western 內(nèi)參選擇 大討論

PAGE17/NUMPAGES17在westernblot實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參的使用是個(gè)很重要的部分，

看到很多站友對(duì)內(nèi)參的選擇經(jīng)常有些疑問(wèn)，鑒于此，希望能在一個(gè)帖子里面綜合所有相關(guān)問(wèn)題，展開(kāi)討論，共同學(xué)習(xí)。

我先提幾個(gè)，拋磚引玉，希望大家繼續(xù)。

1。為什么一定需要內(nèi)參？?jī)?nèi)參的重要性。

2。常用的幾種內(nèi)參。

3。不同的情況如何選擇不同的內(nèi)參。支持一下！

1：用內(nèi)參照是為了評(píng)價(jià)你的各個(gè)上樣孔內(nèi)蛋白的總量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。這些蛋白在所有細(xì)胞中的表達(dá)量基本一致，所以用他們來(lái)作為你加樣量的對(duì)照。這樣western結(jié)果中你的目的蛋白經(jīng)過(guò)處理后發(fā)生變化，而內(nèi)參的條帶基本均勻一致。這樣才有說(shuō)服力，表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或是人為造成目的條帶濃度的變化。嚴(yán)格意義上說(shuō)，內(nèi)參事必須做的。

2：常用的內(nèi)參有：b-actin，GAPDH，近2-3年，更詳細(xì)的研究發(fā)現(xiàn)，β-Tubulin(球管蛋白)，被廣泛應(yīng)用于WesternBlotting，β－Tubolin分子量為55KD左右。

3：一般我們選擇內(nèi)參及要檢測(cè)的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你檢測(cè)的蛋白的分子量來(lái)選擇合適的內(nèi)參！

個(gè)人一些見(jiàn)解，供參考！內(nèi)參的重要性，必要性：

要檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對(duì)變化，首選方法是WesternBlot。

因?yàn)閃esternBlot操作相對(duì)簡(jiǎn)單方便，既可以定性分析表達(dá)產(chǎn)物，同時(shí)還可以指示目的蛋白量的相對(duì)變化。雖然，順利的時(shí)候WesternBlot做起來(lái)很簡(jiǎn)單，可不順的時(shí)候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽(yáng)性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問(wèn)題還是二抗有問(wèn)題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來(lái)測(cè)定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物，確實(shí)是有一定的不確定性的。所以，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤esternBlot實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中要求有良好的參照體系，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有用。特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，借助參照體系很容易就可以查出問(wèn)題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來(lái)確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大?。?，空白載體對(duì)照（如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對(duì)照），已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照；另外還有內(nèi)參。各種不同對(duì)照可是由于經(jīng)費(fèi)限制或者偷懶的原因，國(guó)內(nèi)的不少人做WesternBlot往往省略參照，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)無(wú)法分析結(jié)果――即便有結(jié)果也可能影響結(jié)果的分析。

內(nèi)參是最容易被忽略的一項(xiàng)。我們知道，要用WesternBlot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少，前提條件是等量的細(xì)胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時(shí)，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以你需要內(nèi)參。

內(nèi)參即是內(nèi)部參照（InternalControl），對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(HousekeepingProteins)，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè)，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在國(guó)外發(fā)表的文章中，WesternBlotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國(guó)內(nèi)仍有不少科研人員在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。

然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)，相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，操作簡(jiǎn)單，但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測(cè)定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。BCA法及Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且及一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Westernblotting實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。

