食品微生物學(xué)檢驗(yàn)課件

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)1、總則2、菌落總數(shù)3、霉菌、酵母菌4、大腸菌群5、沙門氏菌6、金黃色葡萄球菌7、培養(yǎng)基性能測試8、食品微生物檢測試驗(yàn)室質(zhì)量控制食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)1、總則1

總則GB4789.1-20161.范圍：規(guī)定了食品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本原則和要求，本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品微生物學(xué)檢驗(yàn)2.實(shí)驗(yàn)室基本要求2.1檢驗(yàn)人員：相應(yīng)的微生物專業(yè)或培訓(xùn)經(jīng)歷，具有相應(yīng)的資質(zhì)，能夠理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)。（通過內(nèi)部質(zhì)量控制和能力驗(yàn)證、或使用標(biāo)準(zhǔn)菌株等方法客觀評估人員的能力。）2.2環(huán)境與設(shè)施：實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度、濕度、潔凈度、照度、噪聲應(yīng)符合工作要求（參考GB/T27405－2008附錄）2.2.1無菌室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，工作臺面的光照度應(yīng)不低于540lx。

2總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.2.2無菌室應(yīng)具備適當(dāng)?shù)耐L(fēng)和溫度調(diào)節(jié)的條件。無菌室的推薦溫度為20℃，相對濕度為40～60%。2.2.3一般樣品檢驗(yàn)應(yīng)在潔凈區(qū)域（包括超凈工作臺或潔凈實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行，潔凈區(qū)域應(yīng)有明顯的標(biāo)示。2.2.4病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在二級生物安全實(shí)驗(yàn)室（柜）進(jìn)行。依據(jù)GB19489－2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求2.2.5制定合理的環(huán)境監(jiān)測程序與頻次

3總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.2.6無菌室的管理2.2.6.1無菌室在使用前后應(yīng)進(jìn)行有效消毒。2.2.6.2無菌室的滅菌效果應(yīng)至少每周驗(yàn)證兩次2.2.6.3應(yīng)制定清潔、消毒、滅菌、使用、和應(yīng)急處理程序2.2.6.4應(yīng)記錄環(huán)境監(jiān)測結(jié)果總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.24

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備2.3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定并實(shí)施設(shè)備的維護(hù)、校準(zhǔn)、和性能驗(yàn)證的程序。每臺設(shè)備都要有唯一的標(biāo)識。2.3.2應(yīng)定期驗(yàn)證和維護(hù)設(shè)備，應(yīng)根據(jù)使用頻率在特定的時間間隔內(nèi)進(jìn)行維護(hù)和相關(guān)性能驗(yàn)證2.3.3試驗(yàn)設(shè)備應(yīng)有日常的監(jiān)控記錄和使用記錄

5GB/T27405-2008

設(shè)備校準(zhǔn)要求和頻率設(shè)備類型要求推薦頻率設(shè)備類型要求推薦頻率設(shè)備類型要求推薦頻率溫控設(shè)備（培養(yǎng)箱、水浴、冰箱等）、干熱/高壓滅菌器溫度穩(wěn)定和均勻性。兩年一次和維修后監(jiān)測溫度每日或每次使用前天平清零并校準(zhǔn)每日或每次使用前移液器（管）準(zhǔn)確性和精密度按使用頻率生物安全柜確定性能一年一次和維修后微生物監(jiān)測每兩周氣流監(jiān)測每次使用前無菌室或潔凈室監(jiān)測空氣和表面微生物每兩周一次超凈工作臺確定性能初次使用前和維修后用無菌平板監(jiān)測每兩周一次GB/T276GB/T27405-2008

設(shè)備清潔、維護(hù)的要求和頻率設(shè)備類型要求建議頻率培養(yǎng)箱、滅菌想、冰箱清潔和消毒內(nèi)表面每月一次高壓滅菌器檢修按生產(chǎn)商推薦有規(guī)律進(jìn)行清潔和消毒每年一次貨按生產(chǎn)商推薦壓力容器的安全檢查每年實(shí)驗(yàn)室清潔和消毒工作區(qū)表面每個工作日一次及使用期間清潔地板每周一次清潔和消毒其他表面每三個月一次GB/T27405-2007

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.4檢驗(yàn)用品2.4.1保證滅菌效果，滅菌與未滅菌的用品分開存放并有明確標(biāo)識。滅菌檢驗(yàn)用品應(yīng)記錄滅菌的溫度與持續(xù)時間及有效使用期限。2.5培養(yǎng)基和試劑的制備和質(zhì)量要求按照GB4789.28-2013

8

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.6質(zhì)控菌株2.6.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存能滿足試驗(yàn)需要的標(biāo)準(zhǔn)菌株2.6.2應(yīng)使用微生物菌種保藏專門或?qū)I(yè)權(quán)威機(jī)構(gòu)保存?？伤菰吹臉?biāo)準(zhǔn)菌株2.6.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存、傳代按照GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行2.6.4對實(shí)驗(yàn)室分離菌株（野生菌株），經(jīng)過鑒定后，可作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制菌株。總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要9

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求3.樣品的采集3.1采樣原則：無菌操作，應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性。3.2采樣方案3.2.1根據(jù)采檢樣目的、食品的特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。采樣方案分為二級n、c、m和三級采樣方案n、c、m、M總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的10

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

3.2.2采集樣品的標(biāo)記，應(yīng)對采集的樣品進(jìn)行及時、準(zhǔn)確的記錄和標(biāo)記，采樣人應(yīng)清晰填寫采樣單（包括采樣人、采樣地點(diǎn)、時間、樣品名稱、來源、批號、數(shù)量、保存條件等信息）。3.2.3采集樣品的貯存和運(yùn)輸采樣后，應(yīng)將樣品在接近原有貯存溫度條件下盡快送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。運(yùn)輸時應(yīng)保持樣品完整。如不能及時運(yùn)送，應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存。防止樣品中的微生物發(fā)生變化?？倓tGB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

11

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

3.3各類食品的采樣方案按食品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定執(zhí)行：3.3.1預(yù)包裝食品：應(yīng)采集相同批次、獨(dú)立包裝、適量件數(shù)的食品樣品，每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物指示檢驗(yàn)的要求3.3.2散裝食品或現(xiàn)場制作食品4生物安全與質(zhì)量控制4.1質(zhì)量控制：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)需要設(shè)置陽性對照、陰性對照、和空白對照定期對檢驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)量控制?？倓tGB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本12

