顯微技術(shù)在生物科學(xué)的應(yīng)用課件

顯微技術(shù)在生物科學(xué)上的應(yīng)用主要內(nèi)容：

一、電子顯微技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用二、熒光顯微分析技術(shù)在植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用

三、原子力顯微鏡技術(shù)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用一、電子顯微技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

電子顯微鏡技術(shù)是醫(yī)學(xué)生物學(xué)工作者深入研究機(jī)體的超微結(jié)構(gòu)及其功能的有利手段之一。所謂超微結(jié)構(gòu)，一般指光學(xué)顯微鏡所不能分辨的組織、細(xì)胞的細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)（亞顯微結(jié)構(gòu)）以及生物大分子的結(jié)構(gòu)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，電子顯微鏡技術(shù)也正向超高分辨率、生物分子及原子水平發(fā)展。

*在形態(tài)學(xué)科:如解剖學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)等等之中，電子顯微鏡技術(shù)已成為研究結(jié)構(gòu)的常規(guī)方法。*在某些機(jī)能學(xué)科:如生理、生物化學(xué)、病理生理、藥理等。也應(yīng)用電鏡技術(shù)，探討功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。*在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)科學(xué)以及中草藥的研究等，電鏡技術(shù)也起著重要作用核衣殼在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制組裝的部位、病毒體的形態(tài)和大小以及螺旋對(duì)稱核衣殼的直徑等,再結(jié)合病毒的核酸和蛋白分子生物學(xué)特性,可以對(duì)致病病毒進(jìn)行鑒定和分類。電鏡負(fù)染技術(shù)是一種快速簡(jiǎn)便的操作程序,也是病毒性致病因子電鏡診斷常用方法,在新病毒的發(fā)現(xiàn)中作出了重要貢獻(xiàn)。免疫電鏡的應(yīng)用更提高了病毒快速診斷的敏感性和特異性。2、電鏡對(duì)腫瘤的診斷病理科醫(yī)生對(duì)腫瘤的診斷主要依賴于光鏡輔以免疫組織化學(xué)等技術(shù)。一般講,使用這些技術(shù),絕大部分腫瘤都得以明確診斷。但有些腫瘤的診斷及鑒別診斷,電鏡所起的作用很大,如無(wú)色素性黑色素瘤、肥大細(xì)胞腫瘤、嗜酸細(xì)胞瘤、肌源性腫瘤、軟組織腺泡狀肉瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等對(duì)于這些腫瘤,光鏡有時(shí)難以明確診斷。

免疫組織化學(xué)方法雖然對(duì)腫瘤的診斷發(fā)揮了很大作用,但由于腫瘤的多向分化及部分市售免疫組化試劑存在明顯的交叉反應(yīng)性,所以應(yīng)用免疫組化染色診斷腫瘤有一定的局限性。而電鏡技術(shù)的應(yīng)用為腫瘤的診斷提供了一條新的途徑。3、電鏡對(duì)非腫瘤性疾病的診斷電鏡對(duì)各器官系統(tǒng)疾病的病理診斷,在許多單位受到重視,但用得最多的是腎臟活檢和某些皮膚疾病的診斷。對(duì)腎臟病的診斷,通常將光鏡、免疫熒光光鏡和電鏡觀察三者結(jié)合。臨床上,有時(shí)僅靠光鏡難以對(duì)疾病明確診斷,而電鏡具有高分辨性能,可以獲得許多不為光鏡捕捉到的信息,往往就是這些信息,為疾病的正確診斷提供了寶貴的資料,甚至修正光鏡的診斷結(jié)論。有研究者對(duì)200例病例進(jìn)行了光鏡診斷和電鏡診斷的結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)有15%的病例靠電鏡提供新的信息得以診斷。人們才越來(lái)越清楚地了解到細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)中起重要作用的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是細(xì)胞骨架。與此同時(shí),人們利用一些特異性熒光探針來(lái)研究細(xì)胞骨架在不同細(xì)胞生活狀態(tài)下的分布,也取得了很大進(jìn)展。李巖等采用免疫熒光定位,在LSCM下觀察,發(fā)現(xiàn)南瓜的莖細(xì)胞微管骨架排列主要有三種方式:在一些薄壁細(xì)胞內(nèi),微管骨架是網(wǎng)絡(luò)狀排列,其中微管常常與液泡膜、核膜及質(zhì)膜相連;而在多數(shù)伸長(zhǎng)的細(xì)胞中,微管骨架往往是與細(xì)胞的縱軸成一定角度,并彼此平行排列;少數(shù)伸長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi),微管骨架形成束狀,沿細(xì)胞縱軸排列.結(jié)果表明,花粉萌發(fā)初期細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+呈極性分布,萌發(fā)溝附近的Ca2+濃度明顯高于其他部位,萌發(fā)孔附近最高,花粉細(xì)胞核中較低。在該條件下將Fluo3/AM導(dǎo)入擬南芥葉細(xì)胞,利用激光共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)了胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的分布研究表明茉莉酸處理能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)游離Ca濃度的升高。使用鋁敏熒光試劑標(biāo)記大豆根尖細(xì)胞的鋁離子,利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)鋁對(duì)根尖細(xì)胞的分裂有抑制作用。三、原子力顯微鏡技術(shù)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