在WesternBlotting中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過(guò)程中的另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)WesternBlot顯色或者發(fā)光體系是否正常。內(nèi)參原理各種不同對(duì)照內(nèi)參原理我想問(wèn)一下,內(nèi)參和目的蛋白相差15kD能不能將膜上他門(mén)的位置(用預(yù)染)分別剪下來(lái),孵育啊?還是必須得跑兩張膜一個(gè)內(nèi)參一個(gè)目的蛋白啊?洗膜的時(shí)候可以放在一起洗么?如果他們是同源的二抗可以放在一起孵育么?回答樓上的問(wèn)題：完全可以剪開(kāi)分別加一抗孵育，我就是這么做的；洗膜時(shí)最好分開(kāi)洗滌，放在一起的話(huà)兩張膜可能重疊在一起，影響洗膜效果；如果不剪膜，你兩個(gè)一抗來(lái)源相同而且特異性很好（單抗）的話(huà)，可以一起孵育，不過(guò)應(yīng)該注意可能存在的交叉反應(yīng)，你可以嘗試一下看看結(jié)果再定。本人是新手，問(wèn)一個(gè)很汗的問(wèn)題，原核表達(dá)也需要做內(nèi)參么？做內(nèi)參的蛋白在哪里找？

不甚感激在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用內(nèi)參的方法有：

一、超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

二、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小及選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。

三、當(dāng)目的蛋白的分子量大小及選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠?，使?nèi)參蛋白及目的蛋白分開(kāi)。然后兩塊膜分別及內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。

常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我們實(shí)驗(yàn)室使用最多的是***工程有限公司及國(guó)外實(shí)驗(yàn)室合作開(kāi)發(fā)的GAPDH，100μl一支，濃度為100μg/100μl，價(jià)格為988元人民幣。雖然公司網(wǎng)上稱(chēng)稀釋比達(dá)1：10000以上，至少可做100次Westernmini-blots，但我們一般按照1：5000～6000稀釋?zhuān)贿^(guò)效果確實(shí)非常好，熒光條帶非常亮，而且抗體使用3～4次也沒(méi)太大改變。

我們也使用過(guò)博奧森的beta-actin，200ul480元，稀釋比1：200～500。因?yàn)橄♂尡炔桓?，所以?xún)r(jià)格并不便宜。更可氣的是，我PC12細(xì)胞居然有兩條條帶，小鼠也是兩條。我也同意剪開(kāi),但是別忘記一個(gè)問(wèn)題.

你要確保你剪開(kāi)的部位沒(méi)有蛋白.kangchen的HRP－標(biāo)記內(nèi)參很好

不需要剪膜更為直觀(guān)，有說(shuō)服力我做了半年的western,就我對(duì)內(nèi)參的理解如下

1.所選內(nèi)參有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)蛋白或是管家蛋白,細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定,且表達(dá)水平高,在同一種類(lèi)的細(xì)胞上表達(dá)基本一致.

2.做內(nèi)參可以:一,檢驗(yàn)?zāi)愕恼譿estern裝置是否正常runeffectively.包括你的配液,你的膠以及電泳和轉(zhuǎn)移,一抗的效價(jià)以及顯色等.二檢測(cè)你的樣品蛋白含量是否相等.

3.選擇內(nèi)參要根據(jù)你的目的蛋白的性質(zhì)即你的目的蛋白是胞內(nèi)還是核內(nèi),你蛋白的分子量是大是小,當(dāng)然還有價(jià)錢(qián)以及你的目的.

4.一般內(nèi)參是比較容易作出來(lái)的,同時(shí)它也是幫助你摸索條件的,你把其做漂亮,你后面就很順利了,只是轉(zhuǎn)移的條件有點(diǎn)變化.其余照樣或根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作.我想請(qǐng)問(wèn)一下如果內(nèi)參和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的內(nèi)參都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分塊膠來(lái)跑呢？那么，我想請(qǐng)教一下用過(guò)β-actin做內(nèi)參的朋友，有沒(méi)有遇到過(guò)β-actin抗體檢測(cè)不到小鼠心肌和肌肉組織β-actin的情況？當(dāng)然前提是：1，我的確提取到了心肌和肌肉組織的總蛋白，且檢測(cè)到了我的目的條帶。2，用此抗體可以檢測(cè)到其他組織中β-actin條帶。

