牧草及飼料作物育種學

牧草及飼料作物育種學實驗指導米福貴云錦鳳內蒙古農(nóng)業(yè)大學2001年5月

目錄TOC\h\z\t"實驗幾,1"實驗一牧草及飼料作物育種田間試驗計劃書的擬定 1實驗二多年生牧草越冬率測定 4實驗三無性系的建立 6實驗四牧草開花習性的觀察方法 8實驗五花粉生活力測定 12實驗六花粉萌發(fā)試驗 16實驗七禾草的有性雜交技術 19實驗八豆科牧草的有性雜交技術 22實驗九飼用玉米自交雜交技術 24實驗十植物根尖細胞壓片法 26實驗十一植物染色體核型分析 33實驗十二植物染色體（Giemsa）分帶技術 40實驗十三培養(yǎng)基母液配制 48實驗十四培養(yǎng)基的配制 53實驗十五花藥（粉）培養(yǎng) 56實驗十六植物莖段培養(yǎng) 58實習十七秋水仙素引變多倍體的技術及其多倍體鑒定的方法 61實驗十八輻射誘變技術 64實驗十九化學誘變技術 67實驗二十品種純度的田間鑒定 71實習二十一苜蓿和禾草的育性鑒定 73實驗二十二禾本科牧草的田間選擇和室內考種 75附錄一實驗室守則 77附錄二玻璃器皿的洗滌 78附錄三器物和溶液的滅菌 79附錄四實驗室中常用酸堿濃度和比重的關系 83附錄五一些常用化合物的溶解度（20℃） 85附錄六化學試劑的分級和保存 86附錄七顯微鏡攝影程序 88附錄八植物組織培養(yǎng)中常用培養(yǎng)基 90附錄九一些常見牧草及飼草料作物的染色體數(shù)目 93附錄十一些常用單位 98主要參考文獻 100實驗一牧草及飼料作物育種田間試驗計劃書的擬定一、實習目的使學生初步學會制定田間試驗計劃書的方法。二、實習說明在進行任何田間試驗之前，要根據(jù)試驗的題目和目的要求、結合本單位的具體條件，擬定出切實可行的試驗計劃書，以便試驗可以按計劃進行。試驗計劃書的內容包括試驗的全部情況和全部過程的說明，即從實驗的題目、目的要求直到田間管理方法，試驗的收獲計產(chǎn)為止的全部過程，要盡可能地寫得具體一些，以便進行試驗時有所遵循。有了實驗計劃，便于對試驗的檢查，可以保證試驗的質量。三、方法步驟根據(jù)試驗的題目和目的要求，按下列格式編寫試驗計劃書。（一）試驗名稱：寫明試驗的課題，如品種比較試驗。（二）試驗目的寫明本試驗要解決什么問題，達到什么效果。如進行牧草品種比較試驗的目的就在于比較評定在當?shù)刈匀缓驮耘鄺l件下，參加試驗的品種中哪些品種的產(chǎn)量高而穩(wěn)定，綜合性狀表現(xiàn)好，符合當?shù)厣a(chǎn)的要求，進而為今后在當?shù)赝茝V這個品種提供可靠的科學依據(jù)。（三）試驗材料與處理：寫明供試材料（如品比試驗便是參試品種）、對照的名稱、代號、材料來源等。（四）試驗地的設計及田間種植圖：說明本試驗采用哪種設計方法，如對比法、隨機區(qū)組法等，并說明小區(qū)面積（長×寬）、行距、株距、走道的寬度、渠道、畦埂、重復次數(shù)，保護行（區(qū)）的設置等，計算出用地總面積，最后繪制一張詳細的田間種植圖，并標明方位，以備應用。（五）試驗地的基本情況及管理措施：寫明試驗地的地勢，土壤類型和肥力、前作，整地日期、整地方法，施用基肥的種類、數(shù)量、質量、施肥方法和要求，種子的準備、播種量、播種方法、間苗、定苗，中耕除草的時間、次數(shù)，病蟲害防治等。（六）田間觀察記載及室內考種項目：根據(jù)試驗的目的要求及牧草種類的不同，以及人力的多少，田間試驗的觀察記載項目也有所不同，關鍵是要抓住試驗的主要項目，突出重點。四、田間設計的注意事項1.試驗地的選擇。（1）試驗地的土壤要有代表性；（2）試驗地段要平坦；（3）試驗地肥力要均勻；（4）試驗位置要恰當。2.試驗地的田間規(guī)劃：（1）確定小區(qū)面積小區(qū)面積通常為2×5m2或4×5m2，依下列條件而定：試驗的性質和要求；試驗品種的多少和每個品種的種子量；試驗可利用土地面積的大小；重復次數(shù)的多少。（2）確定重復次數(shù)重復次數(shù)常為3次或4次，依下列條件而定：試驗要求的準確程度：每個品種的種子量；土壤肥力的差異程度。（3）試驗地內保護行及人行道的設置。一般不少于1m，重復與重復之間要設人行道、小區(qū)之間要有畦背。（4）試驗地面積的計算：試驗地總面積=重復次數(shù)×重復內的小區(qū)數(shù)×每小區(qū)面積+人行道和保護行的面積。同時要求計算出整個試驗面積的總長度和總寬度，以便田間區(qū)劃。（5）各個重復試驗區(qū)及重復內各小區(qū)的排列：各重復試驗區(qū)的排列決定于試驗地的形狀、如系長方形則每一重復試驗區(qū)排列在同一條地段上；如果土壤肥力不均勻，在排列時重復的方向應與土壤肥力的差異成垂直。五、作業(yè)每個學生擬定一份完整的品種比較試驗計劃書（包括計劃的田間種植圖）。

實驗二多年生牧草越冬率測定一、目的和說明多年生牧草能否在我國北方冬春氣候嚴寒地區(qū)安全越冬，是關系到它能否在這里生存及在生產(chǎn)中利用的首要問題。多年生牧草越冬率測定多運用于外地引入品種，特別是從溫暖地區(qū)引入寒冷地區(qū)的品種，以及一些耐寒性差的品種。越冬率測定是引種及抗寒育種鑒定的重要項目之一。本試驗的目的，在于了解多年生牧草越冬性的含義及進行越冬率測定的必要性，熟悉越冬率測定的一般方法。如在牧草育種中，區(qū)別多年生牧草不同種或品種的越冬性強弱，為選出抗寒性強，越冬良好的原始材料和育成品種提供依據(jù)。這里需要說明一下，越冬性是指牧草在冬春季節(jié)對外界綜合的不良條件的抵抗性；抗寒性是指牧草對低溫的低抗能力。因此，越冬性和抗寒性不能混為一談。也就是說，抗寒性好的，越冬性不一定好；而越冬不良的，也未必全是受低溫的影響。因為牧草越冬不良的原因很多，除低溫對植物發(fā)生危害以外，如冬季土壤干旱；長期復雪，或冬季淹水，或融雪化冰造成土壤缺氧；冬季病害以及早春地表晝消夜凍造成的機械損傷等都會引起植物死亡。因此，我們在分析越冬不良的原因時，應全面加以考慮，具體分析。一般說來，嚴寒是決定植物能否越冬的主要因素。但不是唯一因素。二、材料和用具鑒定材料為紫花苜蓿（或紅豆草等）的原始材料圃。用具：有米尺、鉛筆、記載本、小鍬等。三、方法和步驟在氣候溫暖、濕潤的地區(qū)，越冬率的測定要分兩次進行，頭一年入冬前要固定樣方或樣點、查明株數(shù)，入冬土壤結凍前，選擇當年播種或上年播種的大田或試驗小區(qū)，各選擇確定若干個50×50cm的樣方，四角釘以木椿，作好標記，查明株數(shù)。如系條播的可分別選擇若干樣點。每點行長1m2行，每行查明株數(shù)，每樣點釘上木椿，作好標記。供測定的樣方或樣點，如當年刈割時，留差高度均不低于10cm。次年春天當土壤解凍，牧草開始返青前后，即可到田間檢查返青植株數(shù)。在內蒙古西北地區(qū)由于氣候干燥，溫度低、死亡的植株未腐爛掉，因而返青二周內做一次調查即可。春季測定是在田間直接檢查，選1m長、二行的樣段3—5個，在選好的樣方或樣段上，用鐵鍬、小鏟取掉植株周圍的土，露出根頸部，并使各植株之間彼此分離而便于計數(shù)。越冬率的計算方法為：越冬率=返青植株數(shù)/植株總數(shù)×100%例如在樣點上原有植株150株，返青后調查只有120株，其越冬率為80%。入冬前未確定樣方的，也可以在春季返青時隨機地抽取樣方，檢查存活植株數(shù)和死亡植株數(shù)，兩者之和為植株總數(shù)，然后計算越冬率。統(tǒng)計時將那些長出綠葉、新芽或幼芽突起，以及雖然沒有幼芽萌發(fā)，但根頸部顏色正常，沒有枯黃變色，根變細嫩光滑的歸于存活植株一類中去。將根頸腐爛發(fā)黑，沒有新芽發(fā)生的歸于死亡植株。春季測定法因為簡便易行，所以在越冬率測定中最為常用。進行本實習時，必須密切注意當?shù)囟杭竟?jié)的氣象記載。四、作業(yè)將本組越冬率測定的結果寫成報告。

