檢測(cè)豬源牛病毒性腹瀉病毒熒光RT

檢測(cè)豬源牛病毒性腹瀉病毒熒光RT〔〕:

摘要：目的對(duì)豬源牛病毒性腹瀉病毒熒光RT-PCR方法的建立與監(jiān)測(cè)進(jìn)展分析。方法對(duì)屠宰場(chǎng)的359份屠宰豬血清進(jìn)展牛病毒性腹瀉病毒〔以下簡(jiǎn)稱為BVDV〕感染的病原進(jìn)展檢測(cè)。結(jié)果待檢測(cè)的359份血清樣品中有52分成陽(yáng)性，陽(yáng)性率為14.5%，其中發(fā)現(xiàn)13份BVDV陽(yáng)性樣品中5prime;端UTR片段均與VEDEVAC進(jìn)化譜系較為親密，均為基因Ⅰ型。結(jié)論豬源BVDV建立特異性熒光RT-PCR方法于對(duì)豬源BVDV感染的監(jiān)測(cè)具有良好的特異性和重復(fù)性，有良好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：豬源牛病毒性腹瀉病毒；熒光RT-PCR方法；建立；監(jiān)測(cè)

本文引用格式：王夢(mèng)迪.檢測(cè)豬源牛病毒性腹瀉病毒熒光RT-PCR方法的建立與監(jiān)測(cè)分析[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2022,19(82):240,243.

0引言

在中國(guó)，王新平于1996年首次發(fā)現(xiàn)該病毒，并從疑似豬瘟病例中檢測(cè)別離出來(lái)。目前，吉林、遼寧、浙江、上海和福建的豬都感染了BVDV。感染BVDV的豬不僅區(qū)分臨床病癥而且僅與軟豬瘟病感染類似的臨床病癥和病理變化，因此BVDV可區(qū)別于豬瘟病毒感染和區(qū)別BVDV和豬瘟病毒病癥。在免疫學(xué)方面，疾病和豬瘟也存在廣泛的穿插性，很難診斷并預(yù)防。研究提出了豬熒光RT-PCR檢測(cè)BVDV的方法，為上述福州屠宰豬BVDV病原體檢測(cè)豬BVDV來(lái)源的研究奠定了根底。

1材料與方法

1.1細(xì)胞和病毒

參考菌株小病毒腹瀉病毒〔BVDV〕OreGOnC24V、豬株〔HCLv〕CH-1R、豬繁殖與呼吸綜合征〔PRRSV〕、便攜式豬胃腸炎病毒〔TGEV〕HB08由阻尼公司提供;小腎細(xì)胞傳代細(xì)胞〔mDBK〕由天津進(jìn)入檢驗(yàn)檢疫局提供。

1.2主要試劑和儀器

Mem營(yíng)養(yǎng)液在GiBCO購(gòu)置；裂解物TrizOL購(gòu)自inViTrOGen；TaqDNA聚合酶；從AMV逆轉(zhuǎn)錄酶RNA抑制DnTPmiXTureVaoBiology〔Dalian〕Co;在BiOrAD購(gòu)置的CFX96定量PCR熒光儀器。

1.3檢測(cè)樣品來(lái)源

從屠宰場(chǎng)福州附近的屠宰豬采集的35.9個(gè)樣本測(cè)試。

1.4樣品處理與病毒RNA提取

1.4.1樣品處理

從5mL預(yù)冷的PBS靶均勻的輸入中取出上清液，將2mL屠宰的豬血清在10℃下混合離心至少10分鐘，然后使用500r。

1.4.2參考病毒懸液和毒力測(cè)定

通常用mDBK細(xì)胞培養(yǎng)BVDV參考菌株OreGOnC24V，將病毒解凍，洗滌3次并以5000rpm離心10分鐘。將上清液儲(chǔ)存在-70℃用作參考病毒懸浮液。將參考病毒懸浮液用維持溶液中稀釋10-1至10-8倍，并將每滴度5.0l/孔參加96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的4個(gè)孔中。將穩(wěn)定良好的單層細(xì)胞，溶解在細(xì)胞的分散液中，然后通過(guò)生長(zhǎng)溶液以每孔100l的3x105細(xì)胞毒性緩沖液-mL＆supmin參加到細(xì)胞板的每個(gè)孔中來(lái)制備。同時(shí)，在每個(gè)平板上設(shè)置4孔細(xì)胞對(duì)照。在37℃和6℃下觀察培養(yǎng)物，記錄二氧化碳培養(yǎng)和細(xì)胞損傷。使用Reed-muenCH方法計(jì)算感染物的一半〔TCiD5.0/5.0l〕。

1.5熒光RT-PCR擴(kuò)增

1.5.1敏感性試驗(yàn)

除去標(biāo)準(zhǔn)病毒懸浮液，在熒光RT-PCR反響系統(tǒng)和1.4.1中描繪的方法中，在盡可能一樣的條件下稀釋和擴(kuò)增1.0倍稀釋的病毒總RNA，確保靈敏度。

1.5.2重復(fù)性試驗(yàn)

在一樣條件下測(cè)試BVDV參考病毒懸浮液的單個(gè)樣品五次，以確定組內(nèi)的重復(fù)性，并且重復(fù)單個(gè)樣品重復(fù)五次以重復(fù)RNA確定檢測(cè)到的組。

1.5.3熒光RT-PCR的應(yīng)用檢測(cè)