總則

GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

4.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期對人員進(jìn)行考核。5記錄與報(bào)告5.1記錄：檢驗(yàn)過程中應(yīng)即時、客觀地記錄觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和數(shù)據(jù)等信息5.2報(bào)告：按照檢驗(yàn)方法中規(guī)定的要求、準(zhǔn)確、客觀的報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果總則GB4789.1-2016

13

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求6檢驗(yàn)后樣品的處理：6.1檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，被檢樣品才能被處理6.2檢出的致病菌的樣品要經(jīng)過無害化處理6.3檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，剩余樣品和同批產(chǎn)品不進(jìn)行微生物項(xiàng)目的復(fù)檢?？倓tGB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要14

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定1、菌落總數(shù)的定義:食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得每g（ml)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)2、老師建議使用磷酸鹽緩沖液。3、菌落計(jì)數(shù)a,選取菌落數(shù)在30~300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。

b、低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的記錄為多不可計(jì)。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。菌落鏈瓊脂表面水膜皿底水膜GB4789.2-2016

15

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定c、其中一個平板有較大片裝菌落生長時，而應(yīng)以無片裝菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落總數(shù)，若片裝菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。d、當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計(jì)數(shù)。

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定c、其中16

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定

4、結(jié)果與報(bào)告

a、若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個平板菌落數(shù)的平均值b、若有兩個連續(xù)的稀釋度平板上菌落數(shù)在適宜的計(jì)數(shù)范圍內(nèi)按公式計(jì)算c、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板計(jì)數(shù)，其他平板科記錄多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定

4、結(jié)果與17

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定

d、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均小于30CFU，則對稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。e、若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板上無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。f、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

GB478918

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示列

各稀釋級（供試液1ml/皿）平均菌落計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告CFU/g原液0.10.010.0011

64

82

6.4×1022

232.234

33,35—

3.4×1033

多不可計(jì)32542

4.2×1044

—32128

2.8×1045

000

＜106000—

＜1

GB478919

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

1.范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中霉菌、酵母菌的計(jì)數(shù)方法

本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于各類食品中霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)，

第二發(fā)適用于番茄醬罐頭、番茄汁中霉菌的計(jì)數(shù)2.設(shè)備和材料2.1將均質(zhì)器的名稱具體為拍擊式均質(zhì)器或均質(zhì)袋2.2無菌試管的修訂10*75mm改為18*180mm2.3刪除了冰箱和恒溫震蕩儀增加了、恒溫水浴、旋渦混合儀（反復(fù)的吸吹）

GB4789.15-2016

霉20

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)3.培養(yǎng)基：生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、孟加拉紅和馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基、滅菌溫度的改變，傾注平皿量的改變，4.培養(yǎng)：正置培養(yǎng)5.菌落計(jì)數(shù)5.1選取菌落數(shù)在10~150CFU之間，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌菌落數(shù)GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)3216.報(bào)告6.1菌落數(shù)按四舍五入原則修約，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，采用一位數(shù)字報(bào)告，在10~100之間，采用兩位數(shù)字報(bào)告6.2菌落數(shù)大于或等于100時前三位數(shù)字采用四舍五入原則修約后取前兩位數(shù)字后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可以用10的指數(shù)形式來表示

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)6.報(bào)告GB4789.15-2016

霉菌和酵母22

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

6.3如空白對照平板長有菌落出現(xiàn)，此次結(jié)果無效6.4以CFU/g或CFU/ml為單位報(bào)告，報(bào)告或分別報(bào)告霉菌和/或酵母菌數(shù)霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為菌落蔓延！多不可計(jì)

？

GB4789.15-2016

23

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)1.范圍1.1本標(biāo)準(zhǔn)第一法（MPN）法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)1.2第二法（平板計(jì)數(shù)法）適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)2.設(shè)備

3.培養(yǎng)基和試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨，煌綠乳糖膽鹽，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂，磷酸鹽緩沖液，無菌生理鹽水。

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)1.范圍244、第一法（MPN）法4.1樣品稀釋4.2樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5~7.5之間4.3從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超15min4.4初發(fā)酵試驗(yàn)：24h觀察一次，未產(chǎn)氣在培養(yǎng)至48h

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)4、第一法（MPN）法

GB4789.3-2016

254.5復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于與煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中36℃+1℃培養(yǎng)48h+2h，觀察產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者為計(jì)為大腸菌群陽性管。

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)4.5復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）

GB4789.3-20126

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)

5.第二法平板計(jì)數(shù)：5.1平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在10~150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)上面可疑和典型的大腸菌群菌落，典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，最低稀釋度平板低于15CFU的記錄具體菌落數(shù)。5.2證實(shí)試驗(yàn)：從VRBA上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個菌落的全部挑取。5.3大腸菌群平板計(jì)數(shù)報(bào)告：經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性管數(shù)的試管比例乘以平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g/ml樣品中大腸菌群數(shù)。若所有稀釋度上都無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)27國標(biāo)號2003版2016版培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美藍(lán)平板乳糖發(fā)酵管LST發(fā)酵管BGLB發(fā)酵管證實(shí)試驗(yàn)分離培養(yǎng)基證實(shí)試驗(yàn)革蘭氏染色復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)僅進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)單位報(bào)告MPN/100ml(g)MPN/ml(g)

GB4789.3-2016和GB4789.3-2003

大腸菌群MPN法的區(qū)別國標(biāo)號2003版2016版乳糖膽鹽發(fā)酵管LST發(fā)酵管分離培養(yǎng)28大腸菌群MPN檢索表（2010和2016）

29

4789.4-2016

沙門氏菌沙門氏菌屬：腸桿菌科，沙門菌屬，分類最復(fù)雜，1個屬，2個種，7個亞種，2659多血清型。血清型別復(fù)雜抗原變異多樣，菌型鑒定和結(jié)果判定困難。是重要的腸道致病菌，能引起各種脊椎動物的腸道感染。生物學(xué)性狀：需氧和兼性厭氧，生長溫度10-42℃最適溫度35-37℃，適宜pH值6.8-7.8沙門氏菌是引起人畜共患食源性病源菌，廣泛分布于自然界中，對禽類、生豬及其鮮肉制品的感染率最高，蛋類、禽類肉制品和豬肉是人類感染沙門氏菌的主要渠道。沙門氏菌不耐熱，55℃1h、60℃15-30min即被殺死。冷凍對沙門氏菌無殺滅作用，在-25℃低溫環(huán)境中仍可存活10個月左右。4789.4-2016