也發(fā)現(xiàn)，在碧云天網(wǎng)站上，曾提及“本抗體不能用于成年動(dòng)物心肌或骨骼肌的免疫染色”。具體什么原因造成這種情況，我也不想太麻煩去搜了，還請(qǐng)知道的戰(zhàn)友指教。同時(shí)也算是給朋友們提個(gè)醒吧。

另，我曾用GAPDH抗體死活也檢測(cè)不到小鼠肺組織的條帶，由于這個(gè)做的時(shí)間比較早了，不知道是抗體原因還是我WB的原因還是其他原因，不得而知。僅供朋友們一個(gè)參考吧有個(gè)弱弱的問(wèn)題想請(qǐng)教一下：β－actin及α－tubulin的主要區(qū)別是什么，在肌組織及上皮組織間表達(dá)是否相同？請(qǐng)教一個(gè)問(wèn)題:目的蛋白的一抗和內(nèi)參的一抗能同時(shí)混合孵育PVDF膜嗎?兩個(gè)二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么問(wèn)題?謝謝!會(huì)擔(dān)心有影響。

保險(xiǎn)一點(diǎn)，還是分別孵育。

你的目的蛋白和內(nèi)參分子量相差多少呢，如果相差比較大，你可以把2者剪開(kāi)，分別孵育一抗。

如果分子量太相近了，還是先孵育目的蛋白一抗，重新封閉，再孵育內(nèi)參一抗。GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogease（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參及糖酵解的一種關(guān)鍵酶。

因?yàn)镚APDH作為管家基因在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的。在實(shí)驗(yàn)中，可能存在總蛋白濃度測(cè)定不準(zhǔn)確；或者蛋白質(zhì)樣品在電泳前上樣時(shí)產(chǎn)生的樣品間的操作誤差；這些誤差需要通過(guò)測(cè)定每個(gè)樣品中實(shí)際轉(zhuǎn)到膜上的GAPDH的含量來(lái)進(jìn)行校正，所以一般的western實(shí)驗(yàn)都需要進(jìn)行內(nèi)參設(shè)置。具體校正的方法就是將每個(gè)樣品測(cè)得的目的蛋白含量及本樣品的GAPDH含量相除，得到每個(gè)樣品目的蛋白的相對(duì)含量。然后才進(jìn)行樣品及樣品之間的比較。GAPDH檢測(cè)。WesternBlotting(檢測(cè)條帶大約在36kDaGAPDH分子量，稀釋比例達(dá)10，000倍)、ELISA、親和純化、免疫熒光及免疫組化。

GAPDH分子量圖示:抗GAPDH單抗（Cat＃KC-5G4）檢測(cè)心臟組織勻漿中的GAPDH水平。A-G分別表示不同實(shí)驗(yàn)來(lái)源的心臟組織勻漿。抗GAPDH單抗稀釋比例為1：10，000，HRP羊抗鼠二抗（Cat＃KC-MM-1302）稀釋比例為1：1000。采用SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrateKit試劑盒及X膠片曝光顯影。rockblues_baiwrote:

請(qǐng)教一個(gè)問(wèn)題:目的蛋白的一抗和內(nèi)參的一抗能同時(shí)混合孵育PVDF膜嗎?兩個(gè)二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么問(wèn)題?謝謝!

也是新手，不過(guò)個(gè)人為只要目的蛋白和內(nèi)參的分子量差距足夠大當(dāng)ECL顯色時(shí)兩條帶就不會(huì)相互干擾，可以同時(shí)孵育，一抗二抗均可同時(shí)孵育。因?yàn)槲覀冇玫亩际翘禺愋钥贵w，混合孵育從技術(shù)上是沒(méi)問(wèn)題的。也有很多人在這樣做，也有很好的結(jié)果。

從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，剪膜、分開(kāi)孵育，一抗4度過(guò)夜，這樣一抗可以重復(fù)利用有時(shí)可重復(fù)2-3個(gè)月。

