素材：基因工程教學(xué)中三個(gè)常見問題-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

基因工程教學(xué)中三個(gè)常見問題進(jìn)化論的觀點(diǎn)讓我們認(rèn)識(shí)到自然界中現(xiàn)存的生物物種和類群是由古代的生物經(jīng)過幾十億年的長(zhǎng)期進(jìn)化而逐漸形成的，各物種之間存在著不同程度的親緣關(guān)系。根據(jù)生物分類規(guī)則，自然界中的生物分為原核生物和真核生物。由于原核生物在基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄催化酶類、RNA轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯過程及場(chǎng)所以及翻譯后蛋白加工等方面都與真核生物存在顯著差異，導(dǎo)致基因工程實(shí)際操作中目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因在受體細(xì)胞的表達(dá)及目的基因編碼蛋白的活性等方面存在差異1.原核生物細(xì)菌的基因直接導(dǎo)入真核生物的受體細(xì)胞，或真核生物基因(如人的白細(xì)胞介素基因)導(dǎo)入原核生物大腸桿菌中能否表達(dá)獲得重組蛋白的問題人教版高中生物學(xué)教材選擇性必修3中，在基因工程部分開篇引用轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例，該案例是基于蘇云金芽孢桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)基因?qū)胧荏w棉花細(xì)胞，再經(jīng)組織培養(yǎng)而成的基因工程產(chǎn)品。我們知道，無論原核生物還是真核生物，一個(gè)完整的基因包括啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子等組成部分，但真核生物與原核生物基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)及終止子都存在結(jié)構(gòu)差異，直接利用其本身的啟動(dòng)子無法在跨類的受體細(xì)胞中表達(dá)。這是因?yàn)樵嘶虻膯?dòng)子的基本結(jié)構(gòu)是－10區(qū)的共同序列TATA盒(Pribnowbox)和－35區(qū)的共同序列TTGACA(圖1A)，該結(jié)構(gòu)則是與原核生物轉(zhuǎn)錄催化酶RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)相適應(yīng)的，原核生物典型的RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)包含2個(gè)ɑ亞基、1個(gè)β亞基、1個(gè)β'亞基和1個(gè)ω亞基，與啟動(dòng)子結(jié)合后還結(jié)合1個(gè)σ因子(圖2A)。而真核生物基因典型的啟動(dòng)子包含了－25—－30區(qū)的TATAAA共同序列(Hognessbox)，－70—－80區(qū)的共同序列CCAAT(CAATbox)以及－80—－110區(qū)的富含GC的保守序列(GCbox)(圖1B)，真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與真核生物RNA聚合酶相適應(yīng)，真核生物的RNA聚合酶有3類:RNA聚合酶I、RNA聚合酶II以及RNA聚合酶III。RNA聚合酶I主要負(fù)責(zé)rRNA的轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶II主要負(fù)責(zé)mRNA的轉(zhuǎn)錄(圖2B)，而RNA聚合酶III主要催化tRNA的合成。真核生物每類RNA聚合酶都由8—16個(gè)亞基組成，結(jié)構(gòu)與原核生物的RNA聚合酶有相似性，但都比原核生物RNA聚合酶復(fù)雜。因此，原核基因的表達(dá)需要受體細(xì)胞有原核生物的RNA聚合酶，真核基因表達(dá)需要受體細(xì)胞提供真核生物的RNA聚合酶。此外，真核生物的基因多數(shù)是斷裂基因，即真核生物基因的編碼區(qū)是由編碼氨基酸的外顯子和不編碼氨基酸的內(nèi)含子交替排列組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體(核不均一RNA)需要進(jìn)一步通過去除內(nèi)含子、連接外顯子、5'加上m7GpppNmNm“帽子”以及3'添加poly(A)“尾巴”，才能加工成為連續(xù)編碼氨基酸序列的成熟mRNA。原核生物中沒有這套核不均一RNA的加工系統(tǒng)。因此，利用原核基因本身的啟動(dòng)子和編碼序列轉(zhuǎn)化真核生物受體細(xì)胞，或者利用真核生物基因的啟動(dòng)子和基因序列轉(zhuǎn)化原核生物受體細(xì)胞，目的基因在受體細(xì)胞中無法表達(dá)?；蚬こ虒?shí)際操作時(shí)，在原核生物中表達(dá)，要利用原核生物的啟動(dòng)子或噬菌體的啟動(dòng)子(受體細(xì)胞提供噬菌體的RNA聚合酶)，在真核生物中表達(dá)目的基因時(shí)，應(yīng)該利用真核生物或侵染真核生物病毒基因的啟動(dòng)子，當(dāng)真核生物基因轉(zhuǎn)化原核生物時(shí)，一般轉(zhuǎn)化的是該基因的cDNA而不是含有內(nèi)含子的原始基因。2.