沙門氏菌301.范圍1.1本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品沙門氏菌的檢驗(yàn)并規(guī)定了沙門氏菌的檢驗(yàn)方法2設(shè)備和材料2.1增加了60mm直徑的平皿3.培養(yǎng)基和試劑4操作步驟4.1預(yù)增菌：pH值應(yīng)在6.8+0.2用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力4.2選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢繁殖，其他細(xì)菌收到抑制4.2.1TTB樣品中沙門氏菌量少，可選擇性抑制大腸菌群，提高目的菌的分離

4789.4-2016

沙門氏菌1.范圍4789.4-2016

沙314.2.2SC：可以抑制糞便中鏈球菌和大腸菌群使沙門順利繁殖4.3分離:輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物。用直徑3mm的接種環(huán)4.3.1BS：培養(yǎng)基不含乳糖，是分離沙門氏菌的首先培養(yǎng)基注意事項(xiàng)：BS不能高壓滅菌，溶解不能過熱，只能在使用前一天配制，保存與冷暗處，48h失效XLD：不高壓，溶解時不能過熱TSI：應(yīng)制成高柱斜面，保證底部形成厭氧環(huán)境；試管冒不可太嚴(yán)，氧氣供應(yīng)不好可使斜面喪失堿性環(huán)境

4789.4-2016

沙門氏菌4.2.2SC：可以抑制糞便中鏈球菌和大腸菌群使沙門順利繁殖32

4789.4-2016

沙門氏菌選擇性瓊脂平板BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變HE瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎黑色XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基：按照顯色培養(yǎng)基的說明進(jìn)行規(guī)定。4789.4-2016

沙門氏菌選334.4生化試驗(yàn)4.4.1從選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種TSI瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表

4789.4-2016

沙門氏菌4.4生化試驗(yàn)4789.4-2016

34三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷KA＋（－）＋（－）+可疑沙門氏菌屬KA＋（－）＋（－）-可疑沙門氏菌屬AA＋（－）＋（－）+可疑沙門氏菌屬AA＋/－＋/－-非沙門氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙門氏菌KA＋（－）＋（－）＋/－非沙門氏菌注：K：產(chǎn)堿，A：產(chǎn)酸；＋：陽性，－：陰性；＋（－）：多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；＋/－：陽性或陰性。

4789.4-2016

沙門氏菌三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷KA＋（－）＋（－）354.4.2硫化氫、靛基質(zhì)、Ph7.2尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、會有三種情況。4.5血清學(xué)鑒定4.5.1檢查培養(yǎng)基有無自凝性4.5.2多價菌體抗原鑒定4.5.3多價鞭毛抗原鑒定

4789.4-2016

沙門氏菌4.4.2硫化氫、靛基質(zhì)、Ph7.2尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧364.6血清學(xué)分型4.6.1O抗原的鑒定4.6.2H抗原的鑒定4.6.3Vi抗原的鑒定4.6.4菌型的判定4.7綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果報(bào)告25g/ml樣品中檢出或未檢出沙門氏菌

4789.4-2016

沙門氏菌4.6血清學(xué)分型4789.4-2016

371、

范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)第一法適（定性）用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn);

第二法（平板計(jì)數(shù)法）適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)

第三法（MPN法）適用于金黃色葡萄球菌含量較低的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。

4789.10-2016

金黃色葡萄球菌1、范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。382、設(shè)備和材料2.1恒溫水浴箱:36℃~56℃替代（37℃~65℃）2.2涂布棒代替了注射器3、培養(yǎng)基3.1只有7.5%氯化鈉肉湯刪掉了10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯4檢驗(yàn)程序

4789.10-2016

金黃色葡萄球菌2、設(shè)備和材料4789.10-2016

金黃色394.1第一法金黃色葡萄球菌定性試驗(yàn)4.1.1樣品處理4.1.2增菌4.1.3分離：Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。舊國標(biāo)（18h~24h或45h~48h）

4789.10-2016

金黃色葡萄球菌4789.10-2016

金黃色葡萄球菌402010版2016版鑒定：1、染色鏡檢2、血漿凝固酶試驗(yàn)挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面,36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。取新鮮配制兔血漿0.5mL,放入小試管中,再加入BHI培養(yǎng)物0.2mL~0.3mL,振蕩搖勻,置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi),每半小時觀察一次,觀察6h,如呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時,呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑,按說明書操作,進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑,挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI,36℃±1℃培養(yǎng)18h~48h,重復(fù)試驗(yàn)。初步鑒定：金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2mm~3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。確證鑒定：1、染色鏡檢2、血漿凝固酶試驗(yàn)挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個可疑菌落鑒定：初步鑒定：金黃色葡萄球菌在Baird-Parker41

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

培養(yǎng)基的質(zhì)控入庫登記記錄配制記錄滅菌記錄培養(yǎng)設(shè)備使用記錄菌種使用記錄名稱、批號、接收數(shù)量、規(guī)格、接收日期、產(chǎn)品的有效期、產(chǎn)品的合格證明、包裝的完整性、廠家、接收人等配制量、配制步驟、配制人、干飯的使用量等使用記錄銷毀記錄滅菌溫度、時間、壓力滅菌人、pH值、色澤、均勻度和滅菌結(jié)果證明使用日期、使用量、剩余量、使用人等菌種接收、傳代、保存、使用、銷毀等記錄培養(yǎng)箱、冰箱、廢棄物培養(yǎng)基驗(yàn)收GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)42

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求一、修訂依據(jù)：ISO/TS11133-1:2009；ISO/TS11133-2:2003；二、范圍：規(guī)定了食品微生物學(xué)檢驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)量要求和控制三、評估培養(yǎng)基整體性能的指標(biāo)：理化指標(biāo)微生物學(xué)指標(biāo)：特定條件下培養(yǎng)基對測試菌株的反應(yīng)

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基43GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