實驗三無性系的建立一、目的無性系建立是多年生豆科牧草育種很重要的技術工作。它對培育自交系，自交系結合力的測定、優(yōu)良個體的擴大繁殖和配制雜種種子等方面的工作，都是不可缺少的。二、材料以苜蓿為代表建立無性系。用枝條來擴大個體數(shù)量。這個方法對大多數(shù)豆科牧草都是適用的。三、用具剪刀、米尺、燒杯或塑料薄膜，8號鉛絲、記錄本、整地工具、水桶、噴壺。四、方法及步驟苜蓿的根、莖、葉均可進行無性繁殖，其中以莖段扦插建立無性繁殖系最為便利，原因在于：莖的數(shù)量較多，可以同時扦插很多單株而不損傷母株。扦插又不需要過高的設備條件，大田條件下就可以進行；苜蓿根莖分株繁殖，雖然也不需要很高的條件，但是分根的數(shù)量有限，而且母株只能利用一次；葉片繁殖需要較高的條件、而葉繁殖幼苗生長速度亦不如莖條扦插?，F(xiàn)以苜蓿莖條扦插為例，具體介紹無性系建植的方法與步驟。開花以后扦插，成活率逐漸降低。從植株生長發(fā)育狀況來看，春季返青后株高達30cm左右的枝條即可扦插。苜蓿扦插的最適宜時期是孕蕾前期。這時扦插成活率很高，而且能繁殖較多的數(shù)量。內蒙古自治區(qū)呼和浩特地區(qū)是在5月上旬，這個時期扦插當年還可以收到種子。扦插苗床在扦插前要施足基肥。根據(jù)扦插目的的不同，可以采取不同間隔距離。每個苗床面積，20×20cm足夠。苗床應低于地面4cm以便澆水。扦插前應先灌足水分。由母株基部剪取的枝條，需要修整后再扦插。每個插條要求在其頂端保留一個葉節(jié)。扦插條的長度不限，視品種的節(jié)間長度而定。因此每個枝條應在葉節(jié)的上部靠近節(jié)的地方來剪取。剪掉小葉保留托葉內的腋芽。一般一個插條約為5cm長，個別長的可達10cm。短的2—3cm都可以成活。這樣剪法，一株母株可繁殖50株左右。將準備好的插條，插入土中，每苗床2—4株，株距2—5cm，葉節(jié)留在齊地面處，插好后再灌少量水，以使與土接觸緊密便于吸水。如在4月底到5月初扦插，每個苗床扦插后應隨即蓋上塑料薄膜以保持濕度。如在5月到6月初扦插不需覆蓋塑料薄膜，如果覆蓋反而會引起幼苗死亡。插后的管理，每天給苗床澆水一次，保持其濕度。在生長季節(jié)中光和溫度勿須特殊調節(jié)，自然狀態(tài)可滿足插條幼苗生長的需要。扦插四周后，莖條開始生根，地上部分可達10—15cm，植株開始獨立生活。五、作業(yè)每人扦插20個插條，扦插后注意灌水。一周后調查扦插存活率，寫出實驗報告。

實驗四牧草開花習性的觀察方法一、觀察牧草開花習性的意義觀察牧草開花習性主要是了解牧草的開花時間、開花動態(tài)及其授粉類型，為雜交育種及一些牧草的人工輔助授粉提供依據(jù)。二、實驗材料和設備田間記錄本、放大鏡、鑷子、小剪刀、干濕球溫度計、標簽、鉛筆、量角器。三、開花習性觀察時需注意的幾個問題1.選好樣地：樣地要有典型性，密度適宜，生長發(fā)育良好。一般在2×5m2的試驗小區(qū)內選擇10個花序為宜，掛好標簽，寫明日期。2.開花標準問題：（1）豆科牧草開花標準：以旗瓣向外開展，尤骨瓣露出翼瓣之間為準。（2）禾本科牧草開花標準：外稃向外開張一定角度，柱頭露出、花藥下垂為準。3.觀察開花習性的時期問題：一年生牧草可于播種當年進行觀察，對于多年生栽培牧草以生活第二年觀察為宜。因為這個時期牧草生長旺盛、枝葉繁茂，開花最為正常。4.氣候條件對牧草開花有一定影響。在進行開花習性觀察時，應進行溫度和相對濕度的觀察，同時也要記載觀察期間的天氣狀況，如風、雨或陰天等，以便作為開花習性綜合分析時的參考。四、開花習性觀察的內容和方法（以禾本科牧草為例）：1.開花期、開花持續(xù)期的觀察方法在栽培小區(qū)上，分布均勻地在全小區(qū)范圍內選擇孕穗及抽穗（豆科牧草：孕蕾或現(xiàn)蕾）的花序100個，掛牌標記，逐日記載已開花的花序數(shù)及其日期，直到全部掛牌的花序開花為止。觀察完畢后，通過開花的起始和結束時間，得出開花的延續(xù)期；同時統(tǒng)計每日開花的花序數(shù)占觀察總數(shù)的%，并以曲線圖示，以了解草群群體的開花動態(tài)及開花的整齊度。2.開花順序的觀察方法：牧草開花是按一定規(guī)律進行的。一個穗子上的小花或自下而上，或自上而下開放，或是從中部小花開始向上、下部小花開放，其時間早晚是不同的，因而也影響了種子成熟的一致性及泡滿度。觀察開花順序時一般采用圖式法，即在抽穗期選取所觀察牧草的10個花穗，掛牌標記。各張紙上繪上每一穗的開花圖式（如圖1）。圖中自下而上以1、2、3、……19代表花序的各個小穗數(shù)，小圓圈代表小穗上的小花。每小穗基部近穗軸的小花是小穗的第一朵花，接著是第二朵花、第三朵花……?？紤]到牧草白天、夜間均有開花的可能，因此，從零點至二十四點內，每隔二小時觀察一次，并在圖式上注明已開的花及日期。為清楚起見，可仿照圖式把同一天開放的花用線連接起來。開花全部結束后，確定每個花序和花序上小穗的開放順序及開花時間的長短。圖1牧草開花順序示意圖3.一穗開花動態(tài)的觀察方法在草群中分布均勻地選取10個花序，掛牌標記，逐日按時分別觀察記載其已開花的小花數(shù)，記載完畢后，要用剪刀剪去已開放的小花的雄蕊，直至10個花序開花完畢，統(tǒng)計10個花序在開花期內的開花總數(shù)，并計算出逐日開花數(shù)。4.一日開花動態(tài)的觀察方法在試驗小區(qū)上均勻分布地選取10個花序，掛牌標記，從草群大部已進入開花時，連續(xù)三日自早至晚，每間隔1小時，統(tǒng)計各穗已開花的小花數(shù)及10穗總和。觀察完畢后，隨即用剪刀剪除已開放小花的雄蕊，并記載該時間的氣溫及相對溫度。三日后，統(tǒng)計在三日不同時間內的開花總數(shù)，計算出其百分比，并繪圖表示，了解一日開花起訖時間及大量開花時間與天氣狀況的關系。5.小花開放情況的觀察方法在一日內的開花高峰時期，選取5—10朵未開，但即將就要開放的小花（在陽光下外稃略呈透明狀、隱約可見花藥），掛牌標記。此后對每一小花的開放進行持續(xù)觀察，了解其由內外稃開始開張，到花藥下垂散出藥粉，直至內外稃完全閉合全過程的開放情況，并分別記錄下由內外稃開始張開到雄蕊露出、花藥下垂、散粉、內外稃開始閉合、內外稃完全閉合等各開花過程所需的時間（以分鐘計），以及各過程中內外稃開張的角度。6.授粉特點及結實率的觀察：在植株群體大量抽穗后但尚未進入開花期時，從中均勻地選取100個花序，用羊皮紙（或硫酸紙）紙袋套袋隔離，使其自花授粉，其余末套袋的花序作為自由授粉處理。待全部植株開花完畢后，取下紙袋，掛牌標記。種子成熟后，將套袋的花序取下，并取同等數(shù)量的自由授粉花序，分別統(tǒng)計上述二種花序一穗或總穗數(shù)的小花數(shù)，然后分別脫粒，統(tǒng)計出結實種子數(shù)，得出該種牧草自交和異交結實率。五、作業(yè)每一學生要寫出一篇供試牧草開花飛性的觀察報告。