在進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建時(shí)，用于轉(zhuǎn)化原核生物的表達(dá)載體上有RBS序列，而轉(zhuǎn)化真核生物的載體一般沒有該序列原核生物mRNA在起始密碼子前7—12個(gè)核苷酸處有一個(gè)保守序列，該序列與核糖體小亞基中16SrRNA的3'端反向互補(bǔ)，是核糖體結(jié)合在mRNA上引起翻譯起始所必需的，該序列稱為SD序列(Shine-Dagarnosequence)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS，ribosomebindingsite)。真核生物翻譯的起始階段，核糖體與mRNA的結(jié)合不依賴于mRNA1上存在的RBS，真核生物40S核糖體上有一種m7GpppNmNm“帽子”結(jié)合蛋白(eIF4E)，該蛋白專一性識(shí)別mRNA“帽子”結(jié)構(gòu)，使核糖體40S小亞基與mRNA結(jié)合，經(jīng)過真核生物翻譯起始因子eIF3、eIF4G和poly(A)“尾巴”結(jié)合蛋白(PAB)而結(jié)合在3'poly(A)“尾巴”，最后通過大小亞基中rRNA的堿基配對(duì)，結(jié)合上60S的大亞基，引起翻譯的起始。在基因工程實(shí)際操作中，轉(zhuǎn)化原核生物的表達(dá)載體上通常在啟動(dòng)子和目的基因之間插入了RBS編碼序列，這樣目的基因在原核生物的受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后形成的mRNA可以順利與核糖體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)目的基因控制重組蛋白合成的效果。3.轉(zhuǎn)基因的受體細(xì)胞從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果都顯示是陽性，但在個(gè)體水平上卻檢測(cè)不到目的基因編碼蛋白質(zhì)的活性目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后，基因會(huì)隨著復(fù)制子的復(fù)制從親代細(xì)胞傳遞給子代細(xì)胞，會(huì)通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，也會(huì)通過翻譯產(chǎn)生目的基因編碼的蛋白質(zhì)。但是讓受體細(xì)胞產(chǎn)生目的基因控制性狀，翻譯出的蛋白質(zhì)必須具有生物學(xué)活性。重組蛋白在受體細(xì)胞翻譯出來以后，若其未能成功折疊、未能切除非功能肽段或未能進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾等，則Westernblotting等方法能檢測(cè)到重組蛋白的表達(dá)，卻檢測(cè)不到重組蛋白的活性。原核生物和真核生物都存在一些協(xié)助其他蛋白正確折疊成三級(jí)結(jié)構(gòu)的分子伴侶，雖然部分蛋白質(zhì)在缺少分子伴侶的條件下，依靠熱力學(xué)會(huì)自發(fā)折疊成有活性的三級(jí)結(jié)構(gòu)，但也有一些蛋白質(zhì)的折疊必須依賴特異的分子伴侶。此外，真核細(xì)胞中存在復(fù)雜的蛋白質(zhì)后加工系統(tǒng)，如蛋白質(zhì)N末端Met和非必需肽段的去除，分子內(nèi)二硫鍵的形成和部分氨基酸殘基的糖基化、磷酸化、甲基化等修飾加工，而原核生物中這些蛋白質(zhì)翻譯后加工能力比較有限。很多真核生物或人類基因(如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子———白細(xì)胞介素6的cDNA)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后可以大量表達(dá)重組白細(xì)胞介素6，但由于缺少合適的分子伴侶，該蛋白主要是以無規(guī)則蛋白顆?！w的形式存在，在溶液中也不溶解，無法檢測(cè)到其活性，需要在去垢劑存在下溶解包涵體，并經(jīng)進(jìn)一步復(fù)性才能獲得有活性的蛋白。胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，重組豬胰蛋白酶原在酵母中實(shí)現(xiàn)表達(dá)后，需要體外腸激酶切除部分C末端肽段后才能具有蛋白酶活性。促紅細(xì)胞生成素(又稱紅細(xì)胞刺激因子或促紅素)是一種人體內(nèi)源性糖蛋白激素，可刺激紅細(xì)胞生成，糖基對(duì)于穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能非常重要。促紅細(xì)胞生成素的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌能夠?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，但由于大腸桿菌無法對(duì)重組促紅細(xì)胞生成素進(jìn)行糖基化修飾，導(dǎo)致獲得的重組蛋白生物學(xué)活性很低，若該cDNA在真核細(xì)胞(如中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞)中表達(dá)，則獲得的重組促紅細(xì)胞生成素就顯示明顯的生物學(xué)活性?？茖W(xué)思維和科學(xué)探究意識(shí)的培養(yǎng)基因工程教學(xué)伴隨著大量科學(xué)思維訓(xùn)練的內(nèi)容，體現(xiàn)在基于證據(jù)得出結(jié)論，嚴(yán)謹(jǐn)縝密的思維過程，合乎邏輯的推理判斷?；蚬こ淌侨祟愅ㄟ^技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)了控制性狀基因的跨越物種、跨越生物