四、培養(yǎng)基分類及術(shù)語和定義純化學(xué)培養(yǎng)基：由已知分子結(jié)構(gòu)和純度的化學(xué)成分配制而成的培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入一些瓊脂和凝膠，加熱至100C°溶解，冷卻凝固后成固體狀態(tài)培養(yǎng)基可以制成平板和斜面。運(yùn)輸培養(yǎng)基：保藏培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂斜面懸浮培養(yǎng)基：如磷酸鹽緩沖液復(fù)蘇培養(yǎng)基：使微生物恢復(fù)正常生長能力增菌培養(yǎng)基：給微生物繁殖提供特定的生長環(huán)境選擇性增菌培養(yǎng)基：允許特定的微生物在其中繁殖非選擇性增菌培養(yǎng)基：保證多種微生物能夠生長的培養(yǎng)基GB4789.28-2013

培養(yǎng)44GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求分離培養(yǎng)基：單獨(dú)的支持微生物生長選擇性分離培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基，XLD。非選擇性分離培養(yǎng)基：對微生物沒有選擇性的抑制。鑒定培養(yǎng)基：如乳糖發(fā)酵管有特定的鑒定反應(yīng)通常不需要進(jìn)一步確證試驗(yàn)的培養(yǎng)基GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的45GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：能夠?qū)ξ⑸锒康倪x擇性或非選擇性培養(yǎng)基

確證培養(yǎng)基：如BGLB

商品化即用型培養(yǎng)基：貯存條件、有效期和使用方法進(jìn)行保存和使用。

商品化脫水合成培養(yǎng)基:實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有有效的培養(yǎng)基目錄清單，清單應(yīng)包括密閉性檢查、首次開封日期、內(nèi)容物的感官檢查。開封后的脫水培養(yǎng)基應(yīng)在配制前觀察粉末的流動性、均勻性、結(jié)塊、和色澤等變化。GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)46GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求試劑：用于微生物檢驗(yàn)染色的染色試劑盒培養(yǎng)基配套試劑測試菌株：用于培養(yǎng)基性能測試的微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株：主要從標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心購買標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株：儲備菌株：工作菌株：五、貯存：一般要求，嚴(yán)格按照供應(yīng)商的貯存條件、有效期和使用方法進(jìn)行培養(yǎng)基和試劑的保存和使用GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求試劑47GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求六、培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室制備中的注意事項(xiàng)：1、實(shí)驗(yàn)室自制的培養(yǎng)基，2至8度平板建議保存2周至4周。并標(biāo)記上名稱和配制日期、有效期。瓶裝及試管培養(yǎng)基不超過3個月至6個月，培養(yǎng)基的貯存應(yīng)在建立驗(yàn)證的有效期。主要觀察培養(yǎng)基是否有顏色變化、蒸發(fā)（脫水）或微生物生長的情況，當(dāng)培養(yǎng)基發(fā)生這類變化時，應(yīng)禁止使用。2、配制記錄應(yīng)有：配制日期、配制量、滅菌條件和操作步驟、pH值（應(yīng)有記錄體現(xiàn)滅菌后培養(yǎng)基的pH值，用氫氧化鈉或鹽酸）。3、水，電導(dǎo)率25度時不超過25uS/cm,微生物不超過103CFU/ml。GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑48

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求4、分裝容器的體積應(yīng)比培養(yǎng)基的體積最少大20%5、滅菌：濕熱高壓滅菌（pH、色澤、滅菌效果、均勻度）、過濾除菌、煮沸滅菌。5.1pH測定和調(diào)整：室溫25度標(biāo)準(zhǔn)值+0.2范圍內(nèi)5.2過渡滅菌：未及時冷卻或裝載體積超過1000ml6、培養(yǎng)基的使用：溶化后放置時間不超過4個小時，在傾注培養(yǎng)基時不超過15分鐘GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)49七、微生物學(xué)要求：實(shí)驗(yàn)室使用商品化培養(yǎng)基和試劑時，應(yīng)保留生產(chǎn)商提供的資料并制定驗(yàn)收程序，如需驗(yàn)證應(yīng)達(dá)到附錄E質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)要求。生長特性一般要求：對每批成品培養(yǎng)基或試劑進(jìn)行評價定量法、半定量法、定性法三種方法。測試菌株：對不含指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，只采用一株陽性菌測試，對含有指示劑的培養(yǎng)基或試劑，應(yīng)用能證明其指示或選擇作用的菌株進(jìn)行試驗(yàn)GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求七、微生物學(xué)要求：實(shí)驗(yàn)室使用商品化培養(yǎng)基和試劑時，應(yīng)保留生產(chǎn)50

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求生長率：按規(guī)定用適當(dāng)?shù)姆椒▽y試菌株接種至固體、半固體和液體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基上菌株的生長率應(yīng)到達(dá)規(guī)定的最低限值選擇性：為定量評估培養(yǎng)基的選擇性，應(yīng)安照規(guī)定以適當(dāng)?shù)姆椒▽⑦m量的測試菌株接種至選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的選擇性應(yīng)達(dá)到規(guī)定的限值生理生化特性（特異性）：確定培養(yǎng)基的菌落形態(tài)學(xué)，鑒別特性和選擇性，以獲得培養(yǎng)基的基本特性性能評價和結(jié)果解釋：若按照規(guī)定所有的測試菌株的性能測試達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，則該批培養(yǎng)基的性能測試結(jié)果符合規(guī)定。

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和51

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基非選擇性增菌液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基選擇性增菌液體培養(yǎng)基非選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基生產(chǎn)商及實(shí)驗(yàn)室自制培養(yǎng)基和試劑實(shí)驗(yàn)室使用商品化培養(yǎng)基和試劑定量法定量及半定量法半定量法定性法半定量法定量法100~1000cfuGB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要52

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的性能測試方法一：生產(chǎn)商及實(shí)驗(yàn)室自制培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制的測試方法二：實(shí)驗(yàn)室使用商品化培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制的測試方法

2.1非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基的半定量測試方法2.1.1平板的制備與保存：平皿中形成3mm厚的瓊脂層，使用前應(yīng)對瓊脂表面進(jìn)行干燥。2.1.2將標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養(yǎng)過夜作為工作菌懸液。2.1.3接種：用1uL接種環(huán)進(jìn)行平板劃線GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試5312345678910121113151416目標(biāo)菌半定量劃線的方式

