變化了，既然這樣為什么beta-actin還能作為一個看家基因呢？是不是用GAPDH會好些？如果beta-actin、GAPDH、tublin在某種病變的組織中均發(fā)生較大改變了（這種情況有可能，雖然幾率很小），那該如何選擇內參呢？請教各位在行的朋友，謝謝

actin即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletalmuscleactin，alpha-cardiacmuscleactin，alpha-smoothmuscleactin，和gamma-smoothmuscleactin；其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscleactin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiacmuscleactin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參，不能一概而論的。你所謂的病變可能及心肌的重構有關，肌肉中的肌動蛋白很可能就發(fā)生了明顯的變化。beta-actin作為內參是得到了公認的，這是針對大多數組織和細胞來說的，它廣泛分布于細胞漿內，表達量非常豐富。盡管最近有一些文章已經開始質疑beta-actin作為內參的有效性（好像是對于上樣量>20ug的蛋白區(qū)分能力下降，記不清楚了）但是發(fā)文章應該還是沒有問題的。至于其他的內參也是可以考慮用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參及糖酵解的一種關鍵酶，而tubulin和actin類似是細胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應該是一個代替品。三種同時發(fā)生變化的情況太少了，如果遇到的時候再具體分析，這個不好說，我認為如果是總蛋白的話可以用胞核的內參如PCNA，TATA-boxbingdingprotein（TBP）甚至線粒體的內參來代替，當然我認為這種可能性出現的幾率比我買彩票中大獎差不多。今晚回答這個問題對于我來說也是一個考驗，很多基礎知識都是通過網絡和拚命的回憶來的，也算是對于actin這個內參的一個全面了解了，希望有所幫助。補充一點選內參的原則：所選的內參及目的基因之間不能有調節(jié)關系，否則內參就不客觀了，如：你是做及糖代謝相關的基因就不能選GAPDH，及細胞骨架相關的就不能選β-actin。

在WesternBlotting中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個WesternBlot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實驗結果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到的數值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分，可以先檢測內參，觀測樣品間內參顯色條帶是否一致，根據差異大小調整各樣品的上樣量重新進行WesternBlotting實驗，至內參量一致為止；若內參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹的工作在WesternBlotting實驗過程中使用內參的方法有：

一、超級簡便的標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可。

二、普通內參：當目的蛋白的分子量大小及選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

三、當目的蛋白的分子量大小及選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白及目的蛋白分開。然后兩塊膜分別及內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。內參即是內部參照（InternalControl），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(HousekeepingProteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在WesternBlotting實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。

實際上內參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用WesternBlot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎，特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析，所以需要內參。在國外發(fā)表的文章中，WesternBlotting實驗結果須進行內參校正已成為一種慣例。但是，國內仍有不少科研人員在WesternBlotting實驗中忽略了內參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。

不同異構體表達對蛋白的檢測是有很大的影響，買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實未必是抗體質量的問題。很多公司的內參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C－端。選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數，主要有santacruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat#A1978等)，ProSci(Cat#3779),CellSignaling(Cat#4967)，AxxoraPLATFORM(BET-A300)等，這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，這類抗體可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內參時產生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成的。我來說點不同看法

內參是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案顯然是否定的.只有在需要得到可發(fā)表的結果的情況下,才有必要做一個漂亮的內參.

1:western本身就是一個很粗略的定量方法,嚴格的說,根本不具有定量的能力,所有從werster里出來的表達量的區(qū)別(明顯的“有”“沒有”的區(qū)別屬于定性），都是不精確的，苛刻點說，壓根就是不可采信的。所以內參只是一個為了結果完整性而出現的東西，平時做western如果次次做內參，完全沒有必要，也沒什么太大幫助

2:那么如何控制上樣量，有很多辦法，可以通過SDS粗略判定，這個方法一點不比用內參差，那些abundantprotein在膠上完全可以通過肉眼辨別條帶的深淺，反倒是用western判斷很困難，在western結果出來都是很黑的條帶，不一定在膠上看起來就一樣.而最直接的辦法是在準備sample的時候就下好功夫，取多少個細胞，最終溶解在多少samplebuffer里面，是可以控制出load的時候每條lane大概有多少細胞的.