對(duì)于原子力顯微鏡成像而言,樣品在基底表面的固定是一個(gè)至關(guān)重要的問題,對(duì)于細(xì)胞樣品來(lái)說(shuō)尤其如此.如何將細(xì)胞樣品固定得比較牢固又保持細(xì)胞的原始狀態(tài)是許多研究者關(guān)心的重點(diǎn).最初的報(bào)道中細(xì)胞一般都是經(jīng)過自然干燥固定然后在空氣介質(zhì)中進(jìn)行成像研究.自然干燥固定法是將一定量的細(xì)胞樣品滴在基底上,然后在空氣中自然干燥,干燥后形成一層平整連續(xù)的膜.這種固定方法非常簡(jiǎn)單,但是由于細(xì)胞在干燥過程中會(huì)脫水,因此對(duì)細(xì)胞形態(tài)等會(huì)有一定的影響.后來(lái),如何在溶液狀態(tài)下固定活細(xì)胞成為許多研究者工作的重點(diǎn).1、細(xì)胞固定方法研究有研究者利用靜電相互作用或共價(jià)交聯(lián)等方法來(lái)固定細(xì)胞樣品.Bolshako小組將基底表面進(jìn)行聚賴氨酸修飾來(lái)固定細(xì)胞,在生理?xiàng)l件下細(xì)胞一般荷負(fù)電,而聚賴氨酸荷正電,因此可以利用聚賴氨酸與細(xì)胞之間的靜電相互作用固定細(xì)胞.這種細(xì)胞固定方法操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好,是目前為止用得最多的一種方法.不過,由于聚賴氨酸與細(xì)胞壁存在一定相互作用,因而對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)還是存在一定的影響.2、細(xì)胞成像

自從20世紀(jì)90年代初期Butt等人首次將原子力顯微鏡應(yīng)用到細(xì)胞成像方面以來(lái),陸續(xù)出現(xiàn)了很多關(guān)于細(xì)胞成像研究方面的報(bào)道.有研究者直接用原子力顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu).Lister等人采用自然干燥固定樣品的方法對(duì)耐輻射球菌進(jìn)行了MAC模式原子力顯微鏡成像研究,得到了高分辨的細(xì)菌表面形貌圖,觀察到了細(xì)菌表面壓縮的六邊形中間層.有些研究者則利用原子力顯微鏡對(duì)細(xì)胞的一些生化生理過程進(jìn)行了研究.利用原子力顯微鏡觀察到了白腐菌

表面微結(jié)構(gòu)在發(fā)芽前后的變化.3、力檢測(cè)

原子力顯微鏡還有一個(gè)重要的特點(diǎn),就是在掃描得到樣品表面形貌的同時(shí)還可獲得樣品表面某一特定點(diǎn)的力與距離的曲線關(guān)系,并根據(jù)此曲線得到黏附力、鍵