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求12345678910121113151416目標(biāo)菌半定量542.1.4計(jì)算培養(yǎng)后，評價菌落的形狀、大小和密度，計(jì)算生長指數(shù)G。結(jié)果解釋：G大于或等于6時，培養(yǎng)基可以接受。非選擇性的培養(yǎng)基的G值較高。

2.2選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基的半定量測試方法2.2.1目標(biāo)菌半定量測試方法：按2.1操作2.2.2非目標(biāo)菌（選擇性）半定量測試方法

GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求2.1.4計(jì)算GB4789.28-2055GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求2.2.1平板的制備與保存2.2.2工作菌懸液的制備2.2.3接種：同時接種2個平板GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)56GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求2.2.4計(jì)算：每條有生長稠密菌落生長的劃線則G為1，如果僅有一半的線有稠密菌落生長的劃線則為0.5，如果劃線上沒有菌落生長，生長量少于劃線的一半或菌落生長微弱，則G為0。結(jié)果解釋：非目標(biāo)菌生長指數(shù)G一般小于1，至少應(yīng)達(dá)到小于5.GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要57GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

2.3非選擇性增菌培養(yǎng)基、選擇性增菌培養(yǎng)基、和選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的定

性測試方法2.3.1培養(yǎng)基的制備：將培養(yǎng)基分裝試管，每管10ml2.3.2工作菌懸液的制備將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到非選擇性肉湯中過夜，進(jìn)行10倍系列稀釋至10-3，或制備成、105CFU/ml～107CFU/ml的菌懸液作為工作菌懸液。10ml9ml9ml9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1mlGB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的582.3.3用1uL接種環(huán)取1環(huán)工作菌懸液直接接種到性能測試的液體培養(yǎng)基中，按適合的培養(yǎng)溫度和時間進(jìn)行培養(yǎng)GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求2.3.3用1uL接種環(huán)取1環(huán)工作菌懸液直接接種到性能測試的59GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求2.3.4結(jié)果解釋：用目測的濁度值（如0～2

）評估培養(yǎng)基—0表示無混濁—1表示很輕微的混濁—2表示嚴(yán)重混濁GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的602.4懸浮培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基的定性測試方法2.4.1培養(yǎng)基的制備：將培養(yǎng)基分裝試管，每管10ml2.4.2工作菌懸液的制備：將標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養(yǎng)過夜作為工作菌懸液。2.4.3接種：用1uL接種環(huán)取1環(huán)工作菌懸液直接接種到裝有待測培養(yǎng)基是試管中，混勻后，立即用10uL接種環(huán)取1環(huán)劃平行線接種平板，按規(guī)定培養(yǎng)后，剩余已接種菌液的待測培養(yǎng)基置20℃~25℃放置45min后，再用10uL接種環(huán)取1環(huán)劃平行線接種平板。GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求2.4懸浮培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基的定性測試方法G612.4.4結(jié)果觀察與解釋接種前后平板上目標(biāo)菌的生長情況應(yīng)均為良好。GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求2.4.4結(jié)果觀察與解釋GB4789.28-62培養(yǎng)基狀態(tài)功能分類質(zhì)控指標(biāo)培養(yǎng)條件質(zhì)控菌株定性質(zhì)控評定標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)固體非選擇性計(jì)數(shù)生長率36℃+1℃24h+2h大腸、金蒲、枯草G≥6

孟加拉紅培養(yǎng)基固體選擇性計(jì)數(shù)生長率28.0℃+1℃5天釀酒酵母黑曲霉G≥6選擇性大腸、金蒲G≤1亞硫酸鉍瓊脂固體選擇性分離生長率36℃+1℃40h~48h傷寒沙門氏菌，鼠傷寒沙門氏菌G≥6選擇性大腸埃希氏菌、糞腸球菌G≤1XLD固體選擇性分離生長率36℃+1℃18h~24h鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌選擇性大腸、金蒲MAC固體選擇性分離生長率36℃+1℃20h~24h大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌G≥6選擇性金蒲G≤1GB4789.28-2013

