2020版藥典微生物變更細則課件

新版藥典變更解讀

——微生物相關(guān)

分析質(zhì)檢中心微生物組

2020年05月

新版藥典變更解讀

——微生物相關(guān)

涉及內(nèi)容藥典三部：生物制品通則：《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》總論：《微生態(tài)活菌制品總論》（變更）涉及內(nèi)容藥典三部：通則1101《無菌檢查法》（變更）1105《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》1106《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法》1107《非無菌藥品微生物限度標準》3605《細菌生化反應培養(yǎng)基》1421《滅菌法》

通則1101《無菌檢查法》（變更）9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》9203《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則》9204《微生物鑒定指導原則》（變更）9205《藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則》（變更）通則9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》通則新增滅菌用生物指示劑指導原則（新增）生物指示劑耐受性檢查法指導原則（新增）細菌DNA特征序列鑒定法（新增）新增滅菌用生物指示劑指導原則（新增）一、《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》菌毒種，系指直接用于制造和檢定生物制品的細菌、支原體、立克次體或病毒等生產(chǎn)和檢定用菌毒種，來源途徑應合法，并經(jīng)國務院藥品監(jiān)督管理部門批準。微生物檢測用菌來源：CMCC:中國醫(yī)學細菌保藏管理中心CICC:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心ATCC:美國微生物菌株保藏中心一、《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》菌毒種，系指直接用于生物制品生產(chǎn)用菌毒種應采用種子批系統(tǒng)。每批主種子批和工作種子批均應按各論要求保管、檢定和使用。菌毒種的傳代及檢定實驗室應符合國家生物安全的相關(guān)規(guī)定。各生產(chǎn)單位質(zhì)量管理部門對本單位的菌毒種施行統(tǒng)一管理。生物制品生產(chǎn)用菌毒種應采用種子批系統(tǒng)。每批主種子批和工作種子保管菌毒種應有嚴格的登記制度，建立詳細的總賬及分類賬。收到菌毒種后應立即進行編號登記，詳細記錄菌毒種的學名、株名、歷史、來源、特性、用途、批號、傳代凍干日期和數(shù)量。在保管過程中，凡傳代、凍干及分發(fā)，記錄均應清晰，可追溯，并定期核對庫存數(shù)量。收到菌毒種后一般應及時進行檢定。用培養(yǎng)基保存的菌種應立即檢定保管菌毒種應有嚴格的登記制度，建立詳細的總賬及分類賬。收到菌生產(chǎn)用菌毒種應按各論要求進行檢定銷毀四類菌毒種須經(jīng)單位領導批準。銷毀后應在賬上注銷，作出專項記錄，寫明銷毀原因、方式和日期。生產(chǎn)用菌毒種應按各論要求進行檢定銷毀四類菌毒種須經(jīng)單位領導批二、微生態(tài)活菌制品總論微生態(tài)活菌制品必須由非致病的活細菌組成，無論在生產(chǎn)過程、制品貯存和使用期間均應保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)。它可由一株、多株或幾種細菌制成單價或多價聯(lián)合制劑。根據(jù)其不同的使用途徑和方法可制備成片劑、膠囊顆粒劑或散劑等多種劑型?；疽螅何⑸鷳B(tài)活菌制品的制備方法、工藝應能保證成品含有足夠的活菌數(shù)量，保持其穩(wěn)定性，同時應防止外源因子的污染。生產(chǎn)和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關(guān)要求。二、微生態(tài)活菌制品總論微生態(tài)活菌制品必須由非致病的活細菌組成生產(chǎn)用菌種生產(chǎn)用菌種應符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定名稱及來源；種子批的建立：三級種子批應分別凍干，置適宜溫度保存；種子批傳代應限定傳代次數(shù)，原始種子批和主種子批啟開后傳代次數(shù)不得超過10代，工作種子批啟開后至發(fā)酵培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過5代。生產(chǎn)用菌種生產(chǎn)用菌種應符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程生產(chǎn)用菌種種子批的檢定：應依據(jù)最新版伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊和伯杰氏細菌命名手冊的有關(guān)規(guī)定進行，形態(tài)、生長代謝特性檢查。原始種子或主種子還應做遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。三級種子批常規(guī)檢查包括以下3項：（1）培養(yǎng)特性及染色鏡檢；（2）生化反應；（3）毒性試驗生產(chǎn)用菌種種子批的檢定：應依據(jù)最新版伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊和原始種子或主種子批還需進行以下檢查（1）細菌代謝產(chǎn)物——脂肪酸測定（2）遺傳特性分析（3）抗生素敏感性試驗（4）穩(wěn)定性試驗生產(chǎn)用菌種原始種子和主種子應凍干保存于8℃以下，工作種子應置于適宜溫度保存原始種子或主種子批還需進行以下檢查生產(chǎn)用菌種原始種子和主種子檢定微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定

檢定微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢菌粉檢定1.外觀2.目的菌檢查取少量菌粉加入適量滅菌生理氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液后，涂布在適宜瓊脂平皿上，在適宜條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)物的生長特性和染色鏡檢的特征應符合生產(chǎn)用菌種特征。3.雜菌檢查方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。如不符合規(guī)定應廢棄。4.干燥失重5.活菌數(shù)測定

測定每克菌粉中含有的活菌數(shù)量。方法見本總論附錄2。菌粉檢定1.外觀半成品的檢定半成品須做雜菌檢查，根據(jù)用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)控指標。方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。半成品的檢定半成品須做雜菌檢查，根據(jù)用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)成品檢定1.鑒別試驗

檢查成品中所含的目的菌是否符合生產(chǎn)用菌種的特性。即按上述“種子批的檢定”方法進行生長特性、染色鏡檢和生化反應檢查，應符合規(guī)定。2.理化檢查3.活菌數(shù)測定