我覺(jué)得：抗原表位有線(xiàn)性（氨基酸序列的不同）和構(gòu)象型（空間結(jié)構(gòu)的不同）兩種，如果你的抗體識(shí)別的是構(gòu)象型的表位，你做western時(shí)蛋白要變性，其構(gòu)想結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致抗體抗原不能識(shí)別結(jié)合，因而也會(huì)做不出結(jié)果；如果是線(xiàn)性表位則天然的和蛋白變性后這種表位都存在，抗體抗原可以繼續(xù)結(jié)合。你要查詢(xún)有關(guān)資料，排除一下是否是此原因所致。謝謝wxq2005fw指教。您說(shuō)的很對(duì)，單克隆抗體的確可能存在這樣的問(wèn)題，但可能還不是主要原因。

查了一下actin（肌動(dòng)蛋白）：“脊椎動(dòng)物肌動(dòng)蛋白分為α、β和γ三種類(lèi)型，α型分布于心肌和橫紋肌細(xì)胞中，α及γ型分布于平滑肌細(xì)胞中，β及γ型分布于非肌細(xì)胞中。”－－－－－－

β-actin抗體檢測(cè)不到心肌和骨骼肌的條帶，大概是這個(gè)原因吧。xray兄，好久沒(méi)有見(jiàn)到你啦！

不同異構(gòu)體表達(dá)對(duì)蛋白的檢測(cè)是有很大的影響的

所以買(mǎi)抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白。

很多抗體雜不出條帶其實(shí)未必是抗體質(zhì)量的問(wèn)題。

就比如我上次買(mǎi)了個(gè)抗體，說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)著檢測(cè)的smoothmuscleisoform的，因?yàn)槲业募?xì)胞激活后具備的就是平滑肌表型，所以就買(mǎi)了。

買(mǎi)來(lái)后一直不出條帶，我納悶了，于是提取大鼠主動(dòng)脈組織作為對(duì)照，也不出條帶?；鹆耍陀昧肆硗鈧€(gè)細(xì)胞株做對(duì)照，條帶就出來(lái)了，而且很亮，壓片時(shí)能見(jiàn)到熒光，但是我的細(xì)胞和大鼠主動(dòng)脈組織就是沒(méi)有條帶。

后來(lái)又做了幾次，大鼠主動(dòng)脈組織也出過(guò)兩次條帶，但是非常細(xì)非常淡，若有若無(wú)那種，提高上樣量也是這樣，以致于根本不能掃描，

此公司做抗體是用的是一段合成肽，我比較了兩種異構(gòu)體，只有6，7個(gè)AA的差異，

我自己的解釋是，這個(gè)抗體應(yīng)該針對(duì)的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能檢測(cè)到smoothmuscleisoform。

目前正在及此公司交涉。xray19wrote:

查了一下actin（肌動(dòng)蛋白）：“脊椎動(dòng)物肌動(dòng)蛋白分為α、β和γ三種類(lèi)型，α型分布于心肌和橫紋肌細(xì)胞中，α及γ型分布于平滑肌細(xì)胞中，β及γ型分布于非肌細(xì)胞中。”－－－－－－

β-actin抗體檢測(cè)不到心肌和骨骼肌的條帶，大概是這個(gè)原因吧。

不知道你前邊有做過(guò)免疫組化沒(méi)有，做免疫組化，其抗體識(shí)別的是未變性的抗原表位，如果能做出結(jié)果的話(huà)也能說(shuō)名一定的問(wèn)題把哈哈，又見(jiàn)著palm兄了。攤上老兄你這事，是得好好跟公司說(shuō)道說(shuō)道了。

我也在懷疑是公司選用了不合適的抗原片段來(lái)制備β-actin抗體（或者，我選用了不合適的抗體），以至于檢測(cè)產(chǎn)生組織特異性。因?yàn)椋?，actin幾種異構(gòu)體的確存在組織分布特異性，β-actin分布于非肌細(xì)胞中作為骨架蛋白；2，actin幾種異構(gòu)體的氨基酸序列具有較高的相似性（>90%）；3，β-actin要作為內(nèi)參，得首先保證是組織廣泛表達(dá)的（尤其是做蛋白的組織表達(dá)譜時(shí)）。那么制備β-actin抗體的抗原應(yīng)該是選用及actin其它異構(gòu)體一致的氨基酸序列。