培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求培養(yǎng)基狀態(tài)功能分類質(zhì)控63食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制基本概念質(zhì)量保證：一般適用于有合同場合，主要目的使客戶確信實(shí)驗(yàn)室提供是服務(wù)能滿足規(guī)定的質(zhì)量要求。（側(cè)重于控制措施，操作技術(shù)和方法）質(zhì)量控制：主要是指為達(dá)到和保持質(zhì)量而進(jìn)行控制的技術(shù)措施和管理措施反面的活動。（側(cè)重于控制結(jié)果的證實(shí)，以提供充分的信任）微生物檢測質(zhì)量控制1、外部質(zhì)量評估：機(jī)構(gòu)間比對、能力驗(yàn)證2、內(nèi)部控質(zhì)2.1設(shè)置對照：空白對照、陰性對照、陽性對照。2.2不同人員間的比對：2.3不同設(shè)備比對2.4不同方法比對注：微生物樣品本身的不均勻性影響檢測結(jié)果一致性。應(yīng)排除此干擾的影響，才能正確實(shí)施評價。同一操作者對同一平板復(fù)核自己的計(jì)數(shù)結(jié)果，差異應(yīng)在5%之內(nèi)，而其他人員對同一平板重復(fù)計(jì)數(shù)，其差異應(yīng)在10%之內(nèi)。食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制64食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制列如GB4789.10-2010中在做血漿凝固酶試驗(yàn)時，應(yīng)有三個對照肉湯培養(yǎng)物陰性對照陽性對照表皮葡萄球菌金黃色葡萄球菌食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制列如GB4789.10-201065食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制2.5模擬陽性樣品試驗(yàn)2.6、針對微生物定量檢測項(xiàng)目，應(yīng)定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行監(jiān)控，或使用質(zhì)控樣品開展內(nèi)部質(zhì)量控制活動。2.7、針對微生物定性檢測項(xiàng)目，應(yīng)定期使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品、質(zhì)控樣品或用標(biāo)準(zhǔn)菌種人工污染的樣品開展內(nèi)部質(zhì)量控制。2.8、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)工作量、人員水平、能力驗(yàn)證結(jié)果、外部評審等情況對定期做出明確規(guī)定，如定量檢測項(xiàng)目6次/年，定性檢測項(xiàng)目4次/年。2.9實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部比對ISO4833：2003中對結(jié)果重復(fù)性規(guī)定：用相同的方法，同一實(shí)驗(yàn)材料，在相同的條件下獲得的一系列結(jié)果之間的一致程度。相同的條件是指同一操作者、同一設(shè)備、同一實(shí)驗(yàn)室和短暫的時間間隔。在此條件下所得的獨(dú)立測試結(jié)果之差的絕對值不能大于重復(fù)性極限，即R=0.25食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制2.5模擬陽性樣品試驗(yàn)66食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制2.9.1即第一次測試人員的測試結(jié)果為105=100000，第二次測試人員的結(jié)果下限為Lg104.75=5600結(jié)果上限為Lg105.25=178000。如測試結(jié)果在56000和178000之間，則可認(rèn)為兩個測試結(jié)果的差值可以接受。如表所示測試結(jié)果第一測試人員第二測試人員測試值1000000280086000190000結(jié)果判定——不可接受，低于下限值可接受不可接受，高于下限值若使用同一質(zhì)控樣品進(jìn)行測試，兩次測試結(jié)果超出差值范圍的上限或下限值時，則可能是檢測人員操作失誤引起的，應(yīng)及時檢查找原因并糾正。食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制2.9.1即第一次測試人員的測試67相關(guān)微生物檢驗(yàn)的國標(biāo)國標(biāo)內(nèi)容國標(biāo)內(nèi)容GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB50346實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范GB/T27405-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范，食品微生物檢測SN/T1538培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則GB4789.28-2013食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T16293醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌菌的測試方法GB14881-2013食品生產(chǎn)衛(wèi)生通用衛(wèi)生規(guī)范SN/T27405實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范，食品微生物檢測GB7781-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則GB11674乳清粉和乳清蛋白粉GB5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB31617食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑GB29921-2013食品中致病菌限量GB/T16294醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法GB7101-2015食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料GB16740-2014保?。üδ埽┦称吠ㄓ脴?biāo)準(zhǔn)GB4789.18-2010乳與乳制品檢驗(yàn)GB/T18202室內(nèi)空氣臭氧衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB17405-1998保健食品良好生產(chǎn)操作規(guī)范GB15981消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求相關(guān)微生物檢驗(yàn)的68相關(guān)微生物檢驗(yàn)的國標(biāo)國標(biāo)內(nèi)容GB4789.1-2016食品微生物檢驗(yàn)總則GB4789.2-2016菌落總數(shù)測定GB4789.3-2016大腸菌群GB4789.4-2016沙門氏菌檢驗(yàn)GB4789.5-2012志賀氏菌檢驗(yàn)GB4789.10-2016金黃色葡萄球菌GB4789.11-2014溶血性鏈球菌檢驗(yàn)GB4789.15-2016霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)GB4789.38-2012大腸埃希氏菌相關(guān)微生物檢驗(yàn)的國標(biāo)國標(biāo)內(nèi)容GB4789.1-2016食品69食品微生物學(xué)檢驗(yàn)課件70保健食品生產(chǎn)許可現(xiàn)場核查內(nèi)容1、批準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、取樣方法、檢驗(yàn)方法、和其它質(zhì)量管理規(guī)程2、監(jiān)督廠房和設(shè)施設(shè)備的維護(hù)情況3、潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)以及不同級別的潔凈室之間應(yīng)設(shè)緩沖鎖裝置，放置空氣倒灌。潔凈間與室外的靜壓差應(yīng)不當(dāng)與小于10Pa，潔凈級別不同相鄰潔凈室之間的靜壓差一般不小于5Pa，并配備壓差指示裝置4、潔凈間溫度18~26度，相對濕度45%~65%5、批生產(chǎn)記錄應(yīng)按批號歸檔，保存至產(chǎn)品保質(zhì)期后一年，保存期限不得少于2年。6、每批保健食品要按照企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，每個品種每年要按照產(chǎn)品技術(shù)要求至少進(jìn)行一次全項(xiàng)目形式檢驗(yàn)。7、致病菌檢測的陽性對照、微生物限度檢定要分室進(jìn)行，并采取有效措施，避免交叉污染。保健食品生產(chǎn)許可現(xiàn)場核查內(nèi)容1、批準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、取樣71GB7101

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料

飲料：經(jīng)過定量包裝的，供直接飲用或用水沖調(diào)飲用的，乙醇含量不超過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的制品微生物限量：致病菌限量應(yīng)符合GB29921（食品中致病菌限量）的規(guī)定食品添加劑應(yīng)符合GB2760營養(yǎng)強(qiáng)化劑GB14880GB7101

食品安全國家72食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)1、總則2、菌落總數(shù)3、霉菌、酵母菌4、大腸菌群5、沙門氏菌6、金黃色葡萄球菌7、培養(yǎng)基性能測試8、食品微生物檢測試驗(yàn)室質(zhì)量控制食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)1、總則73

總則GB4789.1-20161.范圍：規(guī)定了食品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本原則和要求，本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品微生物學(xué)檢驗(yàn)2.實(shí)驗(yàn)室基本要求2.1檢驗(yàn)人員：相應(yīng)的微生物專業(yè)或培訓(xùn)經(jīng)歷，具有相應(yīng)的資質(zhì)，能夠理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)。（通過內(nèi)部質(zhì)量控制和能力驗(yàn)證、或使用標(biāo)準(zhǔn)菌株等方法客觀評估人員的能力。）2.2環(huán)境與設(shè)施：實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度、濕度、潔凈度、照度、噪聲應(yīng)符合工作要求（參考GB/T27405－2008附錄）2.2.1無菌室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，工作臺面的光照度應(yīng)不低于540lx。

74總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.2.2無菌室應(yīng)具備適當(dāng)?shù)耐L(fēng)和溫度調(diào)節(jié)的條件。無菌室的推薦溫度為20℃，相對濕度為40～60%。2.2.3一般樣品檢驗(yàn)應(yīng)在潔凈區(qū)域（包括超凈工作臺或潔凈實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行，潔凈區(qū)域應(yīng)有明顯的標(biāo)示。2.2.4病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在二級生物安全實(shí)驗(yàn)室（柜）進(jìn)行。依據(jù)GB19489－2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求2.2.5制定合理的環(huán)境監(jiān)測程序與頻次