按本總論附錄2方法測定每克制品中的活菌數(shù)，應符合規(guī)定。多價制品應分別測定各單價活菌數(shù)。4.雜菌檢查方法和結(jié)果判斷與半成品的“雜菌檢查”項相同。5.安全試驗（新版已刪除）成品檢定1.鑒別試驗附錄2微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測定法無菌稱取3.0g制品或菌粉（膠囊取內(nèi)容物），加入27.0ml稀釋液中，充分搖勻，做10倍系列稀釋（最終稀釋度根據(jù)不同的指標要求而定）。取最終稀釋度的菌液100μl，滴入選擇性瓊脂培養(yǎng)基平皿上，共做3個平皿，并以玻棒涂布均勻，置適宜條件下培養(yǎng)，到期觀察每個平皿菌落生長情況，并計數(shù)。當平皿菌落數(shù)小于10或大于300時，應調(diào)整最終稀釋度，重新測定。活菌數(shù)（CFU/g）=3個平皿菌落數(shù)之和/3*10*最終稀釋度附錄2微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測定法無菌稱取3.0g制品或菌粉附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法系檢查微生態(tài)活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。檢查項目包括控制菌檢查，非致病性雜菌、真菌計數(shù)。變更：項目2015版藥典2020版藥典雜菌檢查環(huán)境要求10000級下的局部潔凈度100級不低于D級背景下的B級細菌培養(yǎng)溫度30-37℃30-35℃真菌培養(yǎng)溫度20-28℃20-25℃附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法系檢附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：由于供試品本身含有大量活菌，可能在雜菌檢查所用的培養(yǎng)基上生長，干擾雜菌回收或結(jié)果判斷，在建立或修訂方法時應考慮其適用性，充分了解供試品活菌在雜菌檢查培養(yǎng)基上的生長特性。除本附錄收載的雜菌檢查用培養(yǎng)基之外，亦可采用其他經(jīng)驗證的培養(yǎng)基。附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：由于供試品本身含有大量附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：如果供試品本身對某些試驗菌具有較強的抑菌性能，影響試驗菌的回收。在此情況下，應根據(jù)原輔料的雜菌負載、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特性進行風險評估，保證檢驗方法的可靠性；在藥品生產(chǎn)、貯藏各個環(huán)節(jié)中，應嚴格遵循GMP的指導原則，以降低產(chǎn)品受雜菌污染的風險。附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：如果供試品本身對某些試附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：控制菌檢查法檢出意思致病菌時，可參考“微生物鑒定指導原則（通則9204）”的提示進行后續(xù)確證，確證的方法應選擇已被認可的菌種鑒定方法。附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：控制菌檢查法檢出意思致檢驗量及供試品的準備檢驗量，即一次試驗所用的供試品量（g）。檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中隨機抽取不少于3倍檢驗用量的供試品。菌粉、半成品以及成品為散劑和顆粒劑的可直接稱取備用；成品為片劑、膠囊劑的需研碎后備用。檢驗量及供試品的準備檢驗量，即一次試驗所用的供試品量（g）。供試品檢查陽性對照試驗供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。取陽性對照菌于相應選擇性培養(yǎng)基平皿上劃線接種，按供試品的控制菌檢查方法培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗取增菌液0.1ml，照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。控制菌檢查100μl供試品檢查控制菌檢查100μl大腸埃希氏菌；志賀菌、沙門菌；銅綠假單胞菌；金黃色葡萄球菌；梭菌；白色念珠菌；變更：項目2015版藥典2020版藥典增菌培養(yǎng)稱取供試品1g，加到9ml滅菌增菌液中稱取供試品1g，加到至少9ml滅菌增菌液中特異培養(yǎng)0.1ml100ul大腸埃希氏菌；變更：項目2015版藥典2020版藥典增菌培養(yǎng)大腸埃希氏菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中大腸埃希氏菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌；若生長的菌落與陽性對照的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應做革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或大腸埃希菌。供試品平皿上若有疑似菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌或制品中的目的菌；若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出大腸埃希菌大腸埃希氏菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中大腸志賀菌、沙門菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中志賀菌、沙門菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導供試品平皿培養(yǎng)24小時、48小時各觀察結(jié)果1次，若未見菌落生長，判供試品未檢出志賀菌、沙門菌；若有菌落生長，應與陽性對照的菌落比較，并做革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或志賀菌、沙門菌。若有疑似菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為志賀菌、沙門菌或制品中的目的菌；若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出志賀菌、沙門菌志賀菌、沙門菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中志銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中銅綠假單胞菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導如平皿上無菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌；如平皿生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選2-3個菌落，分別放在接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18-24小時。取斜面培養(yǎng)物進行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或銅綠假單胞菌供試品平皿上若有疑似菌落生長，取菌落分離、純化后采用氧化酶試驗及適宜的鑒定試驗，確證是否為制品中的目的菌或銅綠假單胞菌增加：若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中銅綠銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典銅綠假單胞菌檢測中氧化酶試驗斜面培養(yǎng)物分離純化培養(yǎng)物應進行綠膿菌素試驗應繼續(xù)進行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌刪除：綠膿菌素試驗銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典銅綠假單胞菌檢測金黃色葡萄球菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中金黃色葡萄球菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)特征不符，判未檢出金黃色葡萄球菌；若平皿上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選2-3個菌落，分別放在接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18-24小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進行革蘭氏染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時，做血漿凝固酶試驗。供試品平皿上若有疑似菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌或制品中的目的菌；若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌刪除：血漿凝固酶試驗金黃色葡萄球菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中金控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典2020版藥典細菌增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基真菌增菌培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌涉及檢驗培養(yǎng)基沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基試驗菌用量0.1ml100μl固體培養(yǎng)基促生長能力檢查每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿每種培養(yǎng)基每一試驗菌株平行制備2個平皿控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典202非致病性雜菌、真菌計數(shù)陽性對照除另有規(guī)定外，真菌以白色念珠菌為對照菌，其他以金黃色葡萄球菌為對照菌變更為：當采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基進行檢查時，真菌計數(shù)以白色念珠菌為對照菌，非致病雜菌計數(shù)以金黃色葡萄球菌為對照菌非致病性雜菌、真菌計數(shù)陽性對照因供試品為活菌制品，應選用能抑制目的菌生長的選擇性培養(yǎng)基進行檢查。除另有規(guī)定外，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于非致病性雜菌的計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計數(shù)。排除目的菌干擾的也可采用其它經(jīng)驗證的培養(yǎng)基因供試品為活菌制品，應選用能抑制目的菌生長的選擇性培養(yǎng)基進行真菌計數(shù)稱取供試品1g，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液中，混勻，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試品溶液0.1ml加到已備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，以玻棒涂勻，一式3份，倒置，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時，每天觀察結(jié)果，記錄平皿上生長的真菌菌落數(shù).結(jié)果計算：以3個平皿上生長的菌落平均數(shù)計算。真菌數(shù)（CFU/g）=3個平皿菌落數(shù)之和/3*10*稀釋倍數(shù)真菌計數(shù)稱取供試品1g，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液或計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典2020版藥典細菌增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基真菌增菌培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)溫度30-37℃30-35℃真菌培養(yǎng)溫度20-28℃20-25℃試驗菌用量0.1ml100μl結(jié)果判定被檢培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)相比大于70%被檢培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)的比值應在0.5-2范圍增加：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典2020版藥典三、9204微生物鑒定指導原則（變更）本指導原則為非無菌產(chǎn)品微生物限度控制菌檢查中疑似菌的鑒定，以及藥物原料、輔料、制藥用水、中間體中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品和環(huán)境等中檢出微生物的鑒定提供指導。當微生物的鑒定結(jié)果有爭議時，以《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》現(xiàn)行版的鑒定結(jié)果為準。三、9204微生物鑒定指導原則（變更）本指導原則為非無菌產(chǎn)微生物鑒定需達到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風險評估中，對所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學、細胞形態(tài)學（桿狀、球狀、細胞群、孢子形成模式等）、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應（如氧化酶、過氧化氫酶和凝固酶反應）進行分析，一般即可滿足需要；非無菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應達到種屬藥典規(guī)定的水平；無菌試驗結(jié)果陽性和、無菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗、環(huán)境嚴重異常事件時，對檢出的微生物鑒定至少達到種屬水平，必要時需達到菌株水平微生物鑒定需達到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時，一般先將待檢菌進行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定，根據(jù)所需達到的鑒定水平選擇鑒定方法。未知菌鑒定時通過與微生物鑒定系統(tǒng)中的標準參考微生物（模式菌株、標準菌株或經(jīng)確認的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配來完成在日常的微生物鑒定試驗中，用戶應明確所采用鑒定系統(tǒng)的局限性及所要達到的鑒定水平（屬、種、菌株），選用最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時采用多種鑒定方法確定。微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時，一般先將待檢待檢菌的分離純化最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，以獲取待檢菌的純培養(yǎng)物（單個菌落）,必要時可進一步進行純培養(yǎng)，為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量菌體。待檢菌的分離純化最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體初篩試驗常見的初篩試驗包括形態(tài)觀察、革蘭染色、芽孢染色、鏡檢（或氫氧化鉀拉絲試驗）、觀察染色結(jié)果和細胞形態(tài)、重要的生化反應等。氧化酶試驗用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。過氧化氫酶試驗用于區(qū)分葡萄球菌（過氧化氫酶陽性）和鏈球菌（過氧化氫酶陰性）。凝固酶試驗用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌（很可能為致病性）。初篩試驗常見的初篩試驗包括形態(tài)觀察、革蘭染色、芽孢染色、鏡檢表型微生物鑒定表型微生物鑒定表型微生物鑒定除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長條件等因素有關(guān)在表型鑒定時應注意采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)對鑒定結(jié)果的影響表型微生物鑒定除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、四、3605細菌生化反應培養(yǎng)基測定細菌的糖類代謝試驗、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗、碳源和氮源利用試驗等生化反應糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基七葉苷培養(yǎng)基磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（MR-VP反應）蛋白胨水培養(yǎng)基（靛基質(zhì)試驗）三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基克氏雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基脲（尿素）培養(yǎng)基苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基明膠培養(yǎng)基丙二酸鈉培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基硝酸鹽胨水培養(yǎng)基石蕊牛奶培養(yǎng)基半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基四、3605細菌生化反應培養(yǎng)基測定細菌的糖類代謝試驗、氨基五、細菌DNA特征序列鑒定法（新增）細菌DNA特征序列鑒定法系以特征核酸序列作為目標檢測物，用于藥用原料、輔料、制藥用水、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、包裝材料和環(huán)境等藥品全生命周期質(zhì)量控制中細菌的鑒定。開展細菌鑒定試驗的環(huán)境應具備分子生物學實驗室的基本條件，并符合相應級別的生物安全要求。五、細菌DNA特征序列鑒定法（新增）細菌DNA特征序六、1101《無菌檢查法》（變更）培養(yǎng)基的變更：制備好的培養(yǎng)基應保存在2～25℃、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/53，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。六、1101《無菌檢查法》（變更）培養(yǎng)基的變更：制備好的培培養(yǎng)基的適用性檢查無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應無菌生長。靈敏度檢查菌液制備：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)2～3天24～48小時，接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。培養(yǎng)基的適用性檢查無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支培養(yǎng)接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)不超過3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種小于不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)不超過5天。逐日觀察結(jié)果。結(jié)果判定

空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定培養(yǎng)接種薄膜過濾法薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾器，根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。濾膜直徑約為50mm，若使用其他尺寸的濾膜，應對稀釋液和沖洗液體積進行調(diào)整,并重新驗證。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。薄膜過濾法薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾器，根據(jù)供試品及水溶性液體供試品水溶性供試液過濾前應先將少量的沖洗液過濾，以潤濕濾膜。取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少于100ml適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。水溶性液體供試品水溶性供試液過濾前應先將少量的沖洗液過濾，以七、9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》為更好應用非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）及非無菌藥品微生物限度標準（通則1107），特制定本指導原則七、9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》為更好應供試液制備方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法應盡量選擇微生物計數(shù)方法中操作簡便、快速的方法，同時，所選用的方法應避免損傷供試品中污染的微生物。對照培養(yǎng)基由中國食品藥品檢定研究院研制及分發(fā)?？刂凭鷻z查法沒有規(guī)定進一步確證疑似致病菌的方法。若供試品檢出疑似致病菌，確證的方法應選擇已被認可的菌種鑒定方法，如細菌鑒定一般依據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》。藥品微生物限度標準中，藥用原料、輔料及中藥提取物僅規(guī)定檢查需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。因此，在制定其微生物限度標準時，應根據(jù)原輔料的微生物污染特性、用途、相應制劑的生產(chǎn)工藝及特性等因素，還需控制具有潛在危害的致病菌。供試液制備方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌八、1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：

微生物計數(shù)法微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應的微生物限度標準時，應按下述規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。微生物計數(shù)試驗環(huán)境應符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應定期進行監(jiān)測。如供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。八、1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：

微生物計數(shù)法微生物計數(shù)方法計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod，簡稱MPN法。MPN法用于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。計數(shù)方法計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應進行適用性檢查。供試品微生物計數(shù)方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應重新進行適用性試驗。供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應進行適用性檢查。供試品檢查檢驗量：一般應隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm2按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。陰性對照試驗以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調(diào)查。供試品檢查檢驗量：按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（九、1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：

控制菌檢查法控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應的微生物限度標準時，應按下列規(guī)定進行檢驗，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再復試。九、1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：

控制菌檢查法控制菌供試品檢查供試品的控制菌檢查應按經(jīng)方法適用性試驗確認的方法進行。陽性對照試驗陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應不大于100cfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調(diào)査。供試品檢查供試品的控制菌檢查應按經(jīng)方法適用性試驗確認的方法進檢驗項目

耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-TblerantGram-NegativeBacteria）大腸埃希菌（Escherichiacoli）沙門菌（Salmonella）銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）梭菌（Clostridia）白色念珠菌（Candidaalbicans）檢驗項目耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-TblerantGr十、1107非無菌藥品微生物限度標準十、1107非無菌藥品微生物限度標準十一、1421滅菌法滅菌法系指用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降至預期的無菌保證水平的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的滅菌。對于任何一批滅菌物品而言，絕對無菌既無法保證也無法用試驗來證實。一批物品的無菌特性只能相對地通過物品中活微生物的概率低至某個可接受的水平來表述，即無菌保證水平（sterilityassurancelevel，簡稱SAL）。實際生產(chǎn)過程中，滅菌是指將物品中污染微生物的概率下降至預期的無菌保證水平。最終滅菌的物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高于10-6。滅菌物品的無菌保證不能依賴于最終產(chǎn)品的無菌檢驗，而是取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、嚴格的GMP管理和良好的無菌保證體系十一、1421滅菌法滅菌法系指用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W手段將物品濕熱滅菌法該法滅菌能力強，為熱力滅菌中最有效、應用最廣泛的滅菌方法。濕熱滅菌條件的選擇應考慮被滅菌物品的熱穩(wěn)定性、熱穿透力、微生物污染程度等因素。濕熱滅菌條件通常采用121℃×15min、121℃×30min或116℃×40min的程序，也可采用其他溫度和時間參數(shù)，但無論采用何種滅菌溫度和時間參數(shù)，都必須證明所采用的滅菌工藝和監(jiān)控措施在日常運行過程中能確保物品滅菌后的SAL≤10-6。濕熱滅菌法該法滅菌能力強，為熱力滅菌中最有效、應用最廣泛的滅對熱穩(wěn)定的物品，滅菌工藝可首選過度殺滅法，以保證被滅菌物品獲得足夠的無菌保證值。采用濕熱滅菌時，被滅菌物品應有適當?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。濕熱滅菌法應確認滅菌柜在不同裝載時可能存在的冷點。當用生物指示劑進一步確認滅菌效果時，應將其置于冷點處。本法常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子濕熱滅菌法對熱穩(wěn)定的物品，滅菌工藝可首選過度殺滅法，以保證被滅菌物品獲干熱滅菌法干熱滅菌條件一般為（160~170℃）×120min以上、（170~180℃）×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其他溫度和時間參數(shù)。無論采用何種滅菌條件，均應保證滅菌后的物品的SAL≤10-6。采用干熱過度殺滅后的物品一般無需進行滅菌前污染微生物的測定。250℃×45min的干熱滅菌也可除去無菌產(chǎn)品包裝容器及有關(guān)生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子干熱滅菌法干熱滅菌條件一般為（160~170℃）×120mi十二、滅菌用生物指示劑指導原則（新增）生物指示劑是一種對特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定的耐受性的特殊微生物制成品，可用于滅菌設備的性能確認、特定物品的滅菌工藝研發(fā)及建立、產(chǎn)品滅菌程序的驗證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控、滅菌程序的定期再驗證、隔離器和無菌潔凈室滅菌效果的驗證評估等。十二、滅菌用生物指示劑指導原則（新增）生物指示劑是一種對特定生物指示劑的分類生物指示劑用微生物的基本要求不同滅菌工藝使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物應具備以下特征：（1）菌種的耐受性應大于需滅菌物品中所有可能污染菌的耐受性。（2）菌種應無致病性。（3）菌株應穩(wěn)定，存活期長，易于保存。（4）易于培養(yǎng)。生物指示劑的芽胞含量要在90%以上生物指示劑的制備生物指示劑的分類生物指示劑的應用生物指示劑的性能評估接收商品化生物指示劑時，應進行微生物純度和形態(tài)的鑒定及測定微生物數(shù)量。生物指示劑應在有效期內(nèi)使用，必要時應重新進行耐受性檢查。生物指示劑的應用生物指示劑的性能評估①芽胞數(shù)范圍在1.0×106至5.0×106。②芽胞數(shù)范圍在1.0×106至5.0×107。③芽胞數(shù)范圍在1.0×105至5.0×106①芽胞數(shù)范圍在1.0×106至5.0×106。用戶應科學的選擇和使用生物指示劑.在滅菌程序的建立、確定、驗證和日常監(jiān)控中,需對滅菌產(chǎn)品（包括其材料和包裝）進行全面了解,確保滅菌參數(shù)能達到所需的SAL水平。生物指示劑的初始微生物的數(shù)量、耐受性（菌體耐受性）和放置的位置、方式等情況都會影響其滅活效果。需通過實驗室研究確定產(chǎn)品各組成部分是否比產(chǎn)品內(nèi)的溶液或藥品更難滅菌。根據(jù)產(chǎn)品中最難滅菌的部位，制定不同的工藝參數(shù)以確保無菌保證水平小于10－6。用戶應科學的選擇和使用生物指示劑.在滅菌程序的建立、確定、驗十三、生物指示劑耐受性檢查法指導原則（新增）