實驗五花粉生活力測定一、實驗目的學習并掌握測定植物花粉生活力的技術和方法。二、實驗材料主要牧草及飼料作物（如紫花苜蓿、紅豆草、老芒麥、冰草、玉米、燕麥等）的新鮮、花粉、陳花粉及其相應植株。三、實驗用具、藥品顯微鏡、解剖針、攝子、棕色滴瓶，吸水紙、凹片，載玻片、蓋玻片；碘-碘化鉀、醋酸洋紅、聯(lián)苯氨一甲奈酚（1，2，3，4號），氯化三苯基四氮唑。四、說明花粉生活力的強弱是植物有性雜交能否成功的重要影響因素，而花粉缺失活力又是花粉敗育型雄性不育系的主要特征。故此，花粉生活力測定是進行有性雜交育種和雄性不育系鑒定必不可少的工作。測定花粉生活力的方法較多，有直接法（檢查人工授粉結實率）、培養(yǎng)基發(fā)芽法、花粉鑒定法以及化學試劑染色法等。本試驗著重練習如下三種方法。五、方法與步驟（一）形態(tài)觀察法每組取2個凹片分別選取兩種供試材料的新、陳花粉，滴入半滴蒸餾水，調勻，在低倍鏡下檢查花粉形態(tài)。凡內含物充實飽滿者為正常、具活力的花粉，而那些瘦小、畸形或內含物較少的花粉粒則為無活力型。觀察時取若干個視野，總共統(tǒng)計200?；ǚ鄣幕盍η闆r，并繪制每種植物正常具活力的花粉粒圖。具體的觀察結果可依下表所給格式記載并統(tǒng)計。表1花粉形態(tài)觀察結果統(tǒng)計表供試植物花粉種類充實飽滿數(shù)畸形瘦小數(shù)具活力花粉的%新鮮陳新鮮陳（二）化學試劑染色法1.碘-碘化鉀染色法每組取2個凹片，分別選取兩種植物的新、陳花粉，放入凹槽內，滴入一滴1%的碘-碘化鉀溶液，蓋上蓋玻片染色。20分鐘后用低倍顯微鏡檢查著色情況。凡著色者為有生命力花粉粒，著色淺或不著色者則無生活力。觀察時分別取若干視野統(tǒng)計200粒左右花粉的著色情況。2.醋酸洋紅染色法染色、觀察及統(tǒng)計方法與1法相同，但染色時間應以3—4分鐘為宜。3.聯(lián)苯胺—甲萘酚染色法（Wapgakof法）按上述方法取一種植物的新、陳花粉置于載玻片上，加入聯(lián)苯胺-甲萘酚①②③的混合液及④溶液各一滴，調勻，蓋上蓋玻片，經(jīng)3—4分鐘檢驗，凡有活力的花粉，其過氧化氫酶具活性，使氧活化成為活性氧，該活性氧使該試劑染色。故此具生活力的花粉被染成紅色，而無活力的花粉則著色很淺或幾乎不著色。觀察結果也依前述方法進行統(tǒng)計。4.紅四氮唑（TTC）染色法染色方法同3，只是在染色后置于35—40℃下15—20分鐘，統(tǒng)計方法同上。上述四種方法的觀察結果，可依下表給定格式記載并統(tǒng)計表2化學染色法測定花粉生活力統(tǒng)計表供試植物花粉種類碘—碘化鉀醋酸洋紅聯(lián)苯胺—甲萘酚TTC著色數(shù)不著色著色%著色數(shù)不著色著色%著色數(shù)不著色著色%著色數(shù)不著色著色%新陳新陳（三）直接法（人工授粉結實率檢查法）在田間，每人選5個禾本科牧草的花穗，開花前一天整穗，每穗選留下5—10朵小花，并去雄套袋；第二天分別用新鮮花粉，放置2小時、4小時和6小時的陳花粉授粉及套袋。結實期時通過觀察結實率，以測定各類花粉的生活力，結果填入下表。表3禾本科牧草（冰草或披堿草）花粉田間檢驗統(tǒng)計表花粉種類結實情況授粉穗數(shù)授粉小花數(shù)結實數(shù)結實率（%）新鮮花粉放置2小時放置4小時放置6小時作業(yè)：1．完成上述試驗統(tǒng)計表2．繪制兩種牧草正常有活力的花粉形態(tài)圖附：試劑配制1.1%碘—碘化鉀溶液KI溶于少量蒸餾水中，再加1g碘片，定溶至100ml，貯于棕色瓶中。2.醋酸洋紅（同染色體鏡檢所用試劑）3.聯(lián)苯胺—甲萘酚①0.2g聯(lián)苯胺溶解在100ml50%酒精中；②0.15g甲萘酚溶解在100ml50%灑精中；③0.25g碳酸鈉溶解在100ml50%灑精中；④實驗前配制3%過氧化氫溶液。第①②③各液，于使用前等量混合并存于棕色滴瓶中4.0.5%氯化三苯基四氮唑先稱取0.832gNa2HPO4·2H2O和0.27gKH2PO4溶于100ml蒸餾水中，配成PH7.17的磷酸鹽緩沖液，再稱取0.05g氯化三苯基四氮唑溶于新配成的10ml磷酸鹽緩沖液中，存于棕色瓶中。

實驗六花粉萌發(fā)試驗一、目的和意義在牧草雜交育種工作中，特別是在遠緣雜交中，往往會發(fā)生由于雌雄器官在形態(tài)構造上的不同以及兩性細胞在生物學上的極不適應，而造成花粉不能在異種植物柱頭上萌發(fā)；或花粉管生長受阻，不能伸入胚囊到達胚珠；或花粉管到達胚囊，但不能正常受精；或胚胎不能正發(fā)育等等。由于這些原因，品種間或種間雜交常難以成功。因此，了解牧草的開花可性，授粉機制以及胚胎發(fā)育狀況，是進行雜交試驗的基礎性工作。本試驗的目的，在于通過花粉鏡檢，了解花粉的活力以及花粉在柱頭上的萌發(fā)情況，為雜交育種提供細胞學依據(jù)，使學生掌握進行該類試驗的基本方法和操作技能。二、材料、用具和藥品苜蓿不同的種和品種。顯微鏡、解剖鏡、鑷子、骨勺、解剖針、雙面刀片、載玻片、培養(yǎng)皿、小燒杯、小瓶、隔離紙袋、標簽、吸水紙、水溶性苯胺蘭乳酸、苯酸、酒精（95%、70%）、冰醋酸、蔗糖、瓊脂、蒸餾水等。三、方法和步驟（一）實驗前的準備：應預先配制如下溶液。1.卡諾固定液（無水酒精：冰醋酸=3：1）2.培養(yǎng)基：蔗糖10克，0.1%硼酸數(shù)滴，加水至100毫升，再加1克瓊脂，加熱熔融，分裝在培養(yǎng)皿中。3.乳酸—棉蘭染色劑：乳酸、苯酚、甘油、水等量混合在以上溶液中溶解0.1%的棉蘭。（二）操作方法和步驟1.授粉：在牧草開花期選擇健壯無病的植株，用鑷子夾掉花序下部已開放的小花和上部發(fā)育不全的小花，只保留旗瓣已張開，而龍骨瓣未張開，花藥尚未彈出的幾朵小花。用牛角勺按一下父本小花的龍骨瓣基部，花絲管下彎，花藥彈出，在匙上留下小堆花粉。用同樣的方法接觸母體小花，使其柱頭接觸匙上的花粉，授粉即已完成。然后套袋隔離，在標簽上寫明授粉的確切時間。2.取材固定授粉后頭一小時內，每隔10分鐘取樣；從第二小時起，每隔一小時取樣，用攝子將已授粉小花的花萼、花冠去掉，放入小瓶內用卡諾氏溶液固定0.5—24小時，再移至70%酒精中保存。實習時為方便起見，也可將已授粉的小花剪下，放入糖濃度為10%的固定培養(yǎng)基上，隨時取下柱頭進行觀察，也可將已授粉的小花置于空的培養(yǎng)皿中，皿內滴幾滴水，蓋上蓋子以防柱頭干枯。然后每隔一定時間取材觀察。3.染色制片采用乳酸棉蘭染色法。先將小花置于載玻片上，去掉花萼、花冠。左手用鑷子壓住基部花托，右手用尖的解剖針輕輕劃破花絲管，并將子房和花托剝離，用鑷子輕輕取出雌蕊，去掉花絲管。將雌蕊放在載玻片中央，滴一滴乳酸—棉蘭染色液，靜置5—20分鐘。然后蓋上蓋玻上，上附吸水紙用手輕輕往下壓，使柱頭、花柱和子房展平，用吸水紙吸去多余染液。4.鏡檢：將做好的片子放在低倍鏡下進行觀察，可以看到：柱頭、花柱及敗育花粉幾乎透明，而有生活力的花粉及花粉管被染成天蘭色。注意觀察花粉粒、柱頭和胚珠的形態(tài)特征，并與未經(jīng)染色的作比較。觀察的同時按表1的要求統(tǒng)計出授粉后各時間段內花粉的萌發(fā)率及花粉管萌發(fā)及伸長情況，并闡明花粉在柱頭上萌發(fā)的最初時間。感興趣時，同學們也可統(tǒng)計雌蕊子房中的胚株數(shù)目（統(tǒng)計10個材料，取平均數(shù)）。如欲制成永久制片，可將臨時壓片反轉后置于盛35%酒精的玻璃器皿中，脫下蓋玻片，將材料置于載玻片上，依次滴上50%、70%、95%、100%酒精脫水，每次3—5分鐘，用吸水紙吸干殘液后再進入下一步聚。然后依上法用1/2的純酒精，1/2二甲苯脫水透明，加拿大樹膠封片即成。表1××牧草花粉的萌發(fā)情況花粉萌發(fā)授粉后時間柱頭數(shù)花粉粒數(shù)檢查數(shù)發(fā)芽數(shù)總數(shù)%花粉管伸入花柱數(shù)目%1小時10″20″30″40″50″60″2小時3小時作業(yè)：完成上述完整試驗操作，將觀察數(shù)據(jù)填入表1。

