植物組織培養(yǎng)的設(shè)備與使用方法

植物組織培養(yǎng)的設(shè)備與使用方法植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下培養(yǎng)植物材料。 要達(dá)到無(wú)菌操作和無(wú)菌培養(yǎng)，就需要認(rèn)為創(chuàng)造無(wú)菌的環(huán)境，使用無(wú)菌的器具，同時(shí)還需要人工控制的溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。無(wú)菌環(huán)境和無(wú)菌條件的創(chuàng)造需要一定的設(shè)備， 實(shí)驗(yàn)設(shè)備因工作的目的、 具體的任務(wù)和所具有的條件而異。但大多數(shù)采用化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、微生物實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)療上的一些設(shè)備、用具。

器材和圖1組培室分區(qū)布局1實(shí)驗(yàn)室基本組成無(wú)菌操作室在植物組織培養(yǎng)中，無(wú)菌操作室(cleanchamber)是進(jìn)行植物材料的分離及培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移的一個(gè)要場(chǎng)所。由于植物組織培養(yǎng)需長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)菌操作， 所以無(wú)菌條件的好壞對(duì)組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。微生物的培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間短，而植物組織培養(yǎng)短的一個(gè)月，長(zhǎng)的達(dá)幾年。所以，防止細(xì)菌和霉菌混入是提高工作效率和影響生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。無(wú)菌操作室基本要求是：干凈無(wú)菌、密閉、光線好。一般安裝滑動(dòng)門(mén)，使空氣不致流動(dòng)，以防界菌及塵埃的侵入；墻壁光滑平整，地面平坦無(wú)逢，便于清潔工作；室內(nèi)安裝紫外燈，以便滅菌，還要有照明裝置及燈座，以備臨時(shí)增加設(shè)備之用；室內(nèi)有超凈工作臺(tái)、移動(dòng)式載物臺(tái)(醫(yī)用平板推車(chē))、廣口瓶、試管、三角瓶、酒精燈、接種工具等。面積根據(jù)工作性質(zhì)可大可小，小的無(wú)菌操作室一般一間 5~7怦即可。接種室內(nèi)主要安放超凈工作臺(tái)，分單人使用和雙人同時(shí)連續(xù)作業(yè)使用兩種。超凈臺(tái)中準(zhǔn)備接種的器具，如尖頭小鑷子、彎頭小鑷子、接種針、解剖刀、手術(shù)剪刀等，以及酒精燈、儲(chǔ)存70%酉精浸泡的棉球的廣口瓶等。 如果進(jìn)行生長(zhǎng)點(diǎn)或幼胚等細(xì)小結(jié)構(gòu)的分離與接種，還應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)放置一臺(tái)小型的雙目解剖鏡，以便觀察、解剖和分離細(xì)小的外植體。小型離心機(jī)主要用于分離和收集液體培養(yǎng)中的細(xì)胞、單花粉及原生質(zhì)體等，也可用來(lái)篩選處于不同發(fā)育階段的胚狀體。無(wú)菌室外最好設(shè)置預(yù)備室作為緩沖間，以防工作人員進(jìn)出時(shí)帶進(jìn)雜菌?？販毓庹张囵B(yǎng)箱可以安放在緩沖間內(nèi)。預(yù)備室與無(wú)菌室之間最好以玻璃相隔，便于觀察和參觀。在預(yù)備室可放置工作服、鞋、帽等，也需要裝自來(lái)水和紫外燈。化學(xué)實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)中植物植物材料是生長(zhǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，這就需要在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室預(yù)先配制好培養(yǎng)基?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)室一般由以下幾個(gè)部分組成：洗滌室主要用于培養(yǎng)容器、玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料的清洗。新購(gòu)進(jìn)的玻璃器皿一般先1%較難洗滌的器皿，如吸管等應(yīng)用洗液進(jìn)行洗滌。洗滌室需備有工作臺(tái)面、上水管和下水管、水池、落水架、電源、干燥箱等。（2）藥品室 用于存放無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、糖類(lèi)、瓊脂、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等各種化學(xué)藥品。要求室內(nèi)干燥、通風(fēng)、避免光照。室內(nèi)設(shè)有藥品柜、冰箱等設(shè)備。各類(lèi)化學(xué)試劑安要求分類(lèi)存放，需要低溫保存的藥劑應(yīng)置于冰箱保存。有毒藥品應(yīng)按規(guī)定存放和管理。（3）1/100普通天平（coarsebalanc?1/10000的電子天平（sensitivebalanee）1/1000和1/100000的天平，形成系列。除電源外，應(yīng)設(shè)有防震固定的臺(tái)座。（4）培養(yǎng)基配置室用于配制、分裝培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基的暫時(shí)存放。室內(nèi)應(yīng)配有各種試管、三角瓶、燒杯、量筒、吸管、移液器等器具；有平面實(shí)驗(yàn)臺(tái)以及安放藥品和器皿的各類(lèi)藥品柜、器械柜、物品存放架；有水浴鍋、電飯鍋、微波爐、過(guò)濾裝置、酸度計(jì)、分注器以及貯藏母液的冰箱等。（5）滅菌室用于器皿、器械、封口材料和培養(yǎng)基的消毒滅菌。要求墻壁耐濕、耐高溫。室內(nèi)需要備有高壓蒸汽滅菌裝置、細(xì)菌過(guò)濾裝置、煤氣灶和電爐等。玻璃器皿和小用具的消毒常采用干熱滅菌法，些用具，采用120C高壓蒸汽滅菌法。

