DB4403-T 122-2020人源腫瘤細(xì)胞系建立技術(shù)規(guī)范-（高清現(xiàn)行）

ICS07.080CCSC04

DB4403深 圳 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB4403/T122—2020人源腫瘤細(xì)胞系建立技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationforestablishmentofhumantumorcelllines2020-11-232020-11-232020-12-01深圳市市場監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言 II范圍 1規(guī)性用件 1術(shù)和義 1縮語 3樣獲取 3細(xì)建系 4質(zhì)檢測(cè) 6附錄A（料）捐基本息表 9附錄B（料）腫本信表 10附錄C（料）主器耗列表 11附錄E（料）同分析作程 14附錄E（料）同分析作程 14附錄F（料）腫胞特性記列表 16附錄G（料）臺(tái)染色準(zhǔn)程 17附錄H（料）凝驗(yàn)操流程 19參考獻(xiàn) 20前 言GB/T《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1本文件由深圳市發(fā)展和改革委員會(huì)提出和歸口。本文件起草單位：深圳華大生命科學(xué)研究院、深圳市標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院。人源腫瘤細(xì)胞系建立技術(shù)規(guī)范范圍本文件確立了人源腫瘤細(xì)胞系建立過程中樣本獲取、細(xì)胞建系以及質(zhì)量檢測(cè)的操作程序和一般原則。本文件適用于人源實(shí)體腫瘤細(xì)胞系相關(guān)研究。（GB18467獻(xiàn)血者健康檢查要求YY/T0588流式細(xì)胞儀SZDB/Z238短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型法鑒定人源細(xì)胞系技術(shù)規(guī)范AS—AS—00—205（CO1DNSpeies—LevelIdentificationofAnimalCellsthroughMitochondrialCytochromeOxidaseSubunit1(CO1)DNABarcodes）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1供體donor提供腫瘤樣本的捐贈(zèng)者。3.2原代細(xì)胞primarycell直接由獲取的人體組織或器官制備形成的細(xì)胞。3.3細(xì)胞系cellline3.4實(shí)體瘤solidtumor3.5平衡鹽溶液balancedsaltsolutionpH注：常用于細(xì)胞、組織的洗滌。3.6密度梯度離心densitygradientcentrifugation3.7在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，對(duì)數(shù)期中細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需的時(shí)間。3.8成瘤性tumorigenicity在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，對(duì)數(shù)期中細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需的時(shí)間。3.8成瘤性tumorigenicity細(xì)胞接種動(dòng)物后在注射部位和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細(xì)胞本身形成腫瘤能力。3.9染色體chromosome遺傳信息的載體，由DNA、RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的，其形態(tài)和數(shù)目具有種系的特性。注：在細(xì)胞間期核中，以染色質(zhì)絲形式存在。在細(xì)胞分裂時(shí)，染色質(zhì)絲經(jīng)過螺旋化、折疊、包裝成為染色體，為顯微鏡下可見的具不同形狀的小體。3.10同工酶分析isoenzymeanalysis具有相似或相同特異性的酶，利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，研究細(xì)胞裂解過程中同工酶的遷移規(guī)律，以獲得具有物種特異性的同功酶譜的過程。3.11核型分析karyotypeanalysis3.12聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction通過DNA互補(bǔ)雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環(huán)來擴(kuò)增DNA特定序列的方法。3.13流式細(xì)胞術(shù)flowcytometry3.14免疫熒光技術(shù)immunofluorescencetechnique將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞分布的方法。3.15細(xì)胞半數(shù)致瘤量50%tumorproducingdose能使50%動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤的最低移植細(xì)胞量。能使50%動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤的最低移植細(xì)胞量。