腎臟缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)核因子κB活性及細(xì)胞凋亡的影響

腎臟缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)核因子-κB活性及細(xì)胞凋亡的影響【摘要】目的通過(guò)建立大鼠腎臟急性缺血/再灌注(I/R)及缺血預(yù)適應(yīng)(I/P+I/R)模型，初步研究不同的缺血方式后腎臟核因子-κB〔NF-κB〕活性及二聚體亞單位的構(gòu)成，討論其減輕腎臟腎小管細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法30只雄性SD大鼠摘除右腎、別離出左腎動(dòng)脈后隨機(jī)均分為3組〔n=10〕：A組為假手術(shù)組〔Sha組〕，只別離左腎動(dòng)脈，暴露術(shù)野60in后直接縫合，24h后取腎；B組為缺血/再灌注組(I/R組)，持續(xù)夾閉左腎動(dòng)脈45in，恢復(fù)血供24h后取腎；組為缺血預(yù)適應(yīng)+缺血/再灌注組(I/P+I/R組)，左腎動(dòng)脈夾閉2in，松開(kāi)5in，重復(fù)3個(gè)循環(huán)，余同I/R組。分別用生化學(xué)方法檢測(cè)血肌酐值的變化，組織病理學(xué)評(píng)價(jià)腎小管損傷程度評(píng)分，凝膠電泳遲滯分析檢測(cè)腎組織NF-κB/DNA結(jié)合活性，超遲滯分析檢測(cè)NF-κB亞單位的構(gòu)成，Tunel法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。結(jié)果血清學(xué)檢查及腎小管損傷評(píng)分提示，I/R組腎臟組織病理改變明顯，損傷程度重，與Sha組比擬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕；與I/R組比擬，I/P+I/R組損傷程度那么明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕。凝膠電泳遲滯分析檢測(cè)腎組織NF-κB/DNA結(jié)合活性I/P+I/R組明顯高于Sha組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；超遲滯分析檢測(cè)NF-κB亞單位含有p65、p50；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論腎臟缺血預(yù)適應(yīng)可通過(guò)抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮損傷保護(hù)效應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】腎臟；缺血預(yù)適應(yīng)；核因子-κB；細(xì)胞凋亡Abstrat:bjetiveTinvestigatetheeffetfdifferentdesfrenalisheiantheativityfNF-κBandthepsitinfdierisubunitandtexplretheausativeehanisunderlyingtheattenuatedapptsisfrenaltubularellsiththeestablishentfanialdelsfauterenalishei/reperfusin(I/R)andisheiprenditining(I/P+I/R)inrats.ethds30aleSprague-Daleyratsererandizedint3grups(n=10eah)fllingrightnephretyandislatinftheleftrenalartery.GrupAservedasthesha-peratedntrl,nlyithislatinftheleftrenalarteryandsuturefllingexpsurefr60in.GrupB(I/Rgrup)ratseresubjetedtisheiafr45inbylapingftheleftrenalarteryandsubsequentresuedbldsupply.Grup(I/P+I/R)ratserepre-treatedith3ylesf2-inuteisheiaand5-inutereperfusin.Alltheratseresarifiedat24handnephretyasperfredfranalysis,inludingbiheialdeterinatinftheserureatinine,histpathlgialevaluatinftherenaltubules,eletrphretibilityshiftassay(ESA)frenalNF-кB/DNAbindingativity,supershiftassayfthepsitinfNF-κBplexesinrenaltissuesandterinaldexynuletidyltransferasedUTPnikendlabeling(TUNEL)assayftheapptsisfrenaltubularepithelialells.ResultsSerlgialexainatinsandsresfrenaltubularinjuryrevealedevidenthistpatlgialhangesandseriusinjuryinrenaltissuesingrupB.parediththeshagrup,thediffereneserestatistiallysignifiant(P0.05);paredithgrupB,gruphadarkedlyattenuatedinjuryithsignifiantstatistialdifferenes(P0.05);ESAresultsshedthattherenalNF-кB/DNAbindingativityassignifiantlyhigheringrupthaningrupA,ithsignifiantstatistialdifferenes(P0.05);andsupershiftassayfthepsitinfNF-κBdierisubunitnfiredthepresenefp65andp50ingrup,ithsignifiantstatistialdifferenes(P0.05).nlusinRenalisheiprenditiningattenuatestheapptsisfrenaltubularepithelialellsviatheinhibitinfthetransriptinalativityfNF-кB,andthushastheprtetiveeffetnrenaltissues.Keyrds:kidney;isheiprenditining;nulearfatr-кB;apptsis缺血預(yù)適應(yīng)〔isheiprenditining，IP〕是指臟器短暫缺血/再灌注〔isheia/reperfusin,I/R〕后能耐受更長(zhǎng)時(shí)間的缺血，其內(nèi)在的分子生物學(xué)機(jī)制尚未明了［1］。我們的前期研究說(shuō)明，大鼠腎臟也存在缺血預(yù)適應(yīng)的現(xiàn)象，具有一定的腎臟保護(hù)作用［2］。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可能是缺血/再灌損傷的重要環(huán)節(jié)之一，而核因子-κB〔NF-κB〕是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種抗凋亡和促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄［3］。但對(duì)于腎臟缺血預(yù)適應(yīng)的抗凋亡作用及胞內(nèi)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化特點(diǎn)尚未說(shuō)明。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察腎臟缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及細(xì)胞凋亡的影響，討論腎臟缺血預(yù)適應(yīng)的抗凋亡機(jī)制，為腎臟缺血/再灌注損傷的防治提供重要的理論根據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組安康雄性SD大鼠30只，體重240～250g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。3%戊巴比妥鈉麻醉后，所有動(dòng)物均摘除右腎,穩(wěn)定10in；隨機(jī)分成3組：A組為假手術(shù)組(Sha組，n=10)，只別離左腎動(dòng)脈，暴露術(shù)野60in后直接縫合，24h后取材;B組為缺血/再灌注組(I/R組，n=10)持續(xù)夾閉左腎動(dòng)脈45in，恢復(fù)血供24h后取材；組為缺血預(yù)適應(yīng)+缺血/再灌注組(I/P+I/R組，n=10)，左腎動(dòng)脈夾閉2in，松開(kāi)5in,重復(fù)3個(gè)循環(huán)，余同I/R組。1.2血清學(xué)檢查大鼠腔靜脈采血1l,立即用離心機(jī)3000r/in離心5in,取上清液進(jìn)展血肌酐值測(cè)定。1.3組織學(xué)檢查1.4凝膠電泳遲滯分析(ESA)測(cè)定NF-κB/DNA結(jié)合活性提取腎組織核蛋白，以微量考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定核蛋白濃度，調(diào)至2g/L，并于-70℃保存。按試劑盒(Prega公司)說(shuō)明進(jìn)展：在T4激酶作用下，將γ-32P-ATP(北京亞輝公司)標(biāo)記到NF-κB位點(diǎn)DN(探針)上后純化。將核蛋白抽提物與標(biāo)記的NF-κB探針?lè)错懀瑫r(shí)做特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。超遲滯分析〔supershiftassay〕局部：將2μl抗NF-κB亞單位抗體p65、p50、Rel-B、p52分別在參加探針前參加反響體系，室溫孵育30in，反響產(chǎn)物經(jīng)4%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后，-70℃放射性自顯影，X線膠片上的滯后帶用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)展分析。以相對(duì)密度單位(RDU)表示NF-κB/DNA結(jié)合活性。1.5原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)測(cè)定腎小管上皮細(xì)胞凋亡試劑盒由南京凱基生物公司提供。