150C約保持1-3h。培養(yǎng)基、蒸餾水及一在沒(méi)有條件的地方，可將上述工作合并在一個(gè)房間內(nèi)完成，但設(shè)備的安裝與排列要合理，房間要寬敞、明亮、通風(fēng)。培養(yǎng)室培養(yǎng)室（cultureroom）是將接種到試管等的培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。需配有固定式培養(yǎng)架、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床和搖床、控溫控光設(shè)備，以滿足器官（芽、莖、花藥等） 愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體的固體和液體培養(yǎng)的需要。進(jìn)行固體培養(yǎng)和試管苗大量繁殖時(shí)，培養(yǎng)材料通常擺在培養(yǎng)架上，制作培養(yǎng)架應(yīng)考慮使用方便節(jié)能、充分利用空間以及安全可靠。培養(yǎng)架材料為金屬、鋁合金或木制品。隔板可用玻璃板、木板、纖維板、金屬板等，最好使用玻璃板或鐵絲網(wǎng)，既透光，上層培養(yǎng)物又不受熱。為使用方便，通常設(shè)計(jì)為 5-7層，最低一層離地面高約 50cm,以上每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架高約1.7-2.3m。一般在每層上方裝置日光燈以供補(bǔ)充光照，培養(yǎng)架長(zhǎng)度通常根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)。寬度可根據(jù)工作情況而定，一般裝

2支日光燈，寬40-50cm。最好使用專(zhuān)門(mén)為組織培養(yǎng)設(shè)計(jì)的節(jié)能冷光源,其光譜與日光相近且省電。每日照明時(shí)間根據(jù)培養(yǎng)物的特性不同而有所區(qū)別，一般為

10-16h，最好用自動(dòng)計(jì)時(shí)器控制光照時(shí)間。培養(yǎng)室要保持一定的溫度條件，大多數(shù)情況保持在

20-27C,要求室內(nèi)溫度均勻一致。室內(nèi)濕度也要求恒定。為防止培養(yǎng)基的干燥和菌類(lèi)污染,相對(duì)濕度保持在

70%-80%為好。溫濕度的保持可用空調(diào)機(jī)或調(diào)濕機(jī)通過(guò)繼電器、石英定時(shí)開(kāi)關(guān)鐘、控溫儀等來(lái)控制。大多數(shù)恒溫培養(yǎng),應(yīng)根據(jù)要求預(yù)先調(diào)節(jié)好。溫度變動(dòng)太大,易使培養(yǎng)材料遭受菌類(lèi)污染。培養(yǎng)室應(yīng)保持整潔。有條件的可裝置細(xì)菌過(guò)濾裝置。如需進(jìn)行液體培養(yǎng),還應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)的種類(lèi)放置搖床、轉(zhuǎn)床等各種培養(yǎng)裝置。轉(zhuǎn)床上的培養(yǎng)瓶不同的轉(zhuǎn)動(dòng),瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物交替地處于液相和氣相,保證了良好的通氣條件,有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。此應(yīng)有暗培養(yǎng)的設(shè)備,如柜子或無(wú)光培養(yǎng)箱。