本指導原則用于指導生物指示劑的耐受性以及相關(guān)質(zhì)量參數(shù)的測定，也可用于生產(chǎn)過程污染微生物的耐受性測定。總芽胞計數(shù):培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（芽孢懸液制備）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（芽孢計數(shù)）熱激活培養(yǎng)和計數(shù)生物指示劑的總芽胞數(shù)一般為標示值的50%～300%。十三、生物指示劑耐受性檢查法指導原則（新增）本2020版藥典微生物變更細則課件十四、9203《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則》藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則用于指導藥品微生物檢驗實驗室的質(zhì)量控制藥品微生物的檢驗結(jié)果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結(jié)果的可靠性，必須使用經(jīng)驗證的檢測方法并嚴格按照藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則要求進行檢驗。十四、9203《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則》藥品微藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則包括以下幾個方面：人員、培養(yǎng)基、試劑、菌種、環(huán)境、設備、樣品、檢驗方法、污染廢棄物處理、檢測結(jié)果質(zhì)量保證和檢測過程質(zhì)量控制、實驗記錄、結(jié)果的判斷和檢測報告、文件等。1、人員從事藥品微生物試驗工作的人員應具備微生物學或相近專業(yè)知識的教育背景藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則包括以下幾個方面：人員、培養(yǎng)2、培養(yǎng)基微生物實驗室使用的培養(yǎng)基可按處方配制，也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。結(jié)塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基不得使用。脫水培養(yǎng)基應完全溶解于水中，再行分裝與滅菌。應確定每批培養(yǎng)基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25℃測定）。若培養(yǎng)基處方中未列出pH值的范圍，除非經(jīng)驗證表明培養(yǎng)基的pH值允許的變化范圍很寬，否則，pH值的范圍不能超過規(guī)定值±0.2。自配的培養(yǎng)基應標記名稱、批號、配制日期、制備人等信息，并在已驗證的條件下貯藏。商品化的成品培養(yǎng)基標簽上應標有名稱、批號、生產(chǎn)日期、失效期及培養(yǎng)基的有關(guān)特性。培養(yǎng)基滅菌后不得貯藏在高壓滅菌器中，瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放。2、培養(yǎng)基微生物實驗室使用的培養(yǎng)基可按處方配制，也可使用按處2、培養(yǎng)基使用過的培養(yǎng)基（包括失效的培養(yǎng)基）應按照國家污染廢物處理相關(guān)規(guī)定進行實驗室配制或商品化的成品培養(yǎng)基的質(zhì)量依賴于其制備過程，常規(guī)監(jiān)控項目是pH值、適用性檢查試驗，定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期除藥典附錄另有規(guī)定外，在實驗室中，若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查試驗可只進行1次。如果培養(yǎng)基的制備過程未經(jīng)驗證，那么每一滅菌批培養(yǎng)基均要進行適用性檢查試驗。用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基須特別防護，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養(yǎng)基，那么在使用前應進行100%的預培養(yǎng)以防止外來的污染物帶到環(huán)境中及避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。2、培養(yǎng)基使用過的培養(yǎng)基（包括失效的培養(yǎng)基）應按照國家污染廢3、試劑微生物實驗室應有試劑接收、檢查和貯藏的程序。實驗室應標明所有試劑、試液及溶液的名稱、制備依據(jù)、適用性、濃度、效價、貯藏條件、制備日期、有效期及制備人。3、試劑微生物實驗室應有試劑接收、檢查和貯藏的程序。4、菌種藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構(gòu)的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株4、菌種藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內(nèi)或國外菌種保5、環(huán)境微生物限度檢查應在不低于D級背景下的B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行環(huán)境監(jiān)測按藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則（通則9205）進行所用的消毒劑種類應滿足潔凈實驗室相關(guān)要求并定期更換。5、環(huán)境微生物限度檢查應在不低于D級背景下的B級單向流空氣區(qū)6、設備儀器設備應有合格證書，實驗室在儀器設備完成相應的檢定、校準、驗證、確認其性能，并形成相應的操作、維護和保養(yǎng)的標準操作規(guī)程后方可正式使用，儀器設備使用和日常監(jiān)控要有記錄。6、設備儀器設備應有合格證書，實驗室在儀器設備完成相應的檢定7、樣品試驗樣品的采集，應遵循隨機抽樣的原則，并在受控條件下進行抽樣，須采用無菌操作技術(shù)進行取樣，防止樣品受到微生物污染而導致假陽性的結(jié)果抽樣容器應貼有唯一性的標識，注明樣品名稱、批號、抽樣日期、采樣容器、抽樣人等如果樣品存在數(shù)量不足、包裝破損、標簽缺失、溫度不適等，實驗室應在決定是否檢測或拒絕接受樣品之前與相關(guān)人員溝通。7、樣品試驗樣品的采集，應遵循隨機抽樣的原則，并在受控條件下8、檢驗方法藥典方法或標準中規(guī)定的方法是經(jīng)過驗證的，當進行樣品檢驗時，應進行方法適用性確認。如果檢驗方法不是藥典或標準中規(guī)定的方法，使用前應進行替代方法的驗證，確認其應用效果優(yōu)于或等同于藥典方法。替代方法的驗證按藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則（通則9201）進行。8、檢驗方法藥典方法或標準中規(guī)定的方法是經(jīng)過驗證的，當進行樣9、結(jié)果的判斷和檢測報告引起微生物污染結(jié)果不符合標準的原因主要有兩個：試驗操作錯誤或產(chǎn)生無效結(jié)果的試驗環(huán)境條件；產(chǎn)品本身的微生物污染總數(shù)超過規(guī)定的限度或檢出控制菌。異常結(jié)果出現(xiàn)時，應進行偏差調(diào)查。偏差調(diào)查時應考慮實驗室環(huán)境、抽樣區(qū)的防護條件、樣品在該檢驗條件下以往檢驗的情況、樣品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情況。如果試驗操作被確認是引起實驗結(jié)果不符合的原因，那么應制定糾正和預防措施，按照正確的操作方案進行實驗9、結(jié)果的判斷和檢測報告引起微生物污染結(jié)果不符合標準的原因主十五、9205《藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則》（變更）本指導原則是用于指導藥品微生物檢驗用的潔凈室等受控環(huán)境微生物污染情況的監(jiān)測和控制。本指導原則包括人員要求、初次使用的潔凈實驗室參數(shù)確認、微生物監(jiān)測方法、監(jiān)測頻次及監(jiān)測項目、監(jiān)測標準、警戒限和糾偏限、數(shù)據(jù)分析及偏差處理、微生物鑒定和微生物控制。十五、9205《藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則》確認初次使用的潔凈實驗室應進行參數(shù)確認，確認參數(shù)包括物理參數(shù)、空氣懸浮粒子和微生物。藥品潔凈實驗室物理參數(shù)的測試應當在微生物監(jiān)測方案實施之前進行。主要的物理參數(shù)包括高效空氣過濾器完整性、氣流組織、空氣流速（平均風速），換氣次數(shù)、壓差、溫度和相對濕度等。一般首先在靜態(tài)下測試，符合要求后再在模擬正常檢測條件下進行測試確認初次使用的潔凈實驗室應進行參數(shù)確認，確認參數(shù)包括物理參數(shù)2020版藥典微生物變更細則課件物理參數(shù)測試方法參照《潔凈室施工及驗收規(guī)范》的現(xiàn)行國家標準中附錄D3高效空氣過濾器現(xiàn)場掃描檢漏方法、附錄E12氣流的檢測、附錄E1風量和風速的檢測、附錄E2靜壓差的檢測、附錄E5溫濕度的檢測進行。初次使用的潔凈實驗室其空氣懸浮粒子和微生物的確認及監(jiān)測照以下“監(jiān)測”進行。物理參數(shù)測試方法參照《潔凈室施工及驗收規(guī)范》的現(xiàn)行國家標準中監(jiān)測藥品潔凈實驗室應定期進行日常監(jiān)測和定期微生物監(jiān)測，日常監(jiān)測一般包括壓差、溫度、相對濕度等；定期監(jiān)測應在風險評估的基礎上建立潔凈環(huán)境監(jiān)測計劃。定期監(jiān)測內(nèi)容包括物理參數(shù)、非生物活性的空氣懸浮粒子和有生物活性的微生物監(jiān)測，其中微生物監(jiān)測包括環(huán)境浮游菌和沉降菌監(jiān)測，及關(guān)鍵的檢測臺面、人員操作服表面及5指手套等的微生物檢測。當微生物監(jiān)測結(jié)果或樣品測定結(jié)果產(chǎn)生偏離，經(jīng)評估潔凈區(qū)可能存在被污染的風險時，應對潔凈區(qū)進行清潔消毒后重新進行監(jiān)測監(jiān)測藥品潔凈實驗室應定期進行日常監(jiān)測和定期微生物監(jiān)測，日常監(jiān)懸浮粒子監(jiān)測增加：懸浮粒子監(jiān)測方法除取樣點的選擇和數(shù)量、取樣量和取樣時間外，藥品潔凈實驗室懸浮粒子的監(jiān)測參考《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮粒子的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行。懸浮粒子監(jiān)測增加：懸浮粒子監(jiān)測方法微生物監(jiān)測藥品潔凈實驗室沉降菌的監(jiān)測照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行；浮游菌的監(jiān)測照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行,浮游菌采樣器可選擇撞擊式采樣器或濾膜式采樣器等表面微生物測定是對環(huán)境、設備和人員的表面微生物進行監(jiān)測，方法包括接觸碟法和擦拭法微生物監(jiān)測藥品潔凈實驗室沉降菌的監(jiān)測照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）環(huán)境浮游菌、沉降菌及表面微生物監(jiān)測用培養(yǎng)基一般采用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），培養(yǎng)溫度為30℃～35℃，時間為3～5天，必要時可加入適宜的中和劑，。當監(jiān)測結(jié)果有疑似真菌或考慮季節(jié)因素影響時，可增加沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)，培養(yǎng)溫度為20℃～25℃，時間為5～7天。如需要，應根據(jù)環(huán)境污染微生物種群特性選擇特定的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。環(huán)境浮游菌、沉降菌及表面微生物監(jiān)測用培養(yǎng)基一般采用胰酪大豆胨藥品潔凈實驗室的監(jiān)測頻次及監(jiān)測項目注：①每月一次。②工作臺面沉降菌的日常監(jiān)測采樣點數(shù)不少于3個，且每個采樣點的平皿數(shù)應不小于1個。③每季度一次。④每半年一次。①②③③④④④藥品潔凈實驗室的監(jiān)測頻次及監(jiān)測項目注：①每月一次。②工作臺各潔凈級別環(huán)境微生物監(jiān)測的動態(tài)標準①各潔凈級別環(huán)境微生物監(jiān)測的動態(tài)標準①警戒限和糾偏限