切片厚5μ,常規(guī)脫蠟入水，經(jīng)3％過(guò)氧化氫室溫處理10in以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3次，蛋白酶K消化30in，然后用PBS緩沖液沖洗3次，參加TUNEL的反響液37℃孵育60in，用PBS緩沖液沖洗3次后加親和素辣根過(guò)氧化物酶，37℃濕盒孵育30in，PBS緩沖液沖洗3次，加DAB試劑顯色，蘇木精染色，脫水、透明、封片。光鏡下觀察凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域，隨機(jī)選取5個(gè)視野，用400倍光鏡計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，以腎小管上皮細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總腎小管上皮細(xì)胞數(shù)的百分比作為腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以±s表示，各組間檢驗(yàn)用方差分析(F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn))。所有數(shù)據(jù)使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析。P0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大鼠血肌酐的變化I/R組和I/P+I/R組大鼠血肌酐值與Sha組比擬都有明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.01〕，但是I/P+I/R組血肌酐值明顯低于I/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕。見(jiàn)表1。表1各組大鼠血肌酐、腎小管損傷積分及AI的比擬〔略〕2.2各組大鼠腎小管損傷積分的變化I/R組腎臟組織病理改變明顯，受損最嚴(yán)重的部位是皮髓交界處、外髓內(nèi)帶的近端小管，主要表現(xiàn)為小管上皮細(xì)胞脫落、刷狀緣消失和腎小管阻塞。與I/R組比擬，I/P+I/R組損傷程度那么明顯減輕，腎小管損傷積清楚顯減少〔P0.05〕見(jiàn)圖1、表1。2.3各組大鼠腎組織NF-κB/DNA結(jié)合活性的變化檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的NF-κB/DNA結(jié)合活性明顯高于Sha組〔2.24±0.15vs.0.69±0.22，1.25±0.20vs.0.69±0.22),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.01〕。I/R+I/P組的NF-κB/DNA結(jié)合活性較I/R組明顯減少(1.25±0.20vs.2.24±0.15)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕。見(jiàn)圖2。這說(shuō)明腎臟缺血預(yù)適應(yīng)可以抑制I/P+I/R組NF-κB/DNA結(jié)合活性。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4凝膠電泳超遲滯分析檢測(cè)I/P+I/R組NF-κB二聚體的構(gòu)成檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明I/P+I/R組NF-κB二聚體亞基含有p65和p50，不含有p52和Rel-B，見(jiàn)圖3。這提示腎臟缺血預(yù)適應(yīng)激活了NF-κB經(jīng)典途徑，可能不通過(guò)非經(jīng)典途徑而發(fā)揮保護(hù)作用。2.5各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況的比擬Sha組偶見(jiàn)凋亡的細(xì)胞，見(jiàn)圖4B；I/R組和I/P+I/R組凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增減加，見(jiàn)圖4、D；與Sha組比擬，再灌注24h后，I/R組和I/P+I/R組凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增減加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.01〕,見(jiàn)表1；與I/R組比擬，I/P+I/R組凋亡的細(xì)胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕,見(jiàn)表1。3討論缺血/再灌注損傷是指缺血期處于可逆損傷的細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)血液供給后轉(zhuǎn)化為不可逆損傷,凋亡越來(lái)越被認(rèn)為是缺血/再灌注時(shí)細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一。而缺血/再灌注損傷造成細(xì)胞凋亡的機(jī)制的非常復(fù)雜。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，越來(lái)越多的證據(jù)說(shuō)明NF-κB在細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用，早期活化的NF-κB通過(guò)促進(jìn)凋亡抑制基因的轉(zhuǎn)錄，抑制促凋亡基因表達(dá)，可以保護(hù)組織細(xì)胞免于凋亡，而后期活化那么使細(xì)胞凋亡加重［3,5-7］。