茉莉酸甲酯對丹參莖葉丹酚酸和丹酚酸B含量的影響

茉莉酸甲酯對丹參莖葉丹酚酸和丹酚酸B含量的影響【摘要】目的討論茉莉酸甲酯(ethyjasnat,J)對栽培丹參的藥效成分影響，并為丹參地上局部的開發(fā)利用提供一定的研究根據(jù)。方法采用比色法和HPL法，以丹酚酸和丹酚酸B為檢測指標(biāo)，對茉莉酸甲酯處理的丹參莖葉樣品進(jìn)展檢測。結(jié)果丹參種苗經(jīng)茉莉酸甲酯噴施處理后的48h內(nèi)，其莖葉中丹酚酸和丹酚酸B含量均高于對照，在所測試范圍5×10-9～5×10-3的濃度中，隨濃度的升高而含量增加。結(jié)論外施茉莉酸甲酯能促進(jìn)丹參莖葉中的丹酚酸和丹酚酸B含量的積累，可以考慮在消費中加以應(yīng)用，并注意今后在丹參的種植及采收中地上局部的利用?！娟P(guān)鍵詞】丹參茉莉酸甲酯丹酚酸丹酚酸BAbstrat：bjetiveTstudytheeffetfethyljasnate〔J〕nediinepsitinfultivarSalviailtirrhiza，andprvidesereferenefrtheexplitatinandutilizatinftheleavesandstesinSalviailtirrhiza.ethdsTheleavesandstesfSalviailtirrhizaeretreatedithJ,thententsfsalvianliaidandsalvianliaidBereassayedbytheethdsflrietryandHPL.Resultsithinthenentratinf5×10-9～5×10-3g/L,thententsfthesalvianliaidandsalvianliaidBinSalviailtirrhizatreatedbyJerehigherthanthseinntrl,andinreasedhilethenentratinfJinreased.nlusinThententsfthesalvianliaidandsalvianliaidBintheleavesandstesfSalviailtirrhizaanbeprtedbyJ,andutlizatininultivatedplantingfSalviailtirrhizashuldbensidered.Keyrds：SalviailtirrhizaBge.；ethyljasnate；Salvianliaid；SalvianliaidB丹參SalviailtirrhizaBge.為唇形科植物丹參的枯燥根及根莖，其有效成分包括水溶性和脂溶性兩大類。脂溶性成分主要是二萜醌類化合物〔包括丹參酮、隱丹參酮等〕，水溶性成分主要為酚酸類化合物［包括丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸(salvianliaidA、B等〕］。丹參的水溶性酚酸類化合物，引起了醫(yī)藥學(xué)家的極大重視，也由于丹參的傳統(tǒng)應(yīng)用方式為水煎液，近些年來，對于其水溶性酚酸類化合物的研究較多［1，2］。丹酚酸B是目前研究較多的丹酚酸之一，在治療心血管疾并慢性肝炎，抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化和改善記憶功能障礙等方面發(fā)揮著重要作用［3］。最新研究說明，丹參葉中的酚酸類含量與根中相似，有些甚至高于根部［4，5］。茉莉酸甲酯〔J〕是植物響應(yīng)病原物、害蟲等多種環(huán)境脅迫的共同信號分子，廣泛存在于高等植物體內(nèi)，并作為新型的植物激素，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、光合作用、抗逆反響等方面起著重要的作用，外施到植物體可以到達(dá)一定的逆境脅迫和調(diào)節(jié)效應(yīng)［6，7］。有報道外源性J類化合物能有效刺激植物次生代謝物的生物合成，可引起多種植物次消費物的迅速積累［8］。目前有利用J研究誘導(dǎo)丹參毛狀根中的有效成分的積累的報道［8］，本研究旨在利用J作為誘導(dǎo)子,在丹參的消費中進(jìn)展田間噴施實驗，探究J對丹酚酸B的調(diào)控機制,以及J在丹參消費中的應(yīng)用及丹參地上局部的進(jìn)一步合理開發(fā)提供研究根據(jù)。1材料供試材料為丹參SalviailtirrhizaBge種苗,購于山東菏澤丹參種植基地，茉莉酸甲酯〔J〕為美國Siga公司產(chǎn)品。實驗地位于廣東藥學(xué)院大學(xué)城校區(qū)藥用植物實驗園。2方法2.1實驗設(shè)計及處理實驗設(shè)5個處理：〔Ⅰ〕對照〔丹參噴清水〕；〔Ⅱ〕噴施J5×10-9l/L；〔Ⅲ〕噴施J5×10-7l/L；〔Ⅳ〕噴施J5×10-5l/L；〔Ⅴ〕噴施J5×10-3l/L。小區(qū)面積12，4次重復(fù)，隨機區(qū)組實驗設(shè)計。J和清水均在出齊三片復(fù)葉時噴施，將配好的各種濃度的J溶液用噴壺均勻地噴到對應(yīng)各組葉片上，以噴滿全部葉片為度，噴后立即套上保鮮袋。噴施后48h取樣，取每株苗的全部小葉片，將葉置60℃烘干箱烘6h，取出粉碎，過50目篩后用棕色廣口瓶保存。