Westernblot所需溶液的配制

Westernblot所需溶液的配制Westernblot所需溶液的配制9/9蝿PAGE9芅蒀膁羅艿莇腿羋羇莀膄羂荿蚅芆袇蒞芀羃膃葿膇蚇蒆肇膀螂莄螂蒅肈荿薅肁螅莁袂肇葿羈芇羈薄薂羂芅袀薇螅羈莃螃肂袇肇膆蒆袁肂肅膂膅蕆羀襖螁膄羂節(jié)莄袈蕿蚆蟻袃芃莂羆艿膈肄薁螞蒄莂芄莆螇螆蒁蒁Westernblot所需溶液的配制精心整理

WB所需溶液的配制

1Tris-甘氨酸電泳緩沖液(Runningbuffer)5×

Trisbase

Glycine(甘氨酸)

SDS

蒸餾水溶解至1000ml

5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液：堿和72ｇ甘氨酸，5ｇ電泳級的SDS，雙蒸水定容至1L，pH值為8.3。使用前，將5×稀釋到1×：取200ml5×，定容到1000ml。

轉(zhuǎn)膜緩沖液（Sendingbuffer）（現(xiàn)用現(xiàn)配）

1000ml1500ml

Glycine(甘氨酸)1.0MTris.HCl(pH8.3)25ml10%SDS1ml甲醇(methanol)200ml300ml蒸餾水溶解至1000ml溶解至1500ml必定新鮮配置，因?yàn)楦拾彼崛苡谒笠追纸?。小片段可不加SDS。310%SDS配置電泳級十二烷基硫酸鈉也叫SDS（SodiumDodecylSulfate，SDS,C12H254）溶液，ONaS:10gSDS100ml去離子水配制，50-68度攪拌溶解，濃鹽酸調(diào)pH到，室溫保存。1.0MTris.HCl(pH8.8)加入到250ml水濃鹽酸調(diào)pH到中1.5MTris.HCl(pH8.8)加入到250ml水濃鹽酸調(diào)pH到中1.0MTris.HCl(pH6.8)加入到250ml水濃鹽酸調(diào)pH到中1.0MTris.HCl(pH8.3)加入到250ml水濃鹽酸調(diào)pH到，中需要大體8毫升。注：Tris的分子量是度儲蓄。

510%APS(Ammoniumpersulfate;過硫酸銨)的配置

稱取1g過硫酸銨，加超純水溶解并定容至10ml，分裝到微量離心管中，負(fù)30度凍存。使用時(shí)盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，短期內(nèi)實(shí)驗(yàn)頻頻可多配。4度存則兩周內(nèi)用完，最多不能夠高出一個(gè)月。負(fù)20

度可存兩個(gè)月，但一旦解凍后趕忙用完。

610×TBS(Tris-bufferedsaline)的配置

NaCl80g160gTrisbase24g48g精心整理

雙蒸水溶解至1000ml溶解至2000ml加

HCl

調(diào)

pH

到，室溫儲蓄。

7TBST(Tris-bufferedsalinewithTween20)的配置10×TBS

100ml

200ml

Tween20

1ml

2ml

雙蒸水

溶解至

1000ml

溶解至

2000ml

室溫儲蓄。

8上樣緩沖液（loadingbuffer）的配置

SDS加樣緩沖液緩沖液8ml，甘油，，巰基乙醇，0.05%溴酚藍(lán)，H2O32ml混勻備用。按1:1或1:2比率與蛋白質(zhì)樣品混雜，在開水終

煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。

9stackinggelbuffer(4×)

SDS(w/v):0.4%0.4ml1%SDS

調(diào)pH到，加雙蒸水到10毫升。105×Samplebuffer(10ml)Stackinggelbuffer5mlSDS巰基乙醇（最后再加）甘油（glycerol）溴芬蘭（SigmaB-8026）室溫儲蓄

11封閉液的配置Blockingsolution要用TBST配制牛奶

5%(w/v)nonfatdriedmilk也許1%BSA

0.01%antifoamA(Sigma)

0.01%(v/v)sodiumazide

麗春紅溶液：

100微升冰醋酸，加入克麗春紅，用水稀釋至10毫升。

1）4%多聚甲醛（PFA）的配制（1000毫升）

40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度攪拌溶解，加入300微升氫氧化鈉，全部溶解后冷卻到4度，再加入100毫升的10×PBS，加水定容到1000毫升。調(diào)pH到。通風(fēng)櫥過濾，4度保存。

組織裂解液

10mMTris-HCl(pH7.4)粉末或精心整理150mMNaCl1%TritonX-1000.4ml100%1%去氧膽酸鈉（Sodiumdexycholate）400mg5mMEDTA或1%SDSPMSF(難溶解)7mg蛋白酶控制劑1片/10ml

步驟：

第一加10-20毫升的水溶解EDTA,再加入0.2%NaOH使溶解，再調(diào)pH至；爾后分別