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BPV：牛細(xì)小病毒（Bovineparvovirus）CMV：巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus）DMSO：二甲基亞砜(DimethylSulfoxide)DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EBV：人類皰疹病毒四型（Epstein—Barrvirus）EDTA（EthylenediaminetetraaceticAcid）HBV（HepatitisBVirus）HCV（HepatitisCVirus）HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HTLV：人類嗜T細(xì)胞病毒（HumanT—lymphotropicVirus）PBS：磷酸鹽緩沖溶液（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）PPV：豬細(xì)小病毒（PorcineParvovirus）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）5樣本獲取5.1倫理審批和知情同意應(yīng)與捐贈(zèng)者溝通，詳細(xì)講解項(xiàng)目背景、意義，采集的樣本量、用途、潛在風(fēng)險(xiǎn)以及捐贈(zèng)的權(quán)利、義務(wù)A。?！±眍愋蜑榛旌闲?；——人源特定病毒檢測(cè)結(jié)果不符合GB18467的規(guī)定；——有精神障礙；——伴有其他免疫性疾病，或長期應(yīng)用免疫抑制劑或激素；——醫(yī)生認(rèn)為其他不適合情況。C。5mm。5.5.2胸腹水樣本20mL。400IU/mL12h，運(yùn)輸溫度4℃～102h。6細(xì)胞建系總則實(shí)體瘤樣本宜選擇組織塊法或酶消化法進(jìn)行原代細(xì)胞分離。41mm3～2mm320T25375%2h～4。41mm3～2mm31mL～3mL0.25200IU/mL0.5h～143mL～5mL100μm4200g～300g5min～10min0.5～1×106/mL3754300g～500g5min～10min12h～72h2～380DE.3.1—E.3.6min～20min。5min～20min。6.3.3.21～350IU/mL～200IU/mL0.05～0.256.3.5.16.3.3.11.025～1.08520g10min。6.3.5.21.050～1.0852～3。5×107～1×108（D。10%～15(DMSO1×106/mL～1×107/mL。1mL/凍存管宜放入程序降溫盒中，置于-80細(xì)胞梯度降溫至-80℃。亦或?qū)⒓?xì)胞置于含速凍保存液的微毛細(xì)管中，直接放置于液氮保存。降溫完宜采用脫氧核糖核酸（DNA）條形碼分析或同工酶法。DNA條形碼分析宜參考ASN—0003—2015，同工酶法檢測(cè)參見附錄E。按照SZDB/Z238對(duì)細(xì)胞系間特性進(jìn)行鑒定。YY/T0588。細(xì)胞存活率宜參考附錄G9080%。YY/T9080%。（2020腫瘤細(xì)胞系凝集試驗(yàn)宜參考附錄H。征檔案。征檔案。（》（2020）4(TPD50)。7.2.1.17.2.1.2施。7.2.1.3細(xì)胞系在凍存前應(yīng)進(jìn)行無菌檢測(cè)。）（2020）1101腫瘤細(xì)胞系的無菌檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。7.2.3內(nèi)、外源病毒因子檢測(cè)EBV、HBV、HCV、HIV—1、HIV—2、HTLV—1、HTLV—2CMV、PPVBPV三部（20203306HIV—1/2、HBV、HCVHTLV—1/2、EBV、CMV宜采用經(jīng)批準(zhǔn)的基于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)豬細(xì)小病毒或牛細(xì)小病毒進(jìn)行檢測(cè)。（），附錄A（）表A.1給出了捐贈(zèng)者基本信息表。表A.1捐贈(zèng)者基本信息表姓名： 住院登記號(hào)： 病理號(hào)：年齡： 性別：聯(lián)系地址：聯(lián)系電話： 郵編：吸煙史（年： 吸煙（/日：飲白酒史（年： 飲白酒（/日：病史： 藥物過敏史：家族疾病史： 用藥史：簡要病情及手術(shù)原因介紹:術(shù)前治療：手術(shù)名稱：手術(shù)時(shí)間： 年 月 日 時(shí) 切除部位： 組織切除量：手術(shù)情況記錄：手術(shù)醫(yī)生簽名： 隨同手術(shù)人簽名：家屬確認(rèn)簽名： 日期： 年 月 日 時(shí)病理描述及拍照（附照片：病理醫(yī)生簽名： 日期： 年 月 日 時(shí) 分組織樣本交接情況：交接人： 日期： 年 月 日附錄B（）表B.1給出了腫瘤樣本信息表。表B.1腫瘤樣本信息表捐贈(zèng)者基本信息捐贈(zèng)者姓名捐贈(zèng)者ID性別口男 口女出生日期樣本收集與處理信息樣本類型樣本編號(hào)采樣日期樣本采集人員樣本采集量處理方法（溫度、操作：處理開始時(shí)間處理完成時(shí)間樣本信息樣本編碼腫瘤類型（T或N）取材數(shù)量組織質(zhì)量(A或B或C)運(yùn)輸保存保存條件保存溫度運(yùn)輸方式運(yùn)輸時(shí)間備注注1：捐贈(zèng)者ID以腫瘤類別（兩位數(shù)）+年份（四位數(shù)）+流水號(hào)（四位數(shù)）+組成樣本編碼。注2：樣本類型，根據(jù)NIH的病例檢索標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行填寫。注3：腫瘤類型，用T和N代表腫瘤及正常，T及N后面的數(shù)字表示取材份數(shù)。注4：組織質(zhì)量用A、B、C表示（A＝無明顯壞死、B＝散在壞死、鈣化，C＝大量壞死）。附錄C（）C.1主要儀器表C.1給出了主要儀器列表。