實(shí)驗(yàn)3堿裂解法抽提質(zhì)粒dna

實(shí)驗(yàn) 堿裂解法抽提質(zhì)粒學(xué)習(xí)并掌握工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)粒DNA的提取方法。DNA的提取常用堿裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以堿裂解法最為常用。本方法有質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高、快速等優(yōu)點(diǎn)。其原理為：十二烷基磺酸鈉(SDS)和NaOH可使細(xì)菌的細(xì)胞裂解，SDS使細(xì)菌DNA會纏繞附著在細(xì)胞碎片上，強(qiáng)堿會使得細(xì)菌的DNA變性并斷裂為線狀，而共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(cccDNA)的兩條鏈卻不會被變性。當(dāng)外界條件恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性時，線性DNA難以復(fù)性，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,DNAcccDNA并以溶解狀態(tài)存在于液相中，通過離心去除線性，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。DNA氫鍵斷裂，DNADNA分子量相對變性質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型；而線性的大分子量細(xì)菌DNA則不能復(fù)性，與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等形成不溶性復(fù)合物。通過離心沉淀，細(xì)胞碎片、DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒DNARNARNARNA酶（RNAase）消除。再用酚/氯仿處理，可去除殘ector+MrACT1

高壓滅菌 超凈工作 恒溫?fù)u 漩渦振蕩培養(yǎng)用試 量 冰微量離心 微量取液 吸管頭若六、試劑（配制方法見附錄LB培養(yǎng) 氨芐青霉素（Amp，100mg/mL20%溶液 溶液III（-20℃預(yù)冷4N 3MNaAc（pH TE緩沖液（pH8.0） RNAaseA（10mg/mL 70%乙醇飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）在含Amp100ug/mL的瓊脂培養(yǎng)基平板上（劃線或涂抹）培養(yǎng)出單菌落（37，18~20Amp100ug/mLLB液體培養(yǎng)基（3mL/管，挑取單菌落至培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)管傾斜插在搖床中，37搖過夜（200rpm，14~16h18h。如需大量提取，挑取單菌落至接入含50mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃18h。DNA℃1.5mL1.5mLminIRNA5ug/mL150μLI，用漩渦振蕩器充分懸浮菌體。250μLII10多下，溫和5min。180μLIII10多下，溫和10min，或放入-20℃5min（避免min，4℃25℃minμL0.6倍體積異丙醇代替乙醇離心（12000rpm，10min，室溫，倒掉 用0.5mL70%洗DNA沉淀一次，渦旋振蕩，離心5min，倒掉。50~100μLTE（10μL/mLRNA酶）DNA沉淀。37℃放置數(shù)小時，－20℃高拷貝質(zhì)粒DNA3~5μL/mL菌液。此DNA可直接用于限制性內(nèi)切酶切割等反應(yīng)。如需要更高純度的DNA，可進(jìn)一步純化。DNA1×TEDNA100μL100μL酚/氯仿，充分振蕩。離心（12000rpm，5min，吸取上清液。1/103MNaAc2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻。置于－70℃10min以上或－20℃30min至數(shù)小時。離心（12000rpm，15min，4℃，倒掉 ，離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去。用0.5mL70%洗DNA沉淀一次（將質(zhì)粒輕輕彈起，離心10min，倒掉。50~1