內參，尤其是werstern的內參，絕大多數情況是作為“漂亮的馬后炮”出現的,當你前期控制完之后，再放上一個內參告訴別人“看，的確如我所料”.

werstern次次做內參,完全沒有必要要發(fā)文章還是要用內參更有說服力，前面的同志們在討論的時候主要針對的是動物體系，不知生物公司的內參一抗對植物材料WB是否通用？我想請教一下；做水稻受病原菌處理后線粒體的蛋白的變化，采用什么內參比較好？一般病原菌處理植物后發(fā)生的PCD會不會影響action的表達差異性？選擇GAPDH可以嗎？希望針對植物蛋白和動物蛋白在WB過程中選擇內參需要注意的事項進行交流討論！可供選擇的內參除了前面說過的actin和tubulin，還有Ubquitin，elgf等。但是，最重要的是一定要確定試驗的處理因素不會對選擇的內參蛋白表達產生影響，比如常用的tubulin，可能就不太適合用來定量有絲分裂相期的蛋白表達情況。因此，如果有條件，最好在預實驗中平衡比較一下多種內參再選擇最優(yōu)。當然，對于我們大多數人來說，只要回顧一下本研究領域的權威參考文獻，大概就可以確定哪種內參在這種實驗中已經得到公認了！關于內參的應用問題，國內一直還沒有形成應用的習慣，可能是有研究水平的原因，也有可能是內參的抗體大部分是國外產的，超級貴！前段時間為了一篇文章，用的內參外國人老不相信，老板一狠心買了兩只chemicon內參，50ug包裝，每支3000多！不過好在我們有自己做的一支很好用的內參單抗，平常的實驗可以保證敞開用，國內其他大部分實驗室可能就沒這么好的運氣了！但是老板經過此事也下決心要把這個抗體完整詳細的鑒定出來，然后推出去讓大家都來用提高它的可信度。目前，鑒定的工作已經差不多完成了，剩下的就是申請專利，不管最后是怎么賣出去，國產的東西應該會大大便宜于國外的，這對大家來說可能也算一個好消息吧不太茍同sixday1004兄對內參的某些看法.sixday1004wrote:

我來說點不同看法

內參是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案顯然是否定的.只有在需要得到可發(fā)表的結果的情況下,才有必要做一個漂亮的內參.

這么肯定的將內參的作用局限在“需要得到可發(fā)表的結果的情況下”的狹小范圍內，似乎有些不妥?？蒲羞^程中，有誰能未卜先知到實驗結果？沒有內參的作用，我們如何得知得到的結果就是“可發(fā)表的結果”？

1:western本身就是一個很粗略的定量方法,嚴格的說,根本不具有定量的能力,所有從werster里出來的表達量的區(qū)別(明顯的“有”“沒有”的區(qū)別屬于定性），都是不精確的，苛刻點說，壓根就是不可采信的。所以內參只是一個為了結果完整性而出現的東西，平時做western如果次次做內參，完全沒有必要，也沒什么太大幫助

western的確是一種半定量的方式，不是很精確，但這決不是因噎廢食甚至是“破罐子破摔”的理由。內參的出現，就是為了在一定程度上彌補WB的不足而必須的一種實驗設計，只有這樣我們才有可能對每次的WB結果進行分析。請注意，內參不是完整性結果的“果”或“附屬品”，而是“因”或“前提”，顛倒了兩者的關系，可不是一種科學嚴謹的實驗態(tài)度哦。

當然，如果是同一批樣品，在保證上樣體積一致的情況下，是可以不必次次做內參的。

2:那么如何控制上樣量，有很多辦法，可以通過SDS粗略判定，這個方法一點不比用內參差，那些abundantprotein在膠上完全可以通過肉眼辨別條帶的深淺，反倒是用western判斷很困難，在western結果