實驗七禾草的有性雜交技術一、目的熟悉禾草的有性雜交技術，以便在育種工作中應用。二、材料和設備數(shù)個不同的冰草品種，小剪子、鑷子、隔離紙袋、標簽、毛筆、鉛筆等。三、方法和步驟（一）冰草的花器構造及開花習性冰草為較緊密的穗狀花序，兩側壓扁。每小穗具3—11小花，小花具內稃和外稃，之間有雄蕊3枚，雌蕊1枚，柱頭呈羽毛狀?；ㄋ庉^大，約4mm左右。冰草屬異花授粉植物，自交不育。其穗狀花序的開花順序，就一穗而言，先從上部的小花開起，逐漸向上、下開放，基部小花最后開放。而小穗的開放順序則是從基部小花開起直到頂花。冰草在一天內的開花時間是從上午11時持續(xù)到下午6時，大量的開花時間是下午2—5時。（二）有性雜交方法：1.不去雄雜交法（1）互為父母本法將父母本相鄰種植，開花前將父母本花穗用隔離紙袋套在一起，花期抖動紙袋數(shù)次，以促進散粉，這樣可得到二個雜交組合（即互為父母本）的種子。（2）采集父本穗授粉法如果擬雜交的父母本沒有相鄰種植，在田間有一定距離時，可采用此法。在開花前用隔離紙袋將母本穗（約3—5個）套上，并把它固定在竹桿或其他支撐物上，以防倒伏和折斷；當父本穗小花開放時，剪下父本穗子（3—5個），與隔離袋中的母本穗放在一起，使其為母本穗授粉。然后將紙袋封好，以防其他品種的花粉混入。如有必要，可連續(xù)二次授粉。用不去雄授粉法搞雜交，手續(xù)簡便，對母本柱頭的損傷小，雜交結實率高，是異花授粉植物雜交中較常用的方法。2.去雄雜交法冰草雖是異花授粉植物，但其自交結實率有時會高達7%，為嚴格起見，需采用去雄雜交方法，其操作步驟如下。（1）整穗：在母本行內選擇具有代表性生長健狀的植株，當其穗部抽出劍葉3cm左右時，透過外稃可以看到花藥呈黃色，此時便可進行整穗。也可選擇個別小花已開放的穗子，剪去發(fā)育不良和已開花的小穗，每穗只在中上部留下5—10個小穗，每個小穗留下基部2個左右小花。當小穗過于緊密有礙授粉時，可以間隔去小穗。（2）去雄：整好穗后，立即進行去雄。去雄時用左手大姆指和食指輕輕捏住小花基部，右手輕輕用鑷子把內外稃撥開，小心地把三個雄蕊去掉，注意不要挾破花藥，更不要用力過大損傷內外稃和雄蕊。去雄后，讓小花恢復原狀，再去下一個小花。去雄完畢后，套上隔離袋（袋子大小為6×12cm），并掛上標簽，寫上父母本的各稱和去雄者以備雜交。（3）采集花粉花粉采集應在開花盛期到來之前進行。在父本行內選擇典型的，生長健狀的植株，采集其花藥未破裂的成熟花粉，此時花藥呈黃色。采集足夠數(shù)量后，把花藥破碎，再進行授粉，切勿采集綠色花藥，否則雜交不易成功。（4）授粉在母本去雄后的第二天下午2—5時，進行采花粉和授粉為宜，此時為一日內的開花高峰期。授粉時先把母本隔離袋取下，用毛筆沾少量的花粉置于母本羽狀柱頭上，并輕輕地擦動。待全部小花授粉完畢，再用隔離袋將母本穗套起來，以防其他花粉進入。最后在標簽上注明授粉日期。隔離袋可以一直不取，直到成熟時按組合分別收獲為止。標簽的設計方法及記載項目可參考下面格式：組合組合♀×♂____________________去雄方法__________________去雄日期__________________雜交者__________________四、作業(yè)每人雜交2—5穗，收獲時統(tǒng)計雜交結實率。

實驗八豆科牧草的有性雜交技術一、目的熟悉豆科牧草的有性雜交技術，以便將來在育種工作中能加以運用。二、材料和設備黃花苜蓿（或雜花苜蓿），紫花苜蓿、小剪刀、骨勺、鑷子、標簽、棉花、放大鏡、75%酒精、鉛筆（自備）。三、方法和步驟（一）苜蓿的花器構造和開花習性苜蓿為總狀花序，蝶形、兩性花、有旗瓣一枚、翼瓣二枚、龍骨瓣二枚，雌蕊一個，雄蕊10個、呈九合一離，九個雄蕊聚合成雄蕊管。苜蓿為無限花序，全株開花的順序是自下而上，自內而外。在一個總狀花序上開花的順序也是自下而上。一天中，5—17點鐘均有開花，但開花最盛時期是在午前9—12點鐘，小花的開放時間可持續(xù)2—3天，苜蓿為蟲媒花，自花授粉是高度不孕的。（二）有性雜交的技術：選取位于主莖上的花序用作雜交。在準備雜交時，用剪刀剪去花序下部開放的全部小花和上部發(fā)育不全的花蕾，只留下花冠比萼長一倍，而花藥的形態(tài)呈球狀一團的小花備去雄之用。去雄時用鑷子去掉花藥。即用鑷子把遮蓋著龍骨瓣的旗瓣和翼瓣向一旁折轉，用尖銳的鑷子沿著龍骨瓣切開，并輕輕地將其向旁邊折轉，即可見到雄蕊，然后小心地用鑷子夾去花藥。雜交最好在晴朗無云的上午進行，6—9時去雄，10—12時授粉。去雄還可以采用酒精浸漬法，該方法如下：準備60毫升95%的灑精和40毫升水，將酒精與水混合。選旗瓣與翼瓣已經(jīng)張開但龍骨瓣未張開、雄蕊管尚未彈出的花朵進行雜交：修剪去其他不符合標準的花朵。將準備去雄的總狀花序浸入灑精與水的混合液中5秒鐘，取出后立即用水沖洗，30分鐘后即可授粉。此法幾乎可以達到完全去雄的效果。授粉時從父本植株上選擇尚未開放的、發(fā)育良好的花序。為了獲得花粉，用不銳利的骨勺或木制小匙伸到父本的花中，在小勺壓迫龍骨瓣基部的情況下，花便開放，雄蕊和雌蕊有力的彈出，把一堆花粉留在小匙上。對母本小花也實施同樣的操作，使雌蕊柱頭剛好碰到從父本上取來的那堆花粉。去雄和授粉后用棉花或紗布裹起母本花序，并掛上標簽。苜蓿自花授粉高度不孕，很容易與他花授粉（柱頭具有選擇性）。因此在育種實踐上多數(shù)采用不去雄雜交法，即母本不去雄，直接授以父本的花粉。應用這種雜交方法時，母本的花朵應該選擇旗瓣與翼瓣已經(jīng)張開，但龍骨瓣未張開，雄蕊管未彈出的花朵進行雜交；父本也采用同樣的花朵用骨勺采集花粉。授粉完畢后立即用棉花包裹起花序，并掛上標簽。四、作業(yè)每人雜交6個花序，其中不去雄雜交法4個，鑷子去雄1個，酒精去雄法1個。待種子成熟后收獲雜交種子并統(tǒng)計雜交結實率。

實驗九飼用玉米自交雜交技術一、目的掌握玉米自交、雜交技術。二、材料及用具玉米的自交系、玉米普通品種、羊皮紙袋（40×20cm），硫酸紙袋（20×25cm×10cm），曲別針、線繩、小刀、小剪刀、紙牌、75%酒精、棉球、鉛筆。三、實習說明玉米是雌雄同株異花的作物，雄花生長在株頂，雌花生長于莖桿中部。一般雄花先開，天然異交率95%左右，玉米雄穗由主軸和側枝組成，可產(chǎn)生大量花粉，花粉靠風力傳播，一般傳播距離為2—3m，遠的可達500m以處。玉米抽雄后2—5天開始散粉，每日開花時間以上午9—11時開花最盛，一株雄穗可連續(xù)開花7—8天。在一般田間條件下花粉的生活力可維持5—6小時。在溫度為5—10℃，相對濕度為50—80%的條件下，生活力可維持24小時以上。雌穗為肉穗狀花序，由腋芽發(fā)育而成。穗外被有苞葉，中部為穗軸，成對雌小穗著生于穗軸上。每個雌小穗有兩朵小花，其中一朵退化，另一朵小花結實，形成并排的籽實兩粒，故果穗上的籽粒行數(shù)為偶數(shù)。雌小花由內外穎和雌蕊組成。雌蕊有一處圓形子房，頂端著生有茸毛的絲狀花柱（花絲），能分泌粘液粘著花粉，花絲各部均有受粉能力，愛精后花絲枯萎，子房發(fā)育成種子（果實），花絲伸出苞葉為開花，花絲受粉能力可維持10—13天，但以抽出后的2—6天內受粉最好。雌穗一般在雄穗散粉后2—4天抽絲。四、自交和雜交方法1.雌穗套袋：選群體中優(yōu)良單株5—10株，當雌穗尚未抽絲時，用硫酸紙袋套上，再用曲別針將袋口夾住或用線繩系于莖桿上。2.雄穗套袋：根據(jù)不同的要求套采粉的雄穗。若是自交，應套在本株的雄穗上；若是雜交，則套在父本株上。套袋時，用羊皮紙袋將雄穗全部套住，將袋口合擾并用別針夾緊，在袋上注明套袋日期。3.人工授粉：雄穗套袋36小時后，附著在雄穗上的外來花粉全部死亡，即可授粉。授粉分采粉和授粉兩個步驟，采粉時將雄穗稍稍彎下用手指輕彈紙袋，使花粉落在袋內，然后取下，緊閉袋口。授粉前，取下雌穗上的袋檢查，如果花絲過長，用剪刀剪去一部分，立即用收集的花粉授粉，授粉完畢，雌穗仍套上紙袋，掛上紙牌，寫明組合名稱，授粉方式（自交或雜交），授粉日期和授粉者姓名。五、作業(yè)按上述方法步驟做自交、雜交各兩個果穗，成熟時分別收獲，統(tǒng)計結實率。