藥品潔凈實驗室應根據(jù)歷史數(shù)據(jù)，結(jié)合不同潔凈區(qū)域的標準，采用適宜的方法，制定適當?shù)奈⑸锉O(jiān)測警戒限和糾偏限。微生物鑒定微生物鑒定參照微生物鑒定指導原則（通則9204）進行警戒限和糾偏限藥品潔凈實驗室應根據(jù)歷史數(shù)據(jù)，結(jié)微生物控制為了保證藥品潔凈實驗室環(huán)境維持適當?shù)乃?，應保持空調(diào)系統(tǒng)的良好運行狀態(tài)，對設施進行良好維護，潔凈室內(nèi)人員應嚴格遵守良好的行為規(guī)范，并定期進行環(huán)境監(jiān)測。微生物控制措施還包括良好的清潔和衛(wèi)生處理，應定期對藥品潔凈實驗室進行清潔和消毒，應監(jiān)測消毒劑和清潔劑的微生物污染狀況，并在規(guī)定的有效期內(nèi)使用，A/B級潔凈區(qū)應使用無菌的或經(jīng)無菌處理的消毒劑和清潔劑。所采用的化學消毒劑應經(jīng)過驗證或有證據(jù)表明其消毒效果，其種類應當多于一種，并定期進行更換以防止產(chǎn)生耐受菌株。不得用紫外線消毒代替化學消毒。必要時，可采用氣體、熏蒸等適宜的方法降低潔凈區(qū)的衛(wèi)生死角的微生物污染，并對熏蒸劑消毒劑的殘留水平進行驗證微生物控制為了保證藥品潔凈實驗室環(huán)境維持適當?shù)乃剑瑧３挚罩x謝！2020版藥典微生物變更細則課件新版藥典變更解讀

——微生物相關(guān)

分析質(zhì)檢中心微生物組

2020年05月

新版藥典變更解讀

——微生物相關(guān)

涉及內(nèi)容藥典三部：生物制品通則：《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》總論：《微生態(tài)活菌制品總論》（變更）涉及內(nèi)容藥典三部：通則1101《無菌檢查法》（變更）1105《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》1106《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法》1107《非無菌藥品微生物限度標準》3605《細菌生化反應培養(yǎng)基》1421《滅菌法》

通則1101《無菌檢查法》（變更）9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》9203《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則》9204《微生物鑒定指導原則》（變更）9205《藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則》（變更）通則9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》通則新增滅菌用生物指示劑指導原則（新增）生物指示劑耐受性檢查法指導原則（新增）細菌DNA特征序列鑒定法（新增）新增滅菌用生物指示劑指導原則（新增）一、《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》菌毒種，系指直接用于制造和檢定生物制品的細菌、支原體、立克次體或病毒等生產(chǎn)和檢定用菌毒種，來源途徑應合法，并經(jīng)國務院藥品監(jiān)督管理部門批準。微生物檢測用菌來源：CMCC:中國醫(yī)學細菌保藏管理中心CICC:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心ATCC:美國微生物菌株保藏中心一、《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》菌毒種，系指直接用于生物制品生產(chǎn)用菌毒種應采用種子批系統(tǒng)。每批主種子批和工作種子批均應按各論要求保管、檢定和使用。菌毒種的傳代及檢定實驗室應符合國家生物安全的相關(guān)規(guī)定。各生產(chǎn)單位質(zhì)量管理部門對本單位的菌毒種施行統(tǒng)一管理。生物制品生產(chǎn)用菌毒種應采用種子批系統(tǒng)。每批主種子批和工作種子保管菌毒種應有嚴格的登記制度，建立詳細的總賬及分類賬。收到菌毒種后應立即進行編號登記，詳細記錄菌毒種的學名、株名、歷史、來源、特性、用途、批號、傳代凍干日期和數(shù)量。在保管過程中，凡傳代、凍干及分發(fā)，記錄均應清晰，可追溯，并定期核對庫存數(shù)量。收到菌毒種后一般應及時進行檢定。用培養(yǎng)基保存的菌種應立即檢定保管菌毒種應有嚴格的登記制度，建立詳細的總賬及分類賬。收到菌生產(chǎn)用菌毒種應按各論要求進行檢定銷毀四類菌毒種須經(jīng)單位領導批準。銷毀后應在賬上注銷，作出專項記錄，寫明銷毀原因、方式和日期。生產(chǎn)用菌毒種應按各論要求進行檢定銷毀四類菌毒種須經(jīng)單位領導批二、微生態(tài)活菌制品總論微生態(tài)活菌制品必須由非致病的活細菌組成，無論在生產(chǎn)過程、制品貯存和使用期間均應保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)。它可由一株、多株或幾種細菌制成單價或多價聯(lián)合制劑。根據(jù)其不同的使用途徑和方法可制備成片劑、膠囊顆粒劑或散劑等多種劑型?；疽螅何⑸鷳B(tài)活菌制品的制備方法、工藝應能保證成品含有足夠的活菌數(shù)量，保持其穩(wěn)定性，同時應防止外源因子的污染。生產(chǎn)和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關(guān)要求。二、微生態(tài)活菌制品總論微生態(tài)活菌制品必須由非致病的活細菌組成生產(chǎn)用菌種生產(chǎn)用菌種應符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定名稱及來源；種子批的建立：三級種子批應分別凍干，置適宜溫度保存；種子批傳代應限定傳代次數(shù)，原始種子批和主種子批啟開后傳代次數(shù)不得超過10代，工作種子批啟開后至發(fā)酵培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過5代。生產(chǎn)用菌種生產(chǎn)用菌種應符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程生產(chǎn)用菌種種子批的檢定：應依據(jù)最新版伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊和伯杰氏細菌命名手冊的有關(guān)規(guī)定進行，形態(tài)、生長代謝特性檢查。原始種子或主種子還應做遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。三級種子批常規(guī)檢查包括以下3項：（1）培養(yǎng)特性及染色鏡檢；（2）生化反應；（3）毒性試驗生產(chǎn)用菌種種子批的檢定：應依據(jù)最新版伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊和原始種子或主種子批還需進行以下檢查（1）細菌代謝產(chǎn)物——脂肪酸測定（2）遺傳特性分析（3）抗生素敏感性試驗（4）穩(wěn)定性試驗生產(chǎn)用菌種原始種子和主種子應凍干保存于8℃以下，工作種子應置于適宜溫度保存原始種子或主種子批還需進行以下檢查生產(chǎn)用菌種原始種子和主種子檢定微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定