75總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.2.6無菌室的管理2.2.6.1無菌室在使用前后應(yīng)進(jìn)行有效消毒。2.2.6.2無菌室的滅菌效果應(yīng)至少每周驗(yàn)證兩次2.2.6.3應(yīng)制定清潔、消毒、滅菌、使用、和應(yīng)急處理程序2.2.6.4應(yīng)記錄環(huán)境監(jiān)測結(jié)果總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.276

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備2.3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定并實(shí)施設(shè)備的維護(hù)、校準(zhǔn)、和性能驗(yàn)證的程序。每臺設(shè)備都要有唯一的標(biāo)識。2.3.2應(yīng)定期驗(yàn)證和維護(hù)設(shè)備，應(yīng)根據(jù)使用頻率在特定的時間間隔內(nèi)進(jìn)行維護(hù)和相關(guān)性能驗(yàn)證2.3.3試驗(yàn)設(shè)備應(yīng)有日常的監(jiān)控記錄和使用記錄

77GB/T27405-2008

設(shè)備校準(zhǔn)要求和頻率設(shè)備類型要求推薦頻率設(shè)備類型要求推薦頻率設(shè)備類型要求推薦頻率溫控設(shè)備（培養(yǎng)箱、水浴、冰箱等）、干熱/高壓滅菌器溫度穩(wěn)定和均勻性。兩年一次和維修后監(jiān)測溫度每日或每次使用前天平清零并校準(zhǔn)每日或每次使用前移液器（管）準(zhǔn)確性和精密度按使用頻率生物安全柜確定性能一年一次和維修后微生物監(jiān)測每兩周氣流監(jiān)測每次使用前無菌室或潔凈室監(jiān)測空氣和表面微生物每兩周一次超凈工作臺確定性能初次使用前和維修后用無菌平板監(jiān)測每兩周一次GB/T2778GB/T27405-2008

設(shè)備清潔、維護(hù)的要求和頻率設(shè)備類型要求建議頻率培養(yǎng)箱、滅菌想、冰箱清潔和消毒內(nèi)表面每月一次高壓滅菌器檢修按生產(chǎn)商推薦有規(guī)律進(jìn)行清潔和消毒每年一次貨按生產(chǎn)商推薦壓力容器的安全檢查每年實(shí)驗(yàn)室清潔和消毒工作區(qū)表面每個工作日一次及使用期間清潔地板每周一次清潔和消毒其他表面每三個月一次GB/T27405-20079

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.4檢驗(yàn)用品2.4.1保證滅菌效果，滅菌與未滅菌的用品分開存放并有明確標(biāo)識。滅菌檢驗(yàn)用品應(yīng)記錄滅菌的溫度與持續(xù)時間及有效使用期限。2.5培養(yǎng)基和試劑的制備和質(zhì)量要求按照GB4789.28-2013

80

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

2.6質(zhì)控菌株2.6.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存能滿足試驗(yàn)需要的標(biāo)準(zhǔn)菌株2.6.2應(yīng)使用微生物菌種保藏專門或?qū)I(yè)權(quán)威機(jī)構(gòu)保存。可溯源的標(biāo)準(zhǔn)菌株2.6.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存、傳代按照GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行2.6.4對實(shí)驗(yàn)室分離菌株（野生菌株），經(jīng)過鑒定后，可作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制菌株?？倓tGB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要81

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求3.樣品的采集3.1采樣原則：無菌操作，應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性。3.2采樣方案3.2.1根據(jù)采檢樣目的、食品的特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。采樣方案分為二級n、c、m和三級采樣方案n、c、m、M總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的82

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

3.2.2采集樣品的標(biāo)記，應(yīng)對采集的樣品進(jìn)行及時、準(zhǔn)確的記錄和標(biāo)記，采樣人應(yīng)清晰填寫采樣單（包括采樣人、采樣地點(diǎn)、時間、樣品名稱、來源、批號、數(shù)量、保存條件等信息）。3.2.3采集樣品的貯存和運(yùn)輸采樣后，應(yīng)將樣品在接近原有貯存溫度條件下盡快送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。運(yùn)輸時應(yīng)保持樣品完整。如不能及時運(yùn)送，應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存。防止樣品中的微生物發(fā)生變化。總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

83

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

3.3各類食品的采樣方案按食品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定執(zhí)行：3.3.1預(yù)包裝食品：應(yīng)采集相同批次、獨(dú)立包裝、適量件數(shù)的食品樣品，每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物指示檢驗(yàn)的要求3.3.2散裝食品或現(xiàn)場制作食品4生物安全與質(zhì)量控制4.1質(zhì)量控制：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)需要設(shè)置陽性對照、陰性對照、和空白對照定期對檢驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)量控制?？倓tGB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本84

總則

GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求

4.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期對人員進(jìn)行考核。5記錄與報(bào)告5.1記錄：檢驗(yàn)過程中應(yīng)即時、客觀地記錄觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和數(shù)據(jù)等信息5.2報(bào)告：按照檢驗(yàn)方法中規(guī)定的要求、準(zhǔn)確、客觀的報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果總則GB4789.1-2016

85

總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要求6檢驗(yàn)后樣品的處理：6.1檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，被檢樣品才能被處理6.2檢出的致病菌的樣品要經(jīng)過無害化處理6.3檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，剩余樣品和同批產(chǎn)品不進(jìn)行微生物項(xiàng)目的復(fù)檢。總則GB4789.1-2016

實(shí)驗(yàn)室的基本要86

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定1、菌落總數(shù)的定義:食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得每g（ml)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)2、老師建議使用磷酸鹽緩沖液。3、菌落計(jì)數(shù)a,選取菌落數(shù)在30~300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。

b、低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的記錄為多不可計(jì)。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。菌落鏈瓊脂表面水膜皿底水膜GB4789.2-2016

87

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定c、其中一個平板有較大片裝菌落生長時，而應(yīng)以無片裝菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落總數(shù)，若片裝菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。d、當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計(jì)數(shù)。

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定c、其中88

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定

4、結(jié)果與報(bào)告

a、若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個平板菌落數(shù)的平均值b、若有兩個連續(xù)的稀釋度平板上菌落數(shù)在適宜的計(jì)數(shù)范圍內(nèi)按公式計(jì)算c、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板計(jì)數(shù)，其他平板科記錄多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定