實驗十植物根尖細胞壓片法一、實驗目的植物根尖細胞壓片法，是一種快速簡易制片法（與石蠟切片相比）。根尖分生組織取材方便，易于識別，若用種于萌發(fā)直接取根樣又不受季節(jié)影響，其優(yōu)點為其它材料所不及，因而在觀察、鑒定植物染色體時為人們所常用，成為染色體計數(shù)、核型分析、分帶研究的重要手段。本實驗要求學生熟悉并掌握植物根尖細胞的固定、染色、制片方法以及鏡檢技術。二、實驗材料蒙古冰草（2n=14）、紫花苜蓿（2n=32）三、實驗器具、藥品器具：溫箱、冰箱、顯微鏡、培養(yǎng)皿、解剖針、解剖刀、鑷子、酒精燈、載玻片、蓋玻片、青霉素小瓶、濾紙、鉛筆等。藥品：70%酒精，95%酒精、冰醋酸、45%冰醋酸、1N鹽酸、濃鹽酸、卡諾固定液、0.002M8—羥基喹啉、對二氯苯-α溴萘混合液、醋酸洋紅、醋酸地衣紅、石碳酸品紅、鐵礬蘇木精。（配制方法見本實驗附錄）四、實驗步驟及說明（一）材料培養(yǎng)將試驗用材料的種子清洗干凈，用溫水浸泡使其充分吸脹，然后將吸脹種子澇出，置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，放在溫箱中（約25℃）使其萌發(fā)（每天用溫水洗滌1—2次）。待幼根長到1cm左右時，剪取根尖，進行預處理。（二）預處理目的使染色體縮短，利于染色體分散；同時可累積比較多的細胞處于有絲分裂中期的分裂相。方法：從蒙古冰草或紫花苜蓿的幼根上剪下長度約為0.5mm的根尖，放入盛0.002M8—羥基喹啉（或對二氯苯-α-溴萘混合液）的青霉素小瓶中，室溫下處理3—4小時。說明：觀察染色體數(shù)目，首先需掌握細胞的分裂時間。一日之內，分生細胞的分裂頗有規(guī)律，上午、下午及夜間各有一細胞分裂高峰期，細胞分裂最多；作為染色體數(shù)目觀察的細胞最適期是在有絲分裂中期，此時染色體縮到最短，且集中到赤道板上呈一平面排列。因此，只有在細胞分裂的最適時期取樣并預處理，方能獲得滿意的結果。蒙古冰草及紫花苜蓿的取樣時間均以上午9時左右為最好。（三）固定目的利用化學藥品將活細胞迅速殺死，使核蛋白變性或沉淀，以保持染色體固有的形態(tài)和結構。方法：倒掉預處理液，水洗1—2次，而后將根尖放入卡諾固定液中（固定液要現(xiàn)用現(xiàn)配），固定2—24小時。材料小者易短，大者易長。說明：經(jīng)固定的材料，若不及時壓片，可轉到70％的酒精中置0—4℃冰箱中長期保存?zhèn)溆谩＃ㄋ模┙怆x目的將細胞壁之間的果膠層用酸水解，使細胞易于分散，細胞壁軟化，便于壓片。方法：將固定材料放入50%酒精中浸泡3分鐘，而后用蒸餾水沖洗并吸干，轉入1NHCl（60℃）中，解離20—30分鐘。解離后的材料需用1N冷鹽酸浸泡2—3分鐘，再用蒸餾水沖洗2—3次。說明：解離的時間需嚴格掌握，過短細胞不易分離；過長又會使細胞變長，影響染色。適宜的解離時間，因材料而異。（五）染色、壓片（1）醋酸洋紅、醋酸地衣紅、石碳酸品紅染色壓片法用解剖刀或雙面刀片從根尖處切下極小的一段（0.5mm左右），置于載玻片上，滴一滴染色液，然后加蓋玻片。染色約5分鐘后，取一濾紙，覆在蓋玻片上，在不移動蓋玻片的情況下，左手固定濾紙，右手拇指垂直向蓋片加壓，使根端部組織分散攤開，呈一薄層，以待鏡檢。如染色淺，可沿著蓋片滴加染液，待滲入后微烤，可使染色體加深著色；如染色較深，可沿蓋片一側滴加45%的醋酸，另一側用濾紙吸染液并微烤，（2）鐵礬—蘇木精染色壓片法解離并經(jīng)水洗后的根尖材料，用4%的鐵礬水溶液媒染60分鐘或更長時間，水洗數(shù)次，再用0.5%蘇木精染色液染色（約60分鐘），水洗10分鐘后分色軟化（45%醋酸10—20分鐘，1%氨水1分鐘），然后取根端黑色部分置于載玻片上，切碎或搗亂，滴加45%醋酸數(shù)滴，壓片。用此法染色，媒染一定要充分，媒染后水洗要徹底，分色軟化要適宜，最終使染色體呈蘭黑色，細胞質為淡蘭色或近無色。（六）鏡檢將制好的臨時壓片置于顯微鏡目鏡下觀察，先用低倍鏡找出較為理想的視野及典型的分裂相，再選用高倍鏡詳細觀察描述并計數(shù)。一旦發(fā)現(xiàn)理想的分裂相，有時還需作標記。其方法是將標記細胞放在低倍鏡視野中央，然后用一張與載玻片大小相仿的濾紙中心剪一洞，將濾紙小洞置于低倍物鏡下光路通過的位置，此位置便是欲標記細胞在玻片上的所在位置，這時將濾紙與玻片壓緊從鏡臺上取下來，用防水繪圖筆在載玻片反面正對濾紙小洞處劃一圓圈，然后去掉濾紙再在蓋玻片上沿反面圓圈的位置劃一同樣的圓，則標記完畢。制成的片子如只需臨時保存，最簡單的方法是在大小適宜的培養(yǎng)皿中墊一層潮濕濾紙，其上放數(shù)根牙簽，然后將制片的蓋片一面朝下放置在牙簽上，再加蓋皿蓋防水分蒸發(fā)，此法可使制片保存數(shù)天。如臨時片制成后，來不及立即完成觀察分析，就有必要制成永久片，以供日后觀察、研究和顯微攝影之用。（七）永久片制作（1）簡易制片法（介紹兩種）①將具優(yōu)秀分裂相的制片置冰箱的冷凍室內，待完全冷凍后，用單面刀片將蓋片揭開，然后把載片和蓋片同時置于37℃—40℃的烘片臺或溫箱中烘干（或室溫下晾干），取出后在二甲苯中浸泡10—20分鐘，用加拿大樹膠將蓋片、載片分別封片。②冰凍揭片后，將制片放入95%酒精中1—2分鐘，再放入純酒精中1—2分鐘，然后用Euparal膠封片。（2）酒精一叔丁醇脫水封片法準備4套直徑約12cm的培養(yǎng)皿，編號，每一培養(yǎng)皿中放一短玻璃棒，然后順序加入下列溶液。1.1/295%酒精+1/245%醋酸2.95%酒精3.1/295%酒精+1/2叔丁醇4.叔丁醇操作時，將臨時壓片的蓋片一面朝下，浸入盛溶液的1號培養(yǎng)皿中，讓玻片一頭置于玻棒上，使蓋片自行滑下，蓋、載片脫落，依次經(jīng)2、3培養(yǎng)皿，最后至叔丁醇，每次5—10分鐘；從叔丁醇取出后，即可用溶于叔丁醇的加拿大樹膠封片，晾干后保存。（3）酒精—正丁醇脫水封片法參照（2）的方法，將臨時制片順序放入下列溶液脫水：1.1/295%酒精+1/2冰醋酸2.2/395%酒精+1/3正丁醇3.1/395%酒精+2/3正丁醇4.正丁醇制片需在1號溶液中浸泡5—6分鐘，2—4號溶液中浸泡2—3分鐘，最后用溶于正丁醇的加拿大樹膠封片，涼干后保存。作業(yè)：1.每人交一張具有絲分裂中期相的優(yōu)良制片，并加以繪圖。2.利用臨時制片，每人制作兩張永久制片。說明：該實驗需時較多，實驗教師可酌情將其一分為二，先做根尖細胞的染色體鏡檢；第二次可在前面的基礎上練習制作永久制片。附錄：有關藥品的配制：1.卡諾（Carnoy）固定液：卡諾I：冰醋酸1份純?yōu)⒕?份卡諾II：冰醋酸1份（用于含油脂類物質較多的材料以及某些需要更加硬化的組織的固定）氯仿3份純酒精6份2.當量鹽酸的配制用酸滴定管取濃鹽酸配成所需當量濃度的鹽酸。加水至1000ml0.2ml19.66ml加水至1000ml加水至1000ml3.用95%酒精配制各種濃度酒精的方法原則上稀釋多大濃度就取多少毫升的酒精，例如配70%酒精，則取70毫升95%的酒精，加蒸餾水量為原有濃度減去所需稀釋的濃度數(shù)，本例即為25毫升（95減去70）4.0.002M8—羥基喹啉—羥基喹啉置1000ml蒸餾水中。因本藥難溶于水，需將溶液置60℃左右的溫箱中數(shù)小時，待其完全溶化后，取出冷卻至室溫貯存?zhèn)溆谩?.對二氯苯-α-溴萘飽和水溶液稱取5克對二氯苯結晶放入棕色試劑瓶中，加入100毫升加溫至40—50℃的蒸餾水，振搖約5分鐘，使其溶解，冷卻至室溫后加入1滴α-溴萘溶液，充分振搖后靜置，待溶液澄清后即可使用。該混合液作用力強，作用迅速，非常適合于具大染色體植物材料的預處理，在較短時間內可使染色體明顯縮短。此外，也適用于以計數(shù)染色體為目的的預處理。但該混合液對細胞的毒害力也較大，要嚴格控制處理條件（溫度不能過高，10—20℃為宜，時間不能過長），否則易導致染色體嚴重粘連、聚縮成團等。另外，該混合液穩(wěn)定性稍差，使用一周后，其效力明顯下降，故不宜配制后久存。6.1%醋酸洋紅先將100ml45%的醋酸水溶液放在較大的錐形瓶中煮沸，移去火苗，徐徐加入1克洋紅粉末，煮沸1—2分鐘，放入一鐵針，過1分鐘取出（或在冷卻后加入醋酸鐵1—2滴），使染色液略具鐵質，靜置12小時，過濾于棕色試劑瓶中，可長期保存。7.醋酸地衣紅醋酸地衣紅配法基本上與醋酸洋紅相同，但無需加鐵質作媒染物。8.4%鐵明礬稱取4g鐵明礬，溶于100ml的溫熱蒸餾水中（50℃）即可。鐵明礬為紫色結晶，若為黃色則不能用。此液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。9.0.5%蘇木精染色液取蘇木精結晶0.5g，溶入10ml95%的酒精中，待充分溶解后再加入90ml蒸餾水，瓶口敷以紗布，放置1個月左右，染色液即充分成熟便可使用。有時也可將蘇木精先配成10%的基液，便于長期貯存，需用時，再稀釋到0.5%（用5ml基液，加95ml蒸餾水即可）。10.卡寶品紅（或稱石碳酸品紅）這是目前在國內應用最廣泛的一種優(yōu)良的染色劑，其優(yōu)點染色快速而操作簡便，一般只對核和染色體深染。此外，藥品價廉，染色液穩(wěn)定為其它藥物所不及。配方如下：原液A：3克堿性品紅溶于100毫升70%酒精中（此液可長期保存）。原液B：取原液A10毫升，溶入90毫升5%的石碳酸（苯酚）水溶液中（限2周內使用）。原液C：取原液B55毫升，加入冰醋酸和甲醛各6毫升（可長期保存）。染色液：取原液C10—20毫升，加入45%冰醋酸80—90毫升，再加入1克山梨醇。該染色液配制1—2周后即可使用，室溫存放，一般可保存兩年而有效。如發(fā)生沉淀，過濾后即可用。用卡寶品紅染色的材料，必須經(jīng)鹽酸解離，鹽酸處理時間要控制好，時間短細胞質也不同程度地著色；處理過度，則染色體著色淺淡。鹽酸處理后必需用水徹底清洗。否則，也難以著色。