2.2丹參總酚酸含量測定2.2.1原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)曲線制定精細(xì)稱取原兒茶醛8.50g，加水溶解并定容至20l〔425μg/l)，作為對照品溶液。分別精細(xì)汲取原兒茶醛對照品液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0l加水至2l，分別加0.5%NaN25.0l放置5in，參加10%Al(N3)30.5l，放置5in，參加1l/LNaH液5.0l，放置10in后，以顯色劑為空白，在500n處測得吸光值。以濃度X為橫坐標(biāo)，吸光值Y為縱坐標(biāo)，方程為Y=0.0014X+0.0004，r=0.9991，線性范圍為26～130μg/l。2.2.2總酚酸的測定精細(xì)稱取樣品粉末0.2g，置50l容量瓶中，加2%鹽酸水溶液約12l，浸泡15h，加酸水補足量，振搖10in，經(jīng)枯燥濾紙過濾，棄去初濾液，精細(xì)量取續(xù)濾液5l，置分液漏斗中，加Nal0.5g，醋酸乙酯萃取3次，5l/次，水浴蒸干，殘留物以無水乙醇溶解并定量轉(zhuǎn)移到10l容量瓶中，再用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)枯燥濾紙過濾，棄去初濾液，精細(xì)量取濾液1l按原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的方法測定吸光度，計算生藥水溶性總酚酸的含量。2.3丹參葉片丹酚酸B含量測定2.3.1色譜條件色譜柱為DikaDS18〔4.6×250，5μ〕,流動相為甲醇-乙腈-0.25%磷酸〔30∶10∶60〕，流速為1l/in，檢測波長為286n；柱溫30℃。2.3.2對照品溶液的制備取丹酚酸B對照品3g，置10l容量瓶中，加75%甲醇適量，溶解，再用75%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。2.3.3供試品溶液的制備取丹參樣品粉末約0.25g，精細(xì)稱定，置具塞錐形瓶中，精細(xì)參加75%甲醇溶液25l，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇溶液補充喪失的溶劑量，搖勻，過濾，取濾液，即得。2.3.4線性關(guān)系考察精細(xì)稱取丹酚酸B對照品溶液，分別精細(xì)汲取2，4，8，10，12，14μl分別進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積Y對進(jìn)樣量X進(jìn)展線性回歸，得回歸方程Y=23602X-3522.4，r=0.9999；說明丹酚酸B進(jìn)樣量在0.604～3.624μg范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。2.3.5精細(xì)度實驗取樣品溶液20μl，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果丹酚酸B峰面積RSD=1.25%，重復(fù)性良好。2.3.6穩(wěn)定性實驗取樣品溶液10μl，分別在制備后0，2，4，8，12，24h測定，結(jié)果丹酚酸B峰面積RSD=1.58%，說明24h內(nèi)溶液穩(wěn)定。2.3.7回收率實驗平行在6份樣品溶液中參加丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.7l，依法操作，測定，結(jié)果平均回收率為98.0%，RSD=1.0%。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.丹酚酸B的HPL圖見圖1。3結(jié)果3.1不同濃度J對丹參地上局部水溶性總酚酸含量的影響實驗結(jié)果〔見表1〕顯示，在所測試的范圍內(nèi)，丹參地上局部莖、葉的水溶性總酚酸含量隨茉莉酸甲酯濃度的升高而增加，葉中的水溶性總酚酸含量增加的程度較莖中增加的大，如茉莉酸甲酯濃度為5×10-5l/L時，葉的總酚酸含量較對照增加了62％，莖中總酚酸含量較對照增加了36％；茉莉酸甲酯濃度在5×10-3l/L條件下，葉的總酚酸含量較對照增加了100％，莖中總酚酸含量較對照增加了48％。表1不同濃度茉莉酸甲酯對丹參莖葉中總酚酸含量的影響〔略〕3.2不同濃度J對丹參地上局部丹酚酸B含量的影響實驗結(jié)果〔圖2～6，表2〕顯示，在測試的范圍內(nèi)，丹參地上局部莖、葉的丹酚酸B含量隨J濃度的升高而增加，其中葉的丹酚酸B含量增加的程度較莖的大，如茉莉酸甲酯濃度為5×10-5l/L時，葉的丹酚酸B含量較對照增加了83％，莖中丹酚酸B含量較對照增加了29％；J濃度在5×10-3l/L條件下，葉的丹酚酸B含量較對照增加了117％，莖中丹酚酸B含量較對照增加了57％。表2茉莉酸甲酯對丹參莖葉中丹酚酸B含量影響的測定結(jié)果〔略〕3.3J在不同時間內(nèi)對丹參地上局部水溶性總酚酸含量的影響以5×10-5l/L的J噴施丹參葉面，在不同時間檢測葉和莖中的總酚酸含量，結(jié)果見圖7。實驗結(jié)果說明，隨處理時間的延長，丹參葉和莖中的總酚酸含量增加，其中葉中的總酚酸含量增加的幅度較莖的大。