檢定微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢菌粉檢定1.外觀2.目的菌檢查取少量菌粉加入適量滅菌生理氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液后，涂布在適宜瓊脂平皿上，在適宜條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)物的生長特性和染色鏡檢的特征應符合生產(chǎn)用菌種特征。3.雜菌檢查方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。如不符合規(guī)定應廢棄。4.干燥失重5.活菌數(shù)測定

測定每克菌粉中含有的活菌數(shù)量。方法見本總論附錄2。菌粉檢定1.外觀半成品的檢定半成品須做雜菌檢查，根據(jù)用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)控指標。方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。半成品的檢定半成品須做雜菌檢查，根據(jù)用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)成品檢定1.鑒別試驗

檢查成品中所含的目的菌是否符合生產(chǎn)用菌種的特性。即按上述“種子批的檢定”方法進行生長特性、染色鏡檢和生化反應檢查，應符合規(guī)定。2.理化檢查3.活菌數(shù)測定

按本總論附錄2方法測定每克制品中的活菌數(shù)，應符合規(guī)定。多價制品應分別測定各單價活菌數(shù)。4.雜菌檢查方法和結(jié)果判斷與半成品的“雜菌檢查”項相同。5.安全試驗（新版已刪除）成品檢定1.鑒別試驗附錄2微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測定法無菌稱取3.0g制品或菌粉（膠囊取內(nèi)容物），加入27.0ml稀釋液中，充分搖勻，做10倍系列稀釋（最終稀釋度根據(jù)不同的指標要求而定）。取最終稀釋度的菌液100μl，滴入選擇性瓊脂培養(yǎng)基平皿上，共做3個平皿，并以玻棒涂布均勻，置適宜條件下培養(yǎng)，到期觀察每個平皿菌落生長情況，并計數(shù)。當平皿菌落數(shù)小于10或大于300時，應調(diào)整最終稀釋度，重新測定?；罹鷶?shù)（CFU/g）=3個平皿菌落數(shù)之和/3*10*最終稀釋度附錄2微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測定法無菌稱取3.0g制品或菌粉附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法系檢查微生態(tài)活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。檢查項目包括控制菌檢查，非致病性雜菌、真菌計數(shù)。變更：項目2015版藥典2020版藥典雜菌檢查環(huán)境要求10000級下的局部潔凈度100級不低于D級背景下的B級細菌培養(yǎng)溫度30-37℃30-35℃真菌培養(yǎng)溫度20-28℃20-25℃附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法系檢附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：由于供試品本身含有大量活菌，可能在雜菌檢查所用的培養(yǎng)基上生長，干擾雜菌回收或結(jié)果判斷，在建立或修訂方法時應考慮其適用性，充分了解供試品活菌在雜菌檢查培養(yǎng)基上的生長特性。除本附錄收載的雜菌檢查用培養(yǎng)基之外，亦可采用其他經(jīng)驗證的培養(yǎng)基。附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：由于供試品本身含有大量附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：如果供試品本身對某些試驗菌具有較強的抑菌性能，影響試驗菌的回收。在此情況下，應根據(jù)原輔料的雜菌負載、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特性進行風險評估，保證檢驗方法的可靠性；在藥品生產(chǎn)、貯藏各個環(huán)節(jié)中，應嚴格遵循GMP的指導原則，以降低產(chǎn)品受雜菌污染的風險。附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：如果供試品本身對某些試附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：控制菌檢查法檢出意思致病菌時，可參考“微生物鑒定指導原則（通則9204）”的提示進行后續(xù)確證，確證的方法應選擇已被認可的菌種鑒定方法。附錄3微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法新增：控制菌檢查法檢出意思致檢驗量及供試品的準備檢驗量，即一次試驗所用的供試品量（g）。檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中隨機抽取不少于3倍檢驗用量的供試品。菌粉、半成品以及成品為散劑和顆粒劑的可直接稱取備用；成品為片劑、膠囊劑的需研碎后備用。檢驗量及供試品的準備檢驗量，即一次試驗所用的供試品量（g）。供試品檢查陽性對照試驗供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。取陽性對照菌于相應選擇性培養(yǎng)基平皿上劃線接種，按供試品的控制菌檢查方法培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗取增菌液0.1ml，照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。控制菌檢查100μl供試品檢查控制菌檢查100μl大腸埃希氏菌；志賀菌、沙門菌；銅綠假單胞菌；金黃色葡萄球菌；梭菌；白色念珠菌；變更：項目2015版藥典2020版藥典增菌培養(yǎng)稱取供試品1g，加到9ml滅菌增菌液中稱取供試品1g，加到至少9ml滅菌增菌液中特異培養(yǎng)0.1ml100ul大腸埃希氏菌；變更：項目2015版藥典2020版藥典增菌培養(yǎng)大腸埃希氏菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中大腸埃希氏菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌；若生長的菌落與陽性對照的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應做革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或大腸埃希菌。供試品平皿上若有疑似菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌或制品中的目的菌；若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出大腸埃希菌大腸埃希氏菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中大腸志賀菌、沙門菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中志賀菌、沙門菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導供試品平皿培養(yǎng)24小時、48小時各觀察結(jié)果1次，若未見菌落生長，判供試品未檢出志賀菌、沙門菌；若有菌落生長，應與陽性對照的菌落比較，并做革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或志賀菌、沙門菌。若有疑似菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為志賀菌、沙門菌或制品中的目的菌；若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出志賀菌、沙門菌志賀菌、沙門菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中志銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中銅綠假單胞菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導如平皿上無菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌；如平皿生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選2-3個菌落，分別放在接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18-24小時。取斜面培養(yǎng)物進行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或銅綠假單胞菌供試品平皿上若有疑似菌落生長，取菌落分離、純化后采用氧化酶試驗及適宜的鑒定試驗，確證是否為制品中的目的菌或銅綠假單胞菌增加：若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中銅綠銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典銅綠假單胞菌檢測中氧化酶試驗斜面培養(yǎng)物分離純化培養(yǎng)物應進行綠膿菌素試驗應繼續(xù)進行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌刪除：綠膿菌素試驗銅綠假單胞菌項目2015版藥典2020版藥典銅綠假單胞菌檢測金黃色葡萄球菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中金黃色葡萄球菌結(jié)果判定及下一步鑒定指導供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)特征不符，判未檢出金黃色葡萄球菌；若平皿上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選2-3個菌落，分別放在接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18-24小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進行革蘭氏染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時，做血漿凝固酶試驗。供試品平皿上若有疑似菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌或制品中的目的菌；若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌刪除：血漿凝固酶試驗金黃色葡萄球菌項目2015版藥典2020版藥典供試品檢查中金控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典2020版藥典細菌增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基真菌增菌培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌涉及檢驗培養(yǎng)基沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基試驗菌用量0.1ml100μl固體培養(yǎng)基促生長能力檢查每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿每種培養(yǎng)基每一試驗菌株平行制備2個平皿控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典202非致病性雜菌、真菌計數(shù)陽性對照除另有規(guī)定外，真菌以白色念珠菌為對照菌，其他以金黃色葡萄球菌為對照菌變更為：當采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基進行檢查時，真菌計數(shù)以白色念珠菌為對照菌，非致病雜菌計數(shù)以金黃色葡萄球菌為對照菌非致病性雜菌、真菌計數(shù)陽性對照因供試品為活菌制品，應選用能抑制目的菌生長的選擇性培養(yǎng)基進行檢查。