實驗十一植物染色體核型分析一、實驗目的及說明本實驗的目的是：要求學生掌握利用有絲分裂中期的染色體進行核型分析的方法。核型亦稱染色體組型，是指體細胞有絲分裂中期細胞核（或染色體組）的表型。它是物種特有的遺傳信息之一，有很高的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。核型分析就是對每一物種的染色體進行分組，并對細胞核中染色體的數(shù)目、各染色體的大小和形態(tài)特征進行綜合描述。掌握核型分析方法可幫助鑒別真假雜種，了解染色體畸變類型，探討特種起源和進化途徑。它是細胞遺傳學的一項基本技術，也是染色體工程、細胞分類學和植物育種學的一種不可缺少的手段。進行核型分析，首先要制作該物種有絲分裂中期的優(yōu)良染色體標本，要求細胞內染色體縊痕、隨體清晰可見，無重疊或重疊少形態(tài)可辨，染色體不扭曲，不斷裂，長度適中，細胞輪廓清楚。還要通過顯微攝影，沖洗放大獲得染色體相片，供組型分析用。取樣的細胞數(shù)目：作核型分析，研究染色體形態(tài)以來源于不同個體5個以上的細胞為準（原則上越多，準確性越高，有用10個甚至20個的）。染色體計數(shù)，統(tǒng)計的細胞數(shù)目應在30個以上。二、材料和用具1.材料：蒙古冰草、紫花苜蓿根尖染色體標本制片10張以上；5個分裂中期細胞的染色體相片，每細胞洗1張，其中選一最好的加洗1張，作為模式照片。2.用具：毫米尺、剪刀、鑷子、計算器、鉛筆、繪圖紙、座標紙、顯微測微計等。三、實驗步驟（一）染色體計數(shù)將蒙古冰草（或紫花苜蓿）根尖染色體制片，置顯微鏡下，選取有絲分裂中期30個以上可計數(shù)染色體的細胞分別計數(shù)，其中85%以上的細胞染色體如恒定一致，即為該材料的染色體數(shù)。（二）排列核型圖1.測量和求出放大倍率：先在放大照片上分別將每個細胞內的染色體隨意編號（以利記載），然后依次測量出每條染色體的長、短臂長度（從著絲點中部量到每個臂的端部），并據(jù)此計算出每條染色體的全長和臂比值（長臂/短臂）。隨體長度可計入也可不計入，但須加以注明（具隨體的染色體在表中以星號“*”標記）。所量數(shù)據(jù)填入下表：染色體序號照相長度（mm）長臂+短臂=全長臂比（長臂/短臂）暫編號正式號放大倍數(shù)的求法：在每一個已照相的細胞染色體中找一條平直的用測微尺在顯微鏡下量制片上這條染色體的實際長度，然后用下式算出。某染色體在放大照片上的長度（μm）放大率=————————————————————測微尺測量的實際長度（μm）2.同源染色體配對：其識別依據(jù)是隨體的有無、形狀及大小、臂比值、染色體長度是否相等等，配對需根據(jù)所測數(shù)據(jù)并結合目測進行。3.排列：各對同源染色體按一定原則排列，正式編上序號（填入上表）。排列的原則是：染色體長的在前，如兩對染色體長度完全相等，則按短臂長度順序排列，長者在前短者排后。隨體染色體（簡稱SAT）和性染色體排在最后或單獨另排。B染色體一般排在最后。如為二型核型（中國水仙、蘆薈等），則長染色體按L1，2……順序排列，短染色體群按S1，2……順序排列，而不是全部染色體統(tǒng)一依順序排列。如遇普通小麥等異源多倍體植物，則應按親本的染色體組（A、B、D三組）分別排列，而不是全部染色體統(tǒng)一按順序排列。4.剪貼：在繪圖紙的上方正中貼上模式照片（一張有代表性的中期染色體的完整照片）。照片應注明放大倍數(shù)，最好在其上標出一個以微米為長度單位的標尺，以便于目測出染色體的實際大小。將與模式照片同一細胞的染色體剪下，按照已確定的同源關系和先后順序，粘貼在繪圖紙上，粘貼時應使各條染色體的著絲點處于同一水平線上，短臂朝上，長臂朝下，貼好后即為該細胞的核型圖并進行翻柏，供發(fā)表文章用。其它幾個細胞的染色體，也進行排列剪貼，但不需翻拍。（三）繪制核型模式圖1.換算出5個細胞同源染色體（臂）的實際長度平均值先求出每個細胞放大照片上各對染色體全長（臂長）的平均值（單位：mm），然后再算出5個細胞同號染色體的長臂、短臂、全長的平均值。將此值除以放大倍數(shù)，即得染色體（臂）實際長度（單位：微米），填入下表：染色體序號照相長度（mm）長臂+短臂=全長實際長度（μm）長臂+短臂=全長2.求出相對長度、臂比、確定染色體類型填表并寫出核型公式。相對長度的計算公式為：某染色體（臂）的長度相對長度（%）=———————————————×100%染色體組內各染色體的總長度相對長度的計算十分必要,因為它是穩(wěn)定的可比較的數(shù)值,不象絕對長度那樣易受預處理條件的影響。以實際長度求出臂比值，臂比反映的是著絲點在染色體上的位置，據(jù)此可確定染色體所屬形態(tài)類型。見下表：臂比值著絲點位置簡寫正中部著絲點M—中部著絲點m近中部著絲點Sm—近端部著絲點St端部著絲點區(qū)t∞端部著絲點T填表，并寫出核型公式，將核型的主要特征以公式表示，它簡明扼要，便于記憶和比較，如紫花苜蓿為2n=4x=32=32m，蒙古冰草為2n=14=12m+2Sm，披堿草為2n=42=32m（4SAT）+10Sm（2SAT）。xxx染色體相對長度、臂比和類型染色體序號實際長度（μm）長臂+短臂=全長相對長度（%）長臂+短臂=全長臂比（長/短）類型核型公式：2n=3.繪制核型模式圖：以表中所列各染色體的相對長度平均值進行繪圖。先在坐標紙上繪好，再將其描在硫酸紙上，橫座標為染色體序號，縱座標為相對長度（%），著絲點位于縱座標0處，短臂向上，長臂向下。（四）綜合描述：內容為：染色體總數(shù)、大小、所含染色體組的數(shù)目及來源（同原或異源）；每個染色體組的染色體基數(shù)、組型的對稱性等。Stebbins（1971）根據(jù)核型中染色體的長度比、兩臂比兩項主要特征，用以區(qū)分核型的對稱和不對稱程度，并將其分為12種類型，可作為核型表述的一個內容，1A為最對稱的核型，4C為最不對稱的核型。最長/最短臂比大于2：1的染色體的百分比——＜2：11A2A3A4A2：1—4：11B2B3B4B＞4：11C2C3C4C染色體大小的劃分，根據(jù)1980年Limade—Faria提出的標準：實驗長度1μm以下的為極小染色體；1—4μm為小染色體；4—12μm為中等染色體；12—60μm為大染色體。根據(jù)上述標準對蒙古冰草（或紫花苜蓿）的全套染色體進行描述。幾點說明：1.關于具小染色體植物的核型分析對于染色體長度在2微米以下，不易分辨著絲點的染色體，可從以下幾方面進行核型的分析和比較：（1）染色體數(shù)目；（2）具隨體的染色體數(shù)目（如可見的話）；（3）每對染色體的相對長度值；（4）染色體長度比：（5）如含有大小差別明顯的染色體，可分大、小類群分別統(tǒng)計其數(shù)量和長度，以及各自所占染色體組全長的百分比。2.作核型分析的材料若不是常見物種，則應有全株植物相片及標本。3.若對染色體標本進行分帶處理，則在核型分析時應包括帶型分析內容。四、作業(yè)繪制、填寫蒙古冰草（或紫花苜蓿）的染色體核型圖，核型分析表和核型模式圖，并對蒙古冰草（或紫花苜蓿）染色體、組型進行綜合描述。附：顯微測微計的使用方法（一）顯微測微計的結構和測量原理它由目鏡測微計和鏡臺測微計二個部件組成。前者為一塊可放在目鏡內的圓形玻片，其中央刻有5大格，每格又分為10小格共50等分的小格（常用的一種）。鏡臺測微計為一特制的載玻片，其中央膠粘一圓形玻片，刻有尺度，一般為1mm，分10大格，每格為10小格，共100等分的小格，每小格等于10μm。目鏡測微計每小格的長度，隨目鏡、物鏡放大倍數(shù)的大小而變動。因此，必須先以鏡臺測微計來校準并計算出在某一物鏡下接目測微計每小格的長度，然后才能用接目測微計來測量被測對象的長度和寬度。也就是說二者必須配合使用，才能完成其測量過程。（二）使用方法1.放置目鏡測微計：取出目鏡，旋開接目透鏡，將目鏡測微計放在目鏡的光闌上（有刻度一面向下），然后旋上接目透鏡，插上鏡筒（注意：研究用顯微鏡的目鏡結構精密，不允許隨便拆卸，要使用本身帶有測微計的目鏡）。2.放置鏡臺測微計：將鏡臺測微計放在載物臺上，通過調焦以便看清鏡臺測微計上的刻度。3.校準目鏡測微計的長度用低倍物鏡觀察，移動鏡臺測微計和轉動目鏡測微計，使兩者刻度平行，并使兩者間某段的起、止線完全重合，數(shù)出兩條重合線之間的格數(shù)，即可求出目鏡測微計每格的相應長度。用同樣的方法可分別測出用高倍物鏡和油鏡觀察時目鏡計每格的相對長度。4.目鏡測微計每格長度的計算臺尺重疊格數(shù)×10μm目鏡測微計每小格長度=————————————目尺重疊格數(shù)舉例：現(xiàn)測得顯微鏡的目鏡測微計50格相當于鏡臺測微計8格，則目鏡測微計每格長度為8×10μmμm。5.測量染色體長度：取下鏡臺測微計，將染色體制片放在鏡臺上，通過調焦，使細胞中的染色體在高倍鏡下清晰可見，轉動目鏡測微計或移動載玻片，測量染色體長度，記下所占的格數(shù)，然后用目鏡測微計每格長度乘以測得的格數(shù)，即為染色體實際長度值。用畢后取出目鏡測微計，將接目鏡放回鏡筒，用擦鏡紙將目鏡測微計上的油膩和手印擦去。