問(wèn)題是我的抗體太久了，查不到是哪個(gè)公司的了。這兩天有些忙，湊空我再查查公司β-actin抗體的相關(guān)信息吧。

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補(bǔ)充β-actin抗體的一些信息：

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肌動(dòng)蛋白（actin）是一種重要的骨架蛋白，目前在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)至少有6種亞型存在：“Nonmusclebeta-andgamma-actin,alsoknownascytoplasmicactin,arepredominantlyexpressedinnonmusclecells,controlingcellstructureandmotility.alpha-cardiacandalpha-skeletalactinareexpressedinstriatedcardiacandskeletalmuscles,respectively;twosmoothmuscleactins,alpha-andgamma-actin,arefoundprimarilyinvascularsmoothmuscleandentericsmoothmuscle,respectively.”

因此,理論上,特異性針對(duì)beta-actin的抗體必然在心肌和橫紋肌中檢測(cè)不到條帶.但實(shí)際上,因?yàn)榇嬖谌缦聠?wèn)題:

1,不同型actin之間具有較高的序列相似性(>90%).

2,公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原.

因此,可能會(huì)因?yàn)檫x取的短肽在不同型actin之間保守及否,而導(dǎo)致所制備抗體具有一定的組織特異性.如,選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測(cè)Nonmuscle細(xì)胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除Nonmuscle細(xì)胞外,還可以檢測(cè)cardiac,skeletal,smoothmuscle細(xì)胞的actin.

實(shí)際上,公司所制備的beta-actin抗體確實(shí)存在上述情況.

1,選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗).這類(lèi)的抗體占大多數(shù),主要有santacruz(sc-69879),sigma(A1978等),ProSci(CatalogNo.:3779),CellSignaling(#4967)，AxxoraPLATFORM(BET-A300)等。這類(lèi)抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。

相關(guān)網(wǎng)址如下：

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2,選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體。主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).

相關(guān)網(wǎng)址如下:

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這類(lèi)抗體便可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin陽(yáng)性信號(hào).

最為明顯的區(qū)分可以見(jiàn)CellSignaling公司和EPITOMICS公司免疫組化的結(jié)果(順請(qǐng)wxq2005fw指教):

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HYPERLINK參及一下

個(gè)人覺(jué)得,

1.內(nèi)參最好還是在目的蛋白膜上染

因?yàn)?測(cè)目的蛋白需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn),那么蛋白測(cè)定是第一步,在我們電泳,上樣的時(shí)候,又是關(guān)鍵的一步,總會(huì)有一些技術(shù)原因,你上的樣量可能會(huì)不一致,所以,就需要對(duì)這張膜,選擇一個(gè)標(biāo)準(zhǔn),我覺(jué)得簡(jiǎn)單的方法就是在同一張膜上既染目的蛋白,又染內(nèi)參蛋白.如果,兩種蛋白分子量相差很大,可以剪開(kāi)來(lái),單獨(dú)染抗體;如果相反,則可以先染目的蛋白,然后重新洗膜,封閉,染內(nèi)參蛋白.

2.關(guān)于把兩種二抗不同的蛋白同時(shí)加一抗,我沒(méi)有試過(guò),因?yàn)閾?dān)心抗體質(zhì)量問(wèn)題,再加上公司不同,抗體之間會(huì)有影響,但的確有人這樣做,我覺(jué)得理論上可能會(huì)有猶豫,但實(shí)踐中是可行的方法.wxnacatawrote:

xray19朋友，你的問(wèn)題我也同樣遇到了，我做的是組織，提取的心肌組織的蛋白做的WB，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)正常大鼠的心肌組織beta-actin的條帶非常淺，而病變模型的beta-actin條帶很明顯，開(kāi)始覺(jué)得可能是自己蛋白測(cè)定或稀釋的時(shí)候有問(wèn)題（雖然自己覺(jué)得這種可能性很?。沁€是跑了此普通的蛋白電泳來(lái)驗(yàn)證自己的上樣量，在普通蛋白電泳圖上顯示我的蛋白上樣量是一致的。那現(xiàn)在說(shuō)明beta-actin確實(shí)在病變的組織中表達(dá)量發(fā)生變化了，既然這樣為什么beta-actin還能作為一個(gè)看家基因呢？是不是用GAPDH會(huì)好些？如果beta-actin、GAPDH、tublin在某種病變的組織中均發(fā)生較大改變了（這種情況有可能，雖然幾率很小），那該如何選擇內(nèi)參呢？請(qǐng)教各位在行的朋友，謝謝

actin即肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletalmuscleactin，alpha-cardiacmuscleactin，alpha-smoothmuscleactin，和gamma-smoothmuscleactin；其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscleactin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiacmuscleactin。因此不同的組織本來(lái)就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論的。你所謂的病變可能及心肌的重構(gòu)有關(guān)，肌肉中的肌動(dòng)蛋白很可能就發(fā)生了明顯的變化。beta-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的，這是針對(duì)大多數(shù)組織和細(xì)胞來(lái)說(shuō)的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。盡管最近有一些文章已經(jīng)開(kāi)始質(zhì)疑beta-actin作為內(nèi)參的有效性（好像是對(duì)于上樣量>20ug的蛋白區(qū)分能力下降，記不清楚了）但是發(fā)文章應(yīng)該還是沒(méi)有問(wèn)題的。至于其他的內(nèi)參也是可以考慮用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參及糖酵解的一種關(guān)鍵酶，而tubulin和actin類(lèi)似是細(xì)胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應(yīng)該是一個(gè)代替品。三種同時(shí)發(fā)生變化的情況太少了，如果遇到的時(shí)候再具體分析，這個(gè)不好說(shuō)，我認(rèn)為如果是總蛋白的話(huà)可以用胞核的內(nèi)參如PCNA，TATA-boxbingdingprotein（TBP）甚至線(xiàn)粒體的內(nèi)參來(lái)代替，當(dāng)然我認(rèn)為這種可能性出現(xiàn)的幾率比我買(mǎi)彩票中大獎(jiǎng)差不多。今晚回答這個(gè)問(wèn)題對(duì)于我來(lái)說(shuō)也是一個(gè)考驗(yàn)，很多基礎(chǔ)知識(shí)都是通過(guò)網(wǎng)絡(luò)和拚命的回憶來(lái)的，也算是對(duì)于actin這個(gè)內(nèi)參的一個(gè)全面了解了，希望有所幫助。補(bǔ)充一點(diǎn)選內(nèi)參的原則：所選的內(nèi)參及目的基因之間不能有調(diào)節(jié)關(guān)系，否則內(nèi)參就不客觀(guān)了，如：你是做及糖代謝相關(guān)的基因就不能選GAPDH，及細(xì)胞骨架相關(guān)的就不能選β-actin。

在WesternBlotting中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過(guò)程中的另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)WesternBlot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡(jiǎn)單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測(cè)內(nèi)參，觀(guān)測(cè)樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行WesternBlotting實(shí)驗(yàn)，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。這樣雖然麻煩一點(diǎn)，但是可以保證結(jié)果更有說(shuō)服力，更可信。畢竟我們的實(shí)驗(yàn)是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髟赪esternBlotting實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用內(nèi)參的方法有：

一、超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

二、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小及選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。

三、當(dāng)目的蛋白的分子量大小及選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠郑箖?nèi)參蛋白及目的蛋白分開(kāi)。然后兩塊膜分別及內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。內(nèi)參即是內(nèi)部參照（InternalControl），對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(HousekeepingProteins)，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè)，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)際上內(nèi)參是最容易被忽略的一項(xiàng)。我們知道，要用WesternBlot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少，前提條件是等量的細(xì)胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)，特別表達(dá)量不高時(shí)，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析，所以需要內(nèi)參。在國(guó)外發(fā)表的文章中，WesternBlotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國(guó)內(nèi)仍有不少科研人員在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。