我們?cè)谙惹暗膶?shí)驗(yàn)中證實(shí)了大鼠腎臟存在缺血預(yù)適應(yīng)的現(xiàn)象，同腎臟直接、持續(xù)性缺血相比，預(yù)缺血活化的NF-κB頂峰提早，可以保護(hù)腎臟免受隨后持續(xù)性缺血所引起的損傷作用。當(dāng)應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑處理以后，該保護(hù)作用消失［2,8］。因此本研究采用夾閉左腎動(dòng)脈，缺血2in/再灌注5in重復(fù)3次的方法來(lái)誘導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)，可以使NF-κB早期活化，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。以往的傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為NF-κB的活化主要是促進(jìn)炎癥因子的釋放；隨著研究的深化，發(fā)現(xiàn)NF-κB的作用具有兩面性。在炎癥的不同階段，NF-κB的作用不同甚至相反；可能與其活化的方式、二聚體的組成從而調(diào)控不同的基因有關(guān)［9-10］。本研究結(jié)果說(shuō)明：同腎臟直接、持續(xù)性缺血相比，缺血預(yù)適應(yīng)可以明顯抑制NF-κB的活性，從而減輕了預(yù)處理組的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。雖然I/R組和I/P+I/R組都激活了NF-κB的活性，但兩組大鼠不同的預(yù)后提示:NF-κB可能是處于細(xì)胞生存與凋亡的調(diào)節(jié)點(diǎn)，由于NF-κB的靶基因上存在眾多功能性的κB結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)可能與下調(diào)促凋亡因子的基因表達(dá)，或者通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用有關(guān)。至于詳細(xì)誘導(dǎo)那些基因，那么有待于進(jìn)一步研究。目前主要存在兩條NF-κB激活途徑：一條是經(jīng)典途徑，與先天性免疫有關(guān)，在該途徑中此時(shí)活化的NF-κB二聚體以p65/p50為主［11-12］；另外一條為可替代途徑，其活化的NF-κB二聚體以Rel-B/p52為主，主要與適應(yīng)性免疫功能有關(guān)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)組激活的NF-κB亞單位含有p65、p50，提示缺血預(yù)適應(yīng)組激活了經(jīng)典途徑。本實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)可替代途徑的激活，推測(cè)是由于本次研究的動(dòng)物模型是腎臟急性缺血/再灌注損傷模型，而可替代途徑的激活需要較長(zhǎng)時(shí)間，其主要作用是參與淋巴器官發(fā)育和B細(xì)胞成熟以及促進(jìn)骨骼和皮膚的分化發(fā)育。綜合上述，腎臟缺血預(yù)適應(yīng)可減輕缺血/再灌注損傷，其機(jī)制與抑制NF-κB活性和減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。【參考文獻(xiàn)】［1］urryE,JenningsRB,REierKA.Prenditiningithisheia:adelayflethalellinjuryinisheiyardiu［J］.irulatin,1986,74(5):1124-1136.［2］李鵬，曹長(zhǎng)春.腎臟缺血預(yù)適應(yīng)與IA-1的作用［J］.中華腎臟病雜志,2022,20(3):199-201［3］Barkett,GilreTD.ntrlfapptsisbyRel/NF-κBtransriptinfatrs［J］.ngene,1999,18(49):6910-6924.［4］FuruihiK,adaT,IataY,etal.AdinistratinfFR167653,aneanti-inflaatrypund,preventsrenalishaeia/reperfusininjuryinie［J］.NephrlDialTransplant,2002,17(3):399-407.［5］BruardS,BerberatP,TbiashE，etal.Heexygenase-1-derivedarbnnxiderequirestheativatinftransriptinfatrNF-κBtprtetendthelialellsfrturnersisfatr-α-ediatedapptsis［J］.JBilhe,2002,277(20):17950-17961.［6］angY,ay,KrnelukRG,etal.NF-κBantiapptsis:indutinfTRAF1andTRAF2and-IAP1and-IAP2tsuppressaspase-8ativatin［J］.Siene,1998,281(5383):1680-1683.［7］uX,AZ,PrasadKV,etal.IEX-1L,anapptsisinhibitrinvlvedinNF-κB-ediatedellsurvival［J］.Siene,