表C.1主要儀器列表階段儀器名稱用途樣本采集低溫標(biāo)簽制作套裝打印標(biāo)簽冷藏冰箱（2～8℃）樣本暫存細(xì)胞建系冷藏冰箱（2℃～8℃）樣本暫存低溫標(biāo)簽制作套裝制作標(biāo)簽條碼掃描器掃描條碼（-20～4015000g）樣本離心生物安全柜操作平臺(tái)移液器（10μL100μL、1000μL）細(xì)胞處理與轉(zhuǎn)移細(xì)胞凍存凍存架放置凍存盒-80℃冰箱部分樣本儲(chǔ)存液氮罐部分樣本儲(chǔ)存C.2主要耗材C.2主要耗材表C.2給出了主要耗材列表。C.2階段耗材名稱用途樣本采集無菌醫(yī)用手套（無粉）個(gè)人防護(hù)棉簽消毒采血管采血容器采血針穿刺眼科剪組織樣本剪碎組織剪組織樣本分離組織鑷組織樣本分離醫(yī)用無菌注射器胸腹水的抽取手術(shù)刀組織切除標(biāo)簽樣本標(biāo)識(shí)表C.2（續(xù)）階段耗材名稱用途樣本采集醫(yī)用口罩個(gè)人防護(hù)細(xì)胞建系離心管樣本細(xì)胞的收集移液管細(xì)胞懸液及培養(yǎng)液的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞刮細(xì)胞的刮除和純化眼科剪組織樣本剪碎組織鑷組織樣本分離細(xì)胞凍存凍存管儲(chǔ)存樣本凍存盒放置凍存管程序降溫盒樣本的程序性降溫附錄D（）儀器（℃～6580（4015000g（10μμ000μ75cm2/75用50mL離心管，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，并用平衡鹽溶液清洗細(xì)胞1～2次，以免剩余培養(yǎng)液影響胰1mL含0.05%～0.25%Trypsin—EDTA），371min～3min，消化期后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化。300g～5005min。去掉細(xì)胞上清液，加入適量平衡鹽溶液清洗細(xì)胞2～3次，采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和檢活。3mL5000/cm2～6000/cm237℃，5%根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)進(jìn)行換液。一般2～3天后應(yīng)換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長至85附錄E（資料性）同工酶分析操作流程儀器（℃～6580（～4015000g）（0.1mg～220g）、4pH：0.001pHV～300V）Tris0.303g，（EDTA）0.0186g2TritonX—100，50mL，鹽酸（HCl）調(diào)pH至7.5，410.3g1.84g1000mL，4（LDH）（NAD）5mg（MTT）2mg（PMS）0.4mg，1mol/L乳酸鈉1mL，0.1mol/L氯化鈉（NaCl）0.5mL，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸（Tris—HCl）（pH8.0）1.5mL10mL。6（G6PD）（NADP）3（MTT）2mg，葡萄糖—6—磷酸脫氫酶(G6PD)50mg，氯化鎂（MgCL2）10mg，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸（Tris—HCl）（pH8.0）2mL10mL。（NP）肌苷2020.40.3mol/LNa2HPO41mol/LTris—HC1（pH7.5）1mL10mL。0.8g，EDTA0.035g，100mL1mL37mL10300離心10min1mLPBSPBS。2min～3min30min，4g～8000離心5minEP，-20將2片0.175mm4電泳小心將凝膠剝離膠板，將載有凝膠的膠片放入電泳槽內(nèi)，然后將細(xì)胞裂解上清液按照每孔1μL～3μL/30乳酸脫氫酶電泳電壓為95V，電泳時(shí)間為1.5h；葡萄糖—6—磷酸脫氫酶電泳電壓為90V，電泳時(shí)間為1h；核苷酸磷酸脫氫酶電泳電壓為85V，電泳時(shí)間為1h。為保證同工酶的活性，電泳過程顯色E.3.4.1E.3.4.1停止電泳后，取出凝膠膠片，放置在暗盒內(nèi)，注入3mL～5mL對(duì)應(yīng)底物的顯色液，37℃反應(yīng)20min～25min。E.3.4.2酶譜出現(xiàn)后，在清水中清洗膠片2～3次，用濾紙吸去膠片上的殘留水分即可拍照。E.4判定標(biāo)準(zhǔn)相同，則判定待檢細(xì)胞系為同一種屬細(xì)胞系。污染。附錄F（資料性）腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)記物列表表F.1給出了腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)記物列表。表F.1腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)記物列表腫瘤細(xì)胞系種類細(xì)胞特異性標(biāo)記物肺癌細(xì)胞CYFRA21—1、NSE、SCC、CEA、CA50均應(yīng)表達(dá)肝癌細(xì)胞AFP、AFU、CEA、CA19—9均應(yīng)表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞CEA、Ki67、CK20、CK7、CA19—9、CA50均應(yīng)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞CA15—3、CEA、CA125均應(yīng)表達(dá)卵巢癌細(xì)胞CA125、CEA、CA72—4、β—HCG、AFP均應(yīng)表達(dá)宮頸癌細(xì)胞CEA、CA72—4均應(yīng)表達(dá)子宮癌細(xì)胞CEA、SCC、SF、β—HCG均應(yīng)表達(dá)胃癌細(xì)胞CEA、CA72—4、CA19—9均應(yīng)表達(dá)黑色素細(xì)胞S—100、NKI—C3、HMB—45均應(yīng)表達(dá)前列腺癌細(xì)胞PAP、PSA、F—PSA均應(yīng)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞HCG、CEA、AFP均應(yīng)表達(dá)附錄G（資料性）臺(tái)盼藍(lán)染色標(biāo)準(zhǔn)流程儀器顯微鏡、玻片、蓋玻片、滴管。