不同異構(gòu)體表達(dá)對(duì)蛋白的檢測(cè)是有很大的影響，買(mǎi)抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實(shí)未必是抗體質(zhì)量的問(wèn)題。很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C－端。選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數(shù)，主要有santacruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat#A1978等)，ProSci(Cat#3779),CellSignaling(Cat#4967)，AxxoraPLATFORM(BET-A300)等，這類(lèi)抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，這類(lèi)抗體可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin陽(yáng)性信號(hào)。有時(shí)候在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)內(nèi)參時(shí)產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對(duì)造成的。我來(lái)說(shuō)點(diǎn)不同看法

內(nèi)參是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案顯然是否定的.只有在需要得到可發(fā)表的結(jié)果的情況下,才有必要做一個(gè)漂亮的內(nèi)參.

1:western本身就是一個(gè)很粗略的定量方法,嚴(yán)格的說(shuō),根本不具有定量的能力,所有從werster里出來(lái)的表達(dá)量的區(qū)別(明顯的“有”“沒(méi)有”的區(qū)別屬于定性），都是不精確的，苛刻點(diǎn)說(shuō)，壓根就是不可采信的。所以?xún)?nèi)參只是一個(gè)為了結(jié)果完整性而出現(xiàn)的東西，平時(shí)做western如果次次做內(nèi)參，完全沒(méi)有必要，也沒(méi)什么太大幫助

2:那么如何控制上樣量，有很多辦法，可以通過(guò)SDS粗略判定，這個(gè)方法一點(diǎn)不比用內(nèi)參差，那些abundantprotein在膠上完全可以通過(guò)肉眼辨別條帶的深淺，反倒是用western判斷很困難，在western結(jié)果出來(lái)都是很黑的條帶，不一定在膠上看起來(lái)就一樣.而最直接的辦法是在準(zhǔn)備sample的時(shí)候就下好功夫，取多少個(gè)細(xì)胞，最終溶解在多少samplebuffer里面，是可以控制出load的時(shí)候每條lane大概有多少細(xì)胞的.

內(nèi)參，尤其是werstern的內(nèi)參，絕大多數(shù)情況是作為“漂亮的馬后炮”出現(xiàn)的,當(dāng)你前期控制完之后，再放上一個(gè)內(nèi)參告訴別人“看，的確如我所料”.