實驗十二植物染色體（Giemsa）分帶技術一、實驗目的植物染色體分帶是70年代興起的一項細胞學新技術，它借助且酶、堿、酸、鹽、熱等各種處理程序，再用Giemsa染料染色，使染色體特定部位呈現(xiàn)出深淺不同的帶紋，可以更準確地鑒別單個染色體和染色體組。此項技術被應用于植物細胞學、細胞遺傳學、植物分類學、染色體工程學、農(nóng)作物遺傳育種等基礎理論和應用科學方面的研究中。本實驗的目的是掌握植物染色體Giemsa分帶技術及染色體帶型分析的方法。二、實驗材料洋蔥鱗莖（2n=16）,大麥（2n=14）、蠶豆（2n=12）、黑麥（2n=14）種子（以上材料任取一種即可）。三、實驗器具和藥品生物染色體冷凍機或液氮罐、1/1000天平、小臺秤、溫箱、恒溫水浴、試劑瓶、容量瓶、量筒、燒杯、滴杯、滴瓶、染色缸、載片、蓋片、顯微鏡、顯微照相及沖洗放大設備、剪刀、鑷子、刀片、鉛筆、濾紙、牙簽、玻璃板、切片盒。Giemsa母液、Sorensen磷酸緩沖液、2×SSC溶液、鹽酸、甲醇、乙醇、冰醋酸、氫氧化鋇、秋水仙堿、纖維素酶、果膠酶、胰蛋白酶、1%醋酸洋紅、45%醋酸等。（配制方法見本實驗附錄）四、實驗步驟1.染色體標本制備：既可采用傳統(tǒng)的壓片法制備染色體標本，也可用去壁低滲法，這里僅用前一種方法。（1）材料培養(yǎng)：方法同實驗十（2）前處理：可用實驗十藥物，也可用秋水仙素。洋蔥根長1cm、蠶豆2—3cm時切下根浸入秋水仙溶液、大麥、黑麥可在根長1cm時進行整體處理，將材料放在培養(yǎng)皿內，將前處理液倒入。試驗材料秋水仙素濃度（%）前處理時間（小時）洋蔥4蠶豆3黑麥3大麥3（3）固定方法同實驗十。（4）解離用酸或酶解離材料，不僅可使根尖組織軟化，而且直接影響以后染色體的顯帶，因此對酸的濃度、溫度、處理時間要嚴格控制。試驗材料解離方法洋蔥0.1NHCl60℃5—8分鐘蠶豆先在45%冰醋酸中浸泡2—3小時（室溫），然后在55℃的45%冰醋酸中保溫15分鐘，或0.1N的HCl60℃8分鐘大麥、黑麥用1%的果膠酶和纖維素混合液處理2—℃HCl中處理5分鐘（5）壓片、凍片、揭片和脫色將根尖放在載片中央、切取分生組織部分，滴上一滴1%醋酸洋紅（45%醋酸），用壓片法制片后鏡檢，對染色體分散而完整的片子用液氮或置生物染色體冷凍機上冷凍后，將蓋片揭開。為除去細胞質對染色體顯帶的影響，揭片后，在蓋片和載片上加幾滴新配制的甲醇一冰醋酸固定液，置酒精燈上短時加熱2—3次。經(jīng)染色的制片要進行染色體脫色處理，可將制片放入45%醋酸中（55℃左右）8—10分鐘或滴45%醋酸于蓋、載片上，再在酒精燈上加熱，重復3—4次直至全部脫色為止。（6）脫水脫酸、空氣干燥因Giemsa是一種復合染料，一遇酸紅色染料會發(fā)生沉淀，使染色體染成蘭綠色，而不能顯帶，所以必須將酸脫凈。具體方法是：把染色體標本放入95%→100%→100%酒精中逐級脫水脫酸，每級10—15分鐘，然后將制片置室溫下涼干?？諝飧稍镄柙跓o塵條件下進行，洋蔥對空氣干燥的時間要求較嚴，未經(jīng)空氣干燥的染色體標本顯帶，干燥一周后經(jīng)顯帶處理能顯示末端帶，干燥半個月后同時顯示末端帶與著絲點帶，干燥一個月后只能顯示著絲點帶，蠶豆、黑麥、大麥則對空氣干燥的要求不十分嚴格。不同的顯帶方法所需空氣干燥的時間也不一樣，請參考下表：材料空氣干燥時間BSG法HSG法黑麥24小時—15天12小時—7天大麥4—7天48小時—7天洋蔥3天以上5天—2個月蠶豆1天—5小時—72小時2.顯帶處理空氣干燥后的染色標本即可進行顯帶處理。（1）BSG法（Ba(OH)2—2×SSC—Giemsa）是當前廣泛用于植物染色體GiemsaC-帶方法。將干燥后的蠶豆染色體片子用5%氫氧化鋇飽和水溶液在18—25℃下處理5分鐘(黑麥5分鐘、大麥60—80分鐘)，蒸餾水徹底沖洗，2×SSC（0.3MNaOH6H5Na3O7·2H2O）溶液65℃保溫兩小時（黑麥、大麥在60℃下，分別處理45—60分鐘和30—40分鐘）。再用蒸餾水沖洗，稍干后以5%Giemsa溶液染色20—30分鐘，沖洗掉片上多余的染料（用蒸餾水），空氣干燥，樹膠封片。（2）HSG法（鹽酸—鹽Giemsa）顯示C帶?！?0分鐘（黑麥處理10分鐘、大麥60分鐘、蠶豆70分鐘），蒸餾水沖洗。2×SSC溶液中保溫（60—66℃）15分鐘（蠶豆在此溫度下處理30—50分鐘、大麥60℃下30—40分鐘、黑麥60℃下30—35），蒸餾水沖洗，10%Giemsa溶液（磷酸緩沖液稀釋原液）染色10分鐘左右，蒸餾水沖洗，空氣干燥，樹膠封片。（3）胰酶-Giemsa法顯示C帶將空氣干燥后的蠶豆染色體片子放在0.05％胰酶溶液中（pH7.2），在34℃下溫育15—30分鐘，及時沖洗掉酶液，用10％Giemsa（pH7.2）染色10—15分鐘，蒸餾水沖洗，空氣干燥，樹膠封片。（4）NaH2PO4法對核仁組織區(qū)顯帶十分明顯，稱為N帶。將空氣干燥后的大麥染色體片子在1MNaH2PO4溶液中94℃±1℃溫浴3—5分鐘，蒸餾水沖洗，5%Giemsa（pH7.2）染色半小時，水沖洗，空氣干燥，樹膠封片。注意事項及說明①掌握好堿、酶、酸處理時間和溫度是顯帶的關鍵所在。不同材料處理時間不同，變性過頭會破壞染色體破壞，變性處理不足，染色體則不顯帶或帶紋很淺。②應用BSG法顯帶在Ba(OH)2處理后必須用蒸餾水徹底沖洗以清除Ba(OH)2，如果沖洗不凈，即使有微量的Ba(OH)2存在，都會對以后的分帶造成不良的影響。③染色時，取配好的Giemsa母液，以Sorenson磷酸緩沖液按一定比例稀釋，BSG法中多用pH6.8緩沖液稀釋，,HSG法中則用pH7.2緩沖液稀釋，為防止染料沉淀在載片上，染色時將有材料的面朝下，放在玻璃板上，中間墊上牙簽，用滴管將染液從旁邊滴進去。3.帶型分析及說明說明：Giemsa顯帶在植物上主要產(chǎn)生C帶，所謂C帶，本意是著絲點帶或組成型異染色質帶的意思，但在植物染色體上除著絲點及其附近顯帶外，在染色體兩臂的端粒部及端粒與著絲點之間都可以顯帶，并因植物種類不同而異，現(xiàn)分述如下：（1）著絲粒帶（Centromericband），是指著絲粒及其附近的帶，大部分植物均有這種帶型。上述的材料中僅洋蔥帶型較淺。（2）中間帶（Intercalaryband），指分布于染色體著絲粒至末端之間的帶，小麥B組染色體中間帶較多且明顯，蠶豆染色體中間帶一般在長臂上。（3）末端帶（Telomericband），位于染色體末端的帶，洋蔥有較明顯的末端帶，小麥僅部分染色體顯示，大麥、蠶豆則不顯示。（4）核仁縊痕帶（Nucleolaronstrictionband），是指核仁染色體特殊的帶型，位于核仁組織中心區(qū)。蠶豆、玉米、大麥、小麥均有明顯的核仁縊痕帶。C帶分類方法常用帶名稱英文的頭一個字母為代表，記錄植物C帶的顯帶情況，分為下列二種類型：①完全帶類型:處理染色后,同時出現(xiàn)四種帶類型稱為完全帶,用字母ClTN表示,黑麥染色體C帶屬于這一類型。②不完全帶類型：只顯示三種以下的帶類型，具體可再分為4種亞類：a.ClN型：缺乏末端帶類型，大麥、小麥和蠶豆的染色體。b.CTN型：不具有中間帶類型，如洋蔥。c.TN型：只有末端帶和縊痕帶，如玉米等。d.N型：只有縊痕帶。除著絲粒帶之外，對于具雙臂的染色體還有一個帶分布在哪一個臂上的問題。如帶在短臂上，把“＋”號寫在字母右上角，如帶在長臂上，則把“＋”號寫在字母的右下角；再者，如若干條染色體具有同類帶型，則在字母符號前放一系數(shù)，而不顯帶的染色體僅用數(shù)字表示。如：蠶豆為2n=12=ClN型=