在處理72h和120h后，丹參葉中總酚酸含量分別較對照增加了92%和108%，莖中總酚酸含量分別較對照增加了30%和44%。3.4J在不同時間內(nèi)對丹參地上局部丹酚酸B含量的影響以5×10-5l/L的J噴施丹參葉面，在不同時間分別檢測莖葉中的丹酚酸B含量。結(jié)果見圖8。實驗結(jié)果顯示，隨處理時間的延長，丹參葉和莖中的丹酚酸B含量增加，其中葉中的丹酚酸B含量增加的幅度也較莖的大。在處理72h和120h后，丹參葉中丹酚酸B含量分別較對照增加了117%和167%，莖中丹酚酸B含量分別較對照增加了57%和86%。4討論J對植物次消費物積累的作用與其生理功能有關(guān)，外施J可以到達(dá)逆境的效應(yīng)，J也是植物細(xì)胞響應(yīng)多種環(huán)境脅迫的共同信號分子［7～10］。本項研究說明，利用J噴施丹參植株葉面，對丹參地上局部總酚酸和丹酚酸B的含量積累都有一定的促進(jìn)作用，促進(jìn)作用隨J濃度的增加和時間的延續(xù)而增強。藥用植物的藥效成分大多是次生代謝產(chǎn)物，植物次消費物的積累是與其生境親密相關(guān)的，一些逆境有利于次消費物的積累［11］，從生態(tài)學(xué)的角度分析，許屢次消費物也是植物防御逆境的植保素類物質(zhì)。研究說明，不同產(chǎn)地的丹參中的脂溶性和水溶性成分的含量均有顯著差異［12］，說明丹參的次消費物含量受環(huán)境的調(diào)控性。在一些研究中利用J作為誘導(dǎo)子誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞積累目的產(chǎn)物，如：J可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的肉蓯蓉細(xì)胞中苯乙醇苷、紅豆杉細(xì)胞中的紫杉醇等物質(zhì)含量的增加,對于培養(yǎng)的丹參毛狀根中丹參酮含量的積累也有促進(jìn)作用［8，13，14］。J可以從植物的氣孔進(jìn)入植物體,在細(xì)胞質(zhì)中被酯酶水解為茉莉酸等小分子,實現(xiàn)防御信號的遠(yuǎn)間隔傳導(dǎo),并能在植物間進(jìn)展信號交流，在植物組織的液相和氣相中自由的快速挪動。本研究結(jié)果顯示，J對丹參葉的作用效應(yīng)較莖的顯著，可能由于J直接噴施到葉有關(guān)，而在莖中存在間隔效應(yīng)和濃度效應(yīng)，相關(guān)機制需進(jìn)一步研究。丹參通常以根入藥,本項研究檢測了丹參莖葉中水溶性總酚酸和丹酚酸B的含量均較高，未被J處理的條件下，葉的丹酚酸B含量為0.63%,莖的丹酚酸B含量為0.66%；經(jīng)J處理后，莖葉的丹酚酸B含量都有不同程度的進(jìn)步，J在5×10-9～5×10-3的濃度范圍內(nèi),葉的丹酚酸B含量較對照增加了30.7%～117％，莖中丹酚酸B含量較對照增加了3％～57％，對于外施J對丹參根中主要藥效成分的影響，將另作報道。因此，今后有望考慮J在丹參消費中的應(yīng)用問題，在丹參的種植及采收中，應(yīng)注意地上局部的利用，同時有必要深化研究J促進(jìn)丹酚酸等藥效成分積累的機制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】［1］趙淑娟，章國瑛，劉滌，等.丹參水溶性酚酸類化合物藥理及生物合成途徑研究進(jìn)展［J］.中草藥，2022，35〔3〕：341.［2］杜冠華，張均田.丹參水溶性有效成分-丹酚酸研究進(jìn)展［J］.根底醫(yī)學(xué)與臨床，2000，2(5):10.［3］周玲，聶繼紅.丹酚酸B的研究進(jìn)展［J］.西部藥學(xué)，2022，4〔4〕：217.［4］黃鳳琴，黃尚榮，王婷，等.丹參葉化學(xué)成分的初步研究［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2022，31〔6〕:504.［5］李正國，石俊英，張中湖.丹參莖、葉中丹酚酸B的HPL法比擬分析［J］.藥學(xué)理論雜志，2022，25〔5〕：307.［6］Stt,I..Dat,J.F.Saliyliaidandhydrgenperxideinabitistresssignalinginplants［J］.Phytn-AnnalesREi.Btaniae，1999,39:13.［7］蔡昆爭，董桃杏，徐濤.茉莉酸類物質(zhì)〔JAs〕的生理特性及其在逆境脅迫中的抗性作用［J］.生態(tài)環(huán)境，2022，15(2):397.［8］王學(xué)勇，崔光紅，黃璐琦，等.茉莉酸甲酯對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累和釋放的影響［J］.中國中藥雜志，2022，32〔4〕：300.［9］asternak,ParthierB.Jasnate－signalledplantgeneexpressin［J］.Trends.PlantSi.,1997,2:302.［10］SebdnerG,ParthierB.Thebiheistryandthephysilgialandleularatinfjasnates［J］.Annu.Rev.PlantPhysil.Pl