werstern次次做內(nèi)參,完全沒(méi)有必要要發(fā)文章還是要用內(nèi)參更有說(shuō)服力，前面的同志們?cè)谟懻摰臅r(shí)候主要針對(duì)的是動(dòng)物體系，不知生物公司的內(nèi)參一抗對(duì)植物材料WB是否通用？我想請(qǐng)教一下；做水稻受病原菌處理后線(xiàn)粒體的蛋白的變化，采用什么內(nèi)參比較好？一般病原菌處理植物后發(fā)生的PCD會(huì)不會(huì)影響action的表達(dá)差異性？選擇GAPDH可以嗎？希望針對(duì)植物蛋白和動(dòng)物蛋白在WB過(guò)程中選擇內(nèi)參需要注意的事項(xiàng)進(jìn)行交流討論！可供選擇的內(nèi)參除了前面說(shuō)過(guò)的actin和tubulin，還有Ubquitin，elgf等。但是，最重要的是一定要確定試驗(yàn)的處理因素不會(huì)對(duì)選擇的內(nèi)參蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，比如常用的tubulin，可能就不太適合用來(lái)定量有絲分裂相期的蛋白表達(dá)情況。因此，如果有條件，最好在預(yù)實(shí)驗(yàn)中平衡比較一下多種內(nèi)參再選擇最優(yōu)。當(dāng)然，對(duì)于我們大多數(shù)人來(lái)說(shuō)，只要回顧一下本研究領(lǐng)域的權(quán)威參考文獻(xiàn)，大概就可以確定哪種內(nèi)參在這種實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到公認(rèn)了！關(guān)于內(nèi)參的應(yīng)用問(wèn)題，國(guó)內(nèi)一直還沒(méi)有形成應(yīng)用的習(xí)慣，可能是有研究水平的原因，也有可能是內(nèi)參的抗體大部分是國(guó)外產(chǎn)的，超級(jí)貴！前段時(shí)間為了一篇文章，用的內(nèi)參外國(guó)人老不相信，老板一狠心買(mǎi)了兩只chemicon內(nèi)參，50ug包裝，每支3000多！不過(guò)好在我們有自己做的一支很好用的內(nèi)參單抗，平常的實(shí)驗(yàn)可以保證敞開(kāi)用，國(guó)內(nèi)其他大部分實(shí)驗(yàn)室可能就沒(méi)這么好的運(yùn)氣了！但是老板經(jīng)過(guò)此事也下決心要把這個(gè)抗體完整詳細(xì)的鑒定出來(lái)，然后推出去讓大家都來(lái)用提高它的可信度。目前，鑒定的工作已經(jīng)差不多完成了，剩下的就是申請(qǐng)專(zhuān)利，不管最后是怎么賣(mài)出去，國(guó)產(chǎn)的東西應(yīng)該會(huì)大大便宜于國(guó)外的，這對(duì)大家來(lái)說(shuō)可能也算一個(gè)好消息吧不太茍同sixday1004兄對(duì)內(nèi)參的某些看法.sixday1004wrote:

我來(lái)說(shuō)點(diǎn)不同看法

內(nèi)參是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案顯然是否定的.只有在需要得到可發(fā)表的結(jié)果的情況下,才有必要做一個(gè)漂亮的內(nèi)參.

這么肯定的將內(nèi)參的作用局限在“需要得到可發(fā)表的結(jié)果的情況下”的狹小范圍內(nèi)，似乎有些不妥?？蒲羞^(guò)程中，有誰(shuí)能未卜先知到實(shí)驗(yàn)結(jié)果？沒(méi)有內(nèi)參的作用，我們?nèi)绾蔚弥玫降慕Y(jié)果就是“可發(fā)表的結(jié)果”？

1:western本身就是一個(gè)很粗略的定量方法,嚴(yán)格的說(shuō),根本不具有定量的能力,所有從werster里出來(lái)的表達(dá)量的區(qū)別(明顯的“有”“沒(méi)有”的區(qū)別屬于定性），都是不精確的，苛刻點(diǎn)說(shuō)，壓根就是不可采信的。所以?xún)?nèi)參只是一個(gè)為了結(jié)果完整性而出現(xiàn)的東西，平時(shí)做western如果次次做內(nèi)參，完全沒(méi)有必要，也沒(méi)什么太大幫助

western的確是一種半定量的方式，不是很精確，但這決不是因噎廢食甚至是“破罐子破摔”的理由。內(nèi)參的出現(xiàn)，就是為了在一定程度上彌補(bǔ)WB的不足而必須的一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，只有這樣我們才有可能對(duì)每次的WB結(jié)果進(jìn)行分析。請(qǐng)注意，內(nèi)參不是完整性結(jié)果的“果”或“附屬品”，而是“因”或“前提”，顛倒了兩者的關(guān)系，可不是一種科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度哦。

當(dāng)然，如果是同一批樣品，在保證上樣體積一致的情況下，是可以不必次次做內(nèi)參的。

2:那么如何控制上樣量，有很多辦法，可以通過(guò)SDS粗略判定，這個(gè)方法一點(diǎn)不比用內(nèi)參差，那些abundantprotein在膠上完全可以通過(guò)肉眼辨別條帶的深淺，反倒是用western判斷很困難，在western結(jié)果