4、結(jié)果與89

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定

d、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均小于30CFU，則對稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。e、若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板上無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。f、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

GB478990

GB4789.2-2016

菌落總數(shù)測定菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示列

各稀釋級（供試液1ml/皿）平均菌落計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告CFU/g原液0.10.010.0011

64

82

6.4×1022

232.234

33,35—

3.4×1033

多不可計(jì)32542

4.2×1044

—32128

2.8×1045

000

＜106000—

＜1

GB478991

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

1.范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中霉菌、酵母菌的計(jì)數(shù)方法

本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于各類食品中霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)，

第二發(fā)適用于番茄醬罐頭、番茄汁中霉菌的計(jì)數(shù)2.設(shè)備和材料2.1將均質(zhì)器的名稱具體為拍擊式均質(zhì)器或均質(zhì)袋2.2無菌試管的修訂10*75mm改為18*180mm2.3刪除了冰箱和恒溫震蕩儀增加了、恒溫水浴、旋渦混合儀（反復(fù)的吸吹）

GB4789.15-2016

霉92

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)3.培養(yǎng)基：生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、孟加拉紅和馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基、滅菌溫度的改變，傾注平皿量的改變，4.培養(yǎng)：正置培養(yǎng)5.菌落計(jì)數(shù)5.1選取菌落數(shù)在10~150CFU之間，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌菌落數(shù)GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)3936.報(bào)告6.1菌落數(shù)按四舍五入原則修約，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，采用一位數(shù)字報(bào)告，在10~100之間，采用兩位數(shù)字報(bào)告6.2菌落數(shù)大于或等于100時前三位數(shù)字采用四舍五入原則修約后取前兩位數(shù)字后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可以用10的指數(shù)形式來表示

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)6.報(bào)告GB4789.15-2016

霉菌和酵母94

GB4789.15-2016

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

6.3如空白對照平板長有菌落出現(xiàn)，此次結(jié)果無效6.4以CFU/g或CFU/ml為單位報(bào)告，報(bào)告或分別報(bào)告霉菌和/或酵母菌數(shù)霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為菌落蔓延！多不可計(jì)

？

GB4789.15-2016

95

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)1.范圍1.1本標(biāo)準(zhǔn)第一法（MPN）法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)1.2第二法（平板計(jì)數(shù)法）適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)2.設(shè)備

3.培養(yǎng)基和試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨，煌綠乳糖膽鹽，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂，磷酸鹽緩沖液，無菌生理鹽水。

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)1.范圍964、第一法（MPN）法4.1樣品稀釋4.2樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5~7.5之間4.3從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超15min4.4初發(fā)酵試驗(yàn)：24h觀察一次，未產(chǎn)氣在培養(yǎng)至48h

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)4、第一法（MPN）法

GB4789.3-2016

974.5復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于與煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中36℃+1℃培養(yǎng)48h+2h，觀察產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者為計(jì)為大腸菌群陽性管。

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)4.5復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）

GB4789.3-20198

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)

5.第二法平板計(jì)數(shù)：5.1平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在10~150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)上面可疑和典型的大腸菌群菌落，典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，最低稀釋度平板低于15CFU的記錄具體菌落數(shù)。5.2證實(shí)試驗(yàn)：從VRBA上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個菌落的全部挑取。5.3大腸菌群平板計(jì)數(shù)報(bào)告：經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性管數(shù)的試管比例乘以平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g/ml樣品中大腸菌群數(shù)。若所有稀釋度上都無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。

GB4789.3-2016

大腸菌群計(jì)數(shù)99國標(biāo)號2003版2016版培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美藍(lán)平板乳糖發(fā)酵管LST發(fā)酵管BGLB發(fā)酵管證實(shí)試驗(yàn)分離培養(yǎng)基證實(shí)試驗(yàn)革蘭氏染色復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)僅進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)單位報(bào)告MPN/100ml(g)MPN/ml(g)

GB4789.3-2016和GB4789.3-2003

大腸菌群MPN法的區(qū)別國標(biāo)號2003版2016版乳糖膽鹽發(fā)酵管LST發(fā)酵管分離培養(yǎng)100大腸菌群MPN檢索表（2010和2016）

101

4789.4-2016

沙門氏菌沙門氏菌屬：腸桿菌科，沙門菌屬，分類最復(fù)雜，1個屬，2個種，7個亞種，2659多血清型。血清型別復(fù)雜抗原變異多樣，菌型鑒定和結(jié)果判定困難。是重要的腸道致病菌，能引起各種脊椎動物的腸道感染。生物學(xué)性狀：需氧和兼性厭氧，生長溫度10-42℃最適溫度35-37℃，適宜pH值6.8-7.8沙門氏菌是引起人畜共患食源性病源菌，廣泛分布于自然界中，對禽類、生豬及其鮮肉制品的感染率最高，蛋類、禽類肉制品和豬肉是人類感染沙門氏菌的主要渠道。沙門氏菌不耐熱，55℃1h、60℃15-30min即被殺死。冷凍對沙門氏菌無殺滅作用，在-25℃低溫環(huán)境中仍可存活10個月左右。4789.4-2016

沙門氏菌1021.范圍1.1本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品沙門氏菌的檢驗(yàn)并規(guī)定了沙門氏菌的檢驗(yàn)方法2設(shè)備和材料2.1增加了60mm直徑的平皿3.培養(yǎng)基和試劑4操作步驟4.1預(yù)增菌：pH值應(yīng)在6.8+0.2用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力4.2選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢繁殖，其他細(xì)菌收到抑制4.2.1TTB樣品中沙門氏菌量少，可選擇性抑制大腸菌群，提高目的菌的分離

4789.4-2016

沙門氏菌1.范圍4789.4-2016

沙1034.2.2SC：可以抑制糞便中鏈球菌和大腸菌群使沙門順利繁殖4.3分離:輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物。用直徑3mm的接種環(huán)4.3.1BS：培養(yǎng)基不含乳糖，是分離沙門氏菌的首先培養(yǎng)基注意事項(xiàng)：BS不能高壓滅菌，溶解不能過熱，只能在使用前一天配制，保存與冷暗處，48h失效XLD：不高壓，溶解時不能過熱TSI：應(yīng)制成高柱斜面，保證底部形成厭氧環(huán)境；試管冒不可太嚴(yán)，氧氣供應(yīng)不好可使斜面