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液、生理鹽水、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。PBS取0.5mL1:10.5mL濃度為0.4%3min～10min。注1：因臺(tái)盼藍(lán)具有細(xì)胞毒性，染色時(shí)間過久會(huì)導(dǎo)致部分死細(xì)胞染色，干擾計(jì)數(shù)。注2：0.2mL0.50.5mL0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色液染色。（細(xì)胞和死細(xì)胞）和總細(xì)胞。注1：用移液槍加染色細(xì)胞時(shí)，沿著蓋玻片的邊緣輕輕加液使其完全覆蓋住整個(gè)小室。注2：1mm2方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)通?？刂圃?0—50個(gè)，若細(xì)胞數(shù)超過200個(gè)，需重新調(diào)整稀釋倍數(shù)。（G.1）。其中：式中：N——細(xì)胞數(shù)目（個(gè)）；C——細(xì)胞濃度（個(gè)/mL）；V——細(xì)胞懸液體積（mL）；

N=C×V ?????（G.）C=M×D×104 ??????G.）M——細(xì)胞計(jì)數(shù)板單個(gè)方格的平均細(xì)胞數(shù)（個(gè)）；D——稀釋倍數(shù)。（G.3）。Vi=總—N著)/N總×10% ?????（G3）式中：N總——總細(xì)胞數(shù)（個(gè)）；N著色——總著色細(xì)胞數(shù)（個(gè)）。附錄H（）儀器℃～6580℃～4015000）75cm2腫瘤細(xì)胞系凝集試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括空包對(duì)照組、腫瘤細(xì)胞系的試驗(yàn)組和人成纖維細(xì)胞的陰性對(duì)照0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL50μg/mL、100μg/mL。0.1mL—PBS溶液0.10.1mL—PBS溶液0.1mL，使刀：100μg/mL50μg/mL、25μg/mL12.5μg/mL和0μg/mL（）。5min～10minH.4判斷標(biāo)準(zhǔn)（小于50μg/mL）均無凝集現(xiàn)象產(chǎn)生，判斷該試驗(yàn)有效。參考文獻(xiàn)三部》（2020）（）—CFDA2015.），2007.郭建華,張吉才,李曉強(qiáng),等.胸腹水細(xì)胞學(xué)前檢查各環(huán)節(jié)因素分析[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(3):315—317.J].2009,15(4):522—524.楊永強(qiáng),張巧玲.FicollJ[M]2006.AgarwalS,RimmDL.MakingEveryCellLikeHeLa:AGiantStepForCellCulture[J].AmericanJournalofPathology,2012,180(2):443—445.AhmedD,EidePW,EilertsenIA,etal.Epigeneticandgeneticfeaturesof24coloncancercelllines[J].Oncogenesis,2013,2(9):e71.ANSI/ATCC,AuthenticationofHumanCellLines:StandardizationofSTRProfiling.2011,ASN—0002—2011.BarretinaJ,CaponigroG,StranskyN,etal.TheCancerCellLineEncyclopediaenablespredictivemodellingofanticancerdrugsensitivity.[J].Nature,2012,483(7391):603.CarneyDN,GazdarAF,BeplerG,etal.Establishmentandidentificationofsmallcelllungcancercelllineshavingclassicandvariantfeatures[J].CancerResearch,1985,45(6):2913—23.CayrefourcqL,MazardT,JoosseS,etal.Establishmentandcharacterizationofacelllinefromhumancirculatingcoloncancercells[J].CancerResearch,2015,75(5):892—901.Dangles—MarieV,PocardM,RichonS,etal.Establishmentofhumancoloncancerlinesfromfreshtumorsversusxenografts:comparisonofsuccessrateandcelllinefeatures[J].Cancerresearch,2007,67(1):398—407.DuffyMJ.TumorMarkersinClinicalPractice:AReviewFocusingonCommonSolidCancers[J].MedicalP