除另有規(guī)定外，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于非致病性雜菌的計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計數(shù)。排除目的菌干擾的也可采用其它經(jīng)驗證的培養(yǎng)基因供試品為活菌制品，應選用能抑制目的菌生長的選擇性培養(yǎng)基進行真菌計數(shù)稱取供試品1g，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液中，混勻，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試品溶液0.1ml加到已備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，以玻棒涂勻，一式3份，倒置，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時，每天觀察結(jié)果，記錄平皿上生長的真菌菌落數(shù).結(jié)果計算：以3個平皿上生長的菌落平均數(shù)計算。真菌數(shù)（CFU/g）=3個平皿菌落數(shù)之和/3*10*稀釋倍數(shù)真菌計數(shù)稱取供試品1g，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液或計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典2020版藥典細菌增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基真菌增菌培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)溫度30-37℃30-35℃真菌培養(yǎng)溫度20-28℃20-25℃試驗菌用量0.1ml100μl結(jié)果判定被檢培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)相比大于70%被檢培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基的菌落平均數(shù)的比值應在0.5-2范圍增加：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查變更:項目2015版藥典2020版藥典三、9204微生物鑒定指導原則（變更）本指導原則為非無菌產(chǎn)品微生物限度控制菌檢查中疑似菌的鑒定，以及藥物原料、輔料、制藥用水、中間體中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品和環(huán)境等中檢出微生物的鑒定提供指導。當微生物的鑒定結(jié)果有爭議時，以《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》現(xiàn)行版的鑒定結(jié)果為準。三、9204微生物鑒定指導原則（變更）本指導原則為非無菌產(chǎn)微生物鑒定需達到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風險評估中，對所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學、細胞形態(tài)學（桿狀、球狀、細胞群、孢子形成模式等）、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應（如氧化酶、過氧化氫酶和凝固酶反應）進行分析，一般即可滿足需要；非無菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應達到種屬藥典規(guī)定的水平；無菌試驗結(jié)果陽性和、無菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗、環(huán)境嚴重異常事件時，對檢出的微生物鑒定至少達到種屬水平，必要時需達到菌株水平微生物鑒定需達到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時，一般先將待檢菌進行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定，根據(jù)所需達到的鑒定水平選擇鑒定方法。未知菌鑒定時通過與微生物鑒定系統(tǒng)中的標準參考微生物（模式菌株、標準菌株或經(jīng)確認的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配來完成在日常的微生物鑒定試驗中，用戶應明確所采用鑒定系統(tǒng)的局限性及所要達到的鑒定水平（屬、種、菌株），選用最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時采用多種鑒定方法確定。微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時，一般先將待檢待檢菌的分離純化最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，以獲取待檢菌的純培養(yǎng)物（單個菌落）,必要時可進一步進行純培養(yǎng)，為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量菌體。待檢菌的分離純化最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體初篩試驗常見的初篩試驗包括形態(tài)觀察、革蘭染色、芽孢染色、鏡檢（或氫氧化鉀拉絲試驗）、觀察染色結(jié)果和細胞形態(tài)、重要的生化反應等。氧化酶試驗用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。過氧化氫酶試驗用于區(qū)分葡萄球菌（過氧化氫酶陽性）和鏈球菌（過氧化氫酶陰性）。凝固酶試驗用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌（很可能為致病性）。初篩試驗常見的初篩試驗包括形態(tài)觀察、革蘭染色、芽孢染色、鏡檢表型微生物鑒定表型微生物鑒定表型微生物鑒定除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長條件等因素有關(guān)在表型鑒定時應注意采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)對鑒定結(jié)果的影響表型微生物鑒定除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、四、3605細菌生化反應培養(yǎng)基測定細菌的糖類代謝試驗、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗、碳源和氮源利用試驗等生化反應糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基七葉苷培養(yǎng)基磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（MR-VP反應）蛋白胨水培養(yǎng)基（靛基質(zhì)試驗）三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基克氏雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基脲（尿素）培養(yǎng)基苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基明膠培養(yǎng)基丙二酸鈉培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基硝酸鹽胨水培養(yǎng)基石蕊牛奶培養(yǎng)基半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基四、3605細菌生化反應培養(yǎng)基測定細菌的糖類代謝試驗、氨基五、細菌DNA特征序列鑒定法（新增）細菌DNA特征序列鑒定法系以特征核酸序列作為目標檢測物，用于藥用原料、輔料、制藥用水、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、包裝材料和環(huán)境等藥品全生命周期質(zhì)量控制中細菌的鑒定。開展細菌鑒定試驗的環(huán)境應具備分子生物學實驗室的基本條件，并符合相應級別的生物安全要求。五、細菌DNA特征序列鑒定法（新增）細菌DNA特征序六、1101《無菌檢查法》（變更）培養(yǎng)基的變更：制備好的培養(yǎng)基應保存在2～25℃、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/53，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。六、1101《無菌檢查法》（變更）培養(yǎng)基的變更：制備好的培培養(yǎng)基的適用性檢查無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應無菌生長。靈敏度檢查菌液制備：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)2～3天24～48小時，接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。培養(yǎng)基的適用性檢查無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支培養(yǎng)接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)不超過3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種小于不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)不超過5天。逐日觀察結(jié)果。結(jié)果判定

空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定培養(yǎng)接種薄膜過濾法薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾器，根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。濾膜直徑約為50mm，若使用其他尺寸的濾膜，應對稀釋液和沖洗液體積進行調(diào)整,并重新驗證。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。薄膜過濾法薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾器，根據(jù)供試品及水溶性液體供試品水溶性供試液過濾前應先將少量的沖洗液過濾，以潤濕濾膜。取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少于100ml適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。水溶性液體供試品水溶性供試液過濾前應先將少量的沖洗液過濾，以七、9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》為更好應用非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）及非無菌藥品微生物限度標準（通則1107），特制定本指導原則七、9202《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則》為更好應供試液制備方法、抑