有的實(shí)驗(yàn)要求暗培養(yǎng),因此外,為避免蟲(chóng)類(lèi)侵染,培養(yǎng)室應(yīng)杜絕栽培植物。培養(yǎng)室附近也應(yīng)盡量避免放置盆花等植物。細(xì)胞學(xué)觀察室用于觀察、記錄培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)情況及結(jié)果。室內(nèi)要有固定的水磨石或瓷磚臺(tái)板,以放置顯微鏡、解剖鏡、倒置顯微鏡及照相設(shè)備等儀器。馴化移栽室用于試管苗的移栽。通常在溫室或塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。室內(nèi)備有彌霧裝置、遮蔭網(wǎng)、移植床等設(shè)施；缽、盆、移植盤(pán)等移植容器；草炭、蛭石、沙子等移植基質(zhì)。試管苗移植一般要求溫室溫度在15C-35C,相對(duì)濕度70鳩上。超凈工作臺(tái)使用無(wú)菌操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。超凈工作臺(tái)內(nèi)在都裝有一個(gè)小電動(dòng)機(jī)，它帶動(dòng)風(fēng)扇0.3口的顆粒濾掉，然后這種不帶真菌和細(xì)菌的超凈氣流吹過(guò)臺(tái)面上的整個(gè)工作區(qū)域。 由高效過(guò)濾器吹出來(lái)的空氣的速度大約是(27±3)m/min，所有的污染物都會(huì)被這種超凈氣流吹跑。只要超凈工作臺(tái)不停的運(yùn)轉(zhuǎn)，在臺(tái)面上即可保持一個(gè)完全無(wú)菌的環(huán)境，而且這種氣流不會(huì)吹滅在臺(tái)面上使用的精燈。為了延長(zhǎng)過(guò)濾器的使用壽命，超凈工作臺(tái)不要安放在塵埃多的地方，需定期檢查超凈工作臺(tái)臺(tái)面10min的東西也不宜太多，特別注意不要把物件堆得太高，以免擋住氣流。在使用超凈工作臺(tái)時(shí)應(yīng)注意安全，當(dāng)臺(tái)面上的酒精燈已經(jīng)點(diǎn)燃以后，千萬(wàn)不要再噴灑酒精消毒臺(tái)面，否則很易引起火災(zāi)。無(wú)菌操作的步驟將植物組織塊放入一個(gè)廣口玻璃瓶中，加入含有幾滴活化劑的濃度適當(dāng)?shù)南疽?，時(shí)搖動(dòng)玻璃瓶。消毒結(jié)束后，打開(kāi)瓶蓋，將消毒液倒出，注入適量的無(wú)菌蒸餾水(經(jīng)高壓滅菌后)，再蓋上蓋，搖動(dòng)數(shù)次，將水倒掉，如此重復(fù)3-4次。將材料取出，放在一個(gè)已經(jīng)滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中。在對(duì)植物材料進(jìn)行消毒處理的同時(shí)，對(duì)所要使用的器械進(jìn)行消毒，先在 90%酒精中蘸一下取出，在酒精燈火焰上消毒，然后放在器械架上冷卻備用。所有操作器械在每次使用后均需要再用火焰消毒一次。使用消過(guò)毒的器械(如解剖刀、解剖針、打孔器、剪刀等)從已經(jīng)過(guò)表面消毒的材料切取適當(dāng)?shù)耐庵搀w。如果需要用解剖鏡，應(yīng)事先用進(jìn)行消毒。

70%酒精棉擦拭顯微鏡臺(tái)表面打開(kāi)培養(yǎng)容器，將外植體接種到培養(yǎng)基上。如果使用的是玻璃培養(yǎng)容器，把瓶口置酒精燈火焰上烘烤數(shù)秒鐘，然后迅速用瓶蓋或封口膜封嚴(yán)。高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法高壓滅菌鍋是一個(gè)能夠耐壓同時(shí)可以密閉的金屬鍋，有立式與臥式兩種。熱源可以用蒸汽、煤氣爐、電爐等。滅菌器上裝有溫度計(jì)和壓力表， 還有排氣口，它的作用是在密閉之前，利用蒸汽將鍋內(nèi)的冷空氣排盡。此外在滅菌鍋上還裝有安全活塞，如果壓力超過(guò)一定限度，活塞的閥門(mén)即能自動(dòng)打開(kāi)，放出多余的蒸汽。1)打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)或從加水口處加水?？垮伇冢悦饫淠槺诹魅胛锲分?。加蓋旋緊螺旋，是鍋密閉。打開(kāi)放氣閥，加熱，自開(kāi)始產(chǎn)生蒸汽后約 3min再關(guān)緊放氣閥，此時(shí)蒸汽已將鍋內(nèi)的冷空氣由排氣孔排出，讓溫度隨蒸汽壓力增高而上升。待壓力逐漸上升至所需壓1.034*105Pa20min之逐漸下降。滅菌后，待壓力降為0時(shí)，開(kāi)蓋，取出滅菌物品。在壓力未完全下降時(shí)，切勿打開(kāi)鍋蓋。37C24h從鍋內(nèi)取出趁熱擺成斜面。PH計(jì)操作程序接上電源，打開(kāi)機(jī)