使用建立的RT-PCR熒光法測(cè)試屠宰的豬血清樣品。

2結(jié)果與分析

2.1熒光RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)病毒懸浮液的毒力試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Reed-Muignton法用105.2TCiD50/50l計(jì)算一半的感染劑量，并將病毒的毒力稀釋10倍。通過(guò)熒光RT-PCR提取的104、105、106、107,、108、109.1x102.21x101.2、1x100.2、1x10-8、1x10-1.8、1x102.8、1x10-3.8TCiD50/50l稀釋病毒RNA檢測(cè)到結(jié)果，該方法的最小檢測(cè)限為1x10-2.8TCiD50/50L。結(jié)果如圖1所示。

2.2熒光RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

假設(shè)使用與BVDV參考菌株一樣的引物和探針來(lái)檢測(cè)熒光RT-PCR顯示正常的擴(kuò)增曲線，而MDBK細(xì)胞、PRRS菌株、TGEV菌株和HCLv菌株沒(méi)有更多的擴(kuò)增曲線，對(duì)BVDV參考病毒樣品進(jìn)展5次熒光RT-PCR實(shí)驗(yàn)。熒光RT-PCR的重復(fù)性2.4結(jié)果在一樣條件下復(fù)制，獲得一樣的擴(kuò)增曲線，從而顯示組內(nèi)的重復(fù)性。用RNA提取單個(gè)樣品5次以重復(fù)RT-PCR檢測(cè)，并獲得所得的擴(kuò)增曲線。結(jié)果說(shuō)明，該方法具有良好的組間重復(fù)性。

2.3熒光RT-PCR的應(yīng)用檢測(cè)

基于現(xiàn)有的熒光RT-PCR，在52只BVDV陽(yáng)性血清中發(fā)現(xiàn)的359只屠宰豬的血液中，BVDV的量為14.5％。這說(shuō)明福州附近的屠宰豬感染了BVDV，并檢測(cè)到了豬的BVDV。

2.4臨床應(yīng)用

來(lái)自95個(gè)臨床樣本的13個(gè)BVDV陽(yáng)性樣本是RT-PCR，12個(gè)BVDV樣本〔陽(yáng)性率14.1％〕，1個(gè)豬瘟疫苗，F(xiàn)Q-PCR結(jié)果，13個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本和RT-PCR結(jié)果一致。使用語(yǔ)音RT-PCR在豬樣品中檢測(cè)到兩個(gè)新的陽(yáng)性樣品。豬的患病率為16.5％〔14/85〕。BVDV陽(yáng)性樣品與RT-PCR一樣，兩種方法的共識(shí)率為86.7％。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，建立的FQ-PCR方法檢測(cè)臨床豬病和豬瘟疫苗的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，推廣價(jià)值高。

3討論與結(jié)論

由于小病毒性腹瀉病毒〔BVDV〕和BVDV的診斷說(shuō)明，典型豬瘟病毒〔CSFV〕之間的大規(guī)?？乖Y(jié)合是困難的，并且與常規(guī)方法相比，熒光RT-PCR的方法是更先進(jìn)的檢測(cè)方法而且具有明顯的好處。福州市周圍359頭屠宰豬血清樣本結(jié)果說(shuō)明，小型腹瀉病毒OreGOnC24V的標(biāo)準(zhǔn)菌株和熒光RT-PCR檢測(cè)豬BVDV的方法具有良好的特異性和重復(fù)性。發(fā)現(xiàn)13個(gè)BVDV陽(yáng)性樣品的5'-末端-UTR片段的序列分析與VEDEVAC進(jìn)化親密相關(guān)，它們均由現(xiàn)有熒光RT-PCR豬的基因分型顯示。程序BVDV適用于監(jiān)測(cè)豬的BVDV感染，通過(guò)熒光RT-PCR從359個(gè)豬血清樣品中檢測(cè)到52個(gè)BVDV陽(yáng)性樣品，以檢測(cè)豬的BVDV。BVDV感染率略高于福建豬14.5％，樣本陽(yáng)性BVDV感染率為8.1％，福州地區(qū)豬BVDV抗體陽(yáng)性率為34.7％，福州地區(qū)豬和屠宰豬的BVDV感染率為34.7％。王新平〔1996〕首次在中國(guó)報(bào)道了感染BVDV的豬，包括福建、河南、浙江、安徽、湖南、江西、廣西和遼寧省的豬BVDV感染。這種BVDV感染也可能適用于豬群，這可能對(duì)豬造成嚴(yán)重影響。BVDV感染后的豬引起臨床病癥和病理變化，如慢性豬瘟。豬群中的BVDV感染可導(dǎo)致生殖障礙，窩產(chǎn)仔數(shù)減少和遺傳病。仔豬先天性感染不僅會(huì)產(chǎn)生持續(xù)感染和免疫耐受的BVDV抗體，而且還會(huì)產(chǎn)生BVDV對(duì)感染母豬的產(chǎn)后BVDV穿插反響，豬瘟病毒的長(zhǎng)期毒性可以轉(zhuǎn)移。BVDV還會(huì)降低豬瘟疫苗的免疫效果。來(lái)自豬群的BVDV感染難以預(yù)防和控制BVD，BVDV感染發(fā)生在中國(guó)的幾個(gè)豬群中，并引起臨床病癥和病理變化，例如慢性豬瘟，并且會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。因此，它在相關(guān)部門得到高度重視。

參考文獻(xiàn)

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