2Cl＋＋8Cl＋+2ClN，意思是說，有一對同源染色體具著絲粒帶和短臂上中間帶，4對同源染色體具著絲粒帶和長臂上中間帶，另一對同源染色體具著絲粒帶、兩臂的中間帶和縊痕帶。玉米2n=20=TN型=6T＋＋2T＋＋2N＋10，這里10表示有5對同源染色體不顯帶。帶型分析：首先必須有整個染色體組的帶型照片，每對染色體帶紋詳細說明，最后繪制出帶型模式圖，具體操作步驟如下：①選擇染色體數(shù)目完整，長度合適，分帶清晰的材料進行顯微攝影，沖洗放大后進行染色體剪貼（方法同組型分析）。②詳細記錄每條染色體上帶紋的位置、寬窄、染色深淺和形狀等。③繪制染色體模式圖，然后在各條染色體模式圖上標出各條帶紋的位置、寬窄、深淺、形狀等線條。五、作業(yè)1.制備一張質量較好的分帶片。2.如實驗未能得到預期的結果，請分析原因。附錄：（一）藥品配制1.2×SSC溶液（0.3MNaCl＋0.3M檸蒙酸鈉）稱取Nagg，置于容量瓶中加水至1000ml。3.當量鹽酸的配制：（實驗十附錄）4.磷酸緩沖液（Sorensen配方）2PO4置于容量瓶內，加蒸餾水至1000ml。2PO4置于容量瓶內，加蒸餾水至1000ml。使用時根據(jù)pH值的要求按下列比例混合：pH值A液（ml）B液（ml）5.Giemsa染色液：100ml磷酸緩沖液加上3—5mlGiemsa母液。此液必須在臨用前配制。（二）SSG（碳酸氫鈉/鹽/吉母薩）法顯示C帶。此法的優(yōu)點：NaHCO3很易溶于水，用它來替代Ba(OH)2制片清洗方便，而Ba(OH)2很難洗凈，易產(chǎn)生鋇膜污染，影響分帶。NaHCO3的堿性比Ba(OH)2弱，對染色體破壞小。處理條件為：45%醋酸洋紅壓片。制片空氣干燥約4—16天。制片放入5%NaHCO3溶液（pH8.9）中，17—26℃下處理10—30分鐘。2×SSC，60—66℃處理50—80分鐘，用pH6.8磷酸緩沖液配制的10:1Giemsa染液染色10—15分鐘，封片，觀察，照相。（三）BSHG（氫氧化鋇/鹽/鹽酸/吉姆薩）法顯示C帶流程大體流程：堿→鹽→酸，材料：玉米、蠶豆、洋蔥等。處理條件：飽和Ba(OH)245℃處理50分鐘，然后用40℃的去離子水充分沖洗，風干。鹽（2×SSC）處理溫度為60℃，時間因植物而異，玉米55分鐘，蠶豆洋蔥20分鐘左右。處理后的制片用去離子水沖洗，風干。酸（0.2NHCl）處理為25℃，時間為1小時，自來水沖洗，風干。

實驗十三培養(yǎng)基母液配制一、實驗目的和要求（一）掌握培養(yǎng)基母液的配制方法為保證配制培養(yǎng)基的精確性和方便起見，常在配制前將大量元素、微量元素、鐵鹽、氨基酸、維生素、激素類分別配制成母液，配制培養(yǎng)基時，只需吸取一定量的母液即可。（二）配培養(yǎng)基時操作應認真，稱量務須精確，最好由兩人校正，以防發(fā)生差錯。二、實驗器材及藥品（一）器材：分析天平（感量0.001克）、扭力天平（感量0.01克）、臺平（0.5克）、燒杯（50ml、100ml）、量筒（1000ml、500ml、250ml）、容量瓶（100ml、50ml）、細口瓶（1000ml、500ml、250ml）、滴瓶（100或150ml）、玻璃棒、藥勺等。（二）藥品：按培養(yǎng)基配方準備，并盡可能采用分析純。三、配制方法以MS培養(yǎng)基配方（1962）為例（見下表），說明其配制方法，母液配制必須用重蒸餾水。（一）大量元素母液的配制用感量為0.01克的扭力天平，把無機鹽中大量元素按培養(yǎng)基配方的10倍分別稱量，置50ml小燒杯中，每杯倒入約30—40ml重蒸餾水、分別溶解后（為增快溶解速度，可在酒精爐上以60—70℃的溫度稍加熱），順次混合定容于1000量筒中，注意氯化鈣必須最后加入，因為鈣離子（Ca2+）與磷酸根離子（PO43-）、硫酸根離子（SO42-）會產(chǎn)生出不溶于水的磷酸鈣、硫酸鈣沉定。將配好的混合液倒入細口瓶中，貼上標簽，置冰箱中存放，配制增養(yǎng)基時，每配1000ml取此液100ml。（二）微量元素母液的配制用感量為0.001的分析天平，把無機鹽中的微量元素按培養(yǎng)基配方的100倍分別稱量，置50ml燒杯中，分別溶解后，再混合定容于1000ml量筒中，將混合液倒入細口瓶中，貼上標簽，存放于冰箱中。配制培養(yǎng)基時，每配1000ml取此液10ml。（三）鐵鹽母液的配制目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，這種螯合物使用方便，比較穩(wěn)定，其配法：用感量為0.01克的扭力天平取硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）5.56克，乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）克，分別溶解后混