生物31酶的制備及活力測定中圖版選修名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎市公開課獲獎課件

3.1酶制備及活力測定第1頁試驗目標和要求1.掌握鹽析法制備活性蛋白質(zhì)原理及方法。2.掌握過氧化物酶活力測定方法。辣根過氧化物酶制備及活力測定第2頁試驗原理過氧化物酶催化以下反應2H2O2→O2+2H2O這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類(hemeproteins)。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細胞代謝氧化還原過程中起主要作用。第3頁試驗原理辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，簡稱HRP，EC.)是植物中研究得最深入一個過氧化物酶，早在20世紀30年代就有些人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。本試驗是以辣根為原料，經(jīng)過水抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度辣根過氧化物酶。第4頁試驗原理辣根過氧化物酶是一個含亞鐵血紅素蛋白質(zhì),Mr在40000左右，等電點7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。HRP可溶于0.58飽和度以下硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶最適pH7.0(對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定，加熱到63℃，在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化還原電勢很低，pH6.08時，E'0=-0.2070V，pH為7.71時，E′0=-0.2787V。第5頁辣根過氧化物酶活力測定方法

1.RZ值：提純工作后幾步，以及純酶溶液可用RZ值表明酶純度。RZ=A403nm/A275nm，403nm處吸收代表血紅素輔基吸收，275nm吸收是蛋白質(zhì)吸收，結(jié)晶HRPRZ值為3.04。測定時酶濃度為1mg蛋白/mL。2.愈創(chuàng)木酚法：測k4。以愈創(chuàng)木酚(鄰甲氧基酚，guaiacol)為氫給體，其反應產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚.有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚生成速度(dx/dt)與底物過氧化氫及氫給體愈創(chuàng)木酚濃度相關。本試驗是采取測定k4方法來判斷酶純度。第6頁試驗步驟一、HRP制備

1.水提?。悍Q取5kg用水沖刷潔凈鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體積水低溫下攪拌提取過夜(亦可采取高速抽提法)。次日用甩干機(或離心機)甩干，搜集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測得總體積。第7頁試驗步驟2.硫酸銨分級分離：在不停攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當于0.40飽和度，0℃)，大約在1～2h內(nèi)加完，置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解后，置冷室過夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min，棄去上清液，搜集沉淀。將沉淀懸浮于100～150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內(nèi)，放在流動自來水中進行透析1～2天，直到硫酸銨透析完成為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢驗)。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2～3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢驗透析外液無氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液體積。第8頁試驗步驟3.丙酮分級分離：將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不停攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至－15℃丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)－15℃丙酮，(操作同上)，靜置后，在冰凍離心機中離心搜集沉淀。將沉淀溶于少許蒸餾水中，透析除丙酮?？傻肦Z值近于1酶溶液。第9頁試驗步驟4.精制：將上步酶液適當稀釋，滴加1mol/L硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10-3mol/L，5000r/min離心10min，得上清液。再將沉淀用少許蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合并，分裝于透析袋內(nèi)，用水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進行真空冰凍干燥(約得20mg)，產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物，HRP產(chǎn)品RZ值可達3.0左右，置真空干燥器中低溫保留。第10頁試驗步驟二、HRP活力測定1.活力測定：測定k4值方法操作以下：取2個比色池(帶蓋，光程1cm)，按表加入反應物。對照樣品反應物磷酸鹽緩沖液2.91mL2.90mL愈創(chuàng)木酚溶液0.05mL0.05mL酶液0.0mL0.01mL酶液：將1mg蛋白/mL酶液用磷酸鹽緩沖液稀釋10倍后使用。第11頁試驗步驟

加好反應物，搖勻，在470nm讀出A470nm值，為t=0時讀數(shù)。馬上加0.01mL40mmol/L過氧化氫溶液于2個比色池中，即刻搖勻并記時，每隔30s讀數(shù)1次，約5min，并記下試驗時室溫。將所測樣品A470nm值減去對應時間對照A470nm值，然后以A470nm值為縱坐標，時間為橫坐標作圖，得一直線，計算出平均每分鐘光吸收增加，即求出△x/△t，按公式(8)求出k4值?；虿磺髃4值，而把在上述條件下，每分鐘A470nm增加0.001所需酶量定為1個HRP活力單位。2.蛋白質(zhì)含量測定：將酶液適當稀釋后，用Bradford法比色測定蛋白質(zhì)含量，第12頁試驗結(jié)果

1.計算產(chǎn)品RZ值及k4值。

2.計算產(chǎn)品比活力。第13頁思索題1.鹽析法制備辣根過氧化物酶原理是什么?2.愈創(chuàng)木酚法測定辣根過氧化物酶原理是什么?3.測定辣根過氧化物酶活力時，要求什么樣pH和溫度?是否需要先測定酶液蛋白質(zhì)含量?第14頁；/膜結(jié)構(gòu)停車棚mqx60jop被子蓋好了，輕輕地說“沒有事兒，放心睡哇！”然后，耿老爹和耿正也急忙洗涮洗涮，就吹燈睡了。耿直和尚武到底年輕好睡，盡管知道今兒晚上可能有事兒，但這小哥倆和衣躺下以后，沒過一會兒就都睡著了，但耿老爹和耿正卻是翻來覆去怎么也睡不著。躺了一會兒，睡在火炕最東邊耿正爬起來，把窗簾往兩邊拉一拉，中間留出一指寬一條縫；想一想，又把靠東邊窗簾折起來拳頭大小一個角。盡管看不到月亮，但夜空很是晴朗，模含糊糊地能看到東房前放著那個用篷布蒙了包裹著壽棺。耿老爹輕輕地說：“睡一會兒哇，即使有事兒也在后午夜！”耿正輕輕答應一聲又躺下了。東邊屋里，郭氏娘兒三個也急忙洗涮完后，就展開被褥準備睡覺了。郭氏突然發(fā)覺一大摞被子下面多了一條褥子，而且褥子下面那張被子看起來鼓鼓囊囊，就問耿英：“英子，這條褥子是你們帶回來？下面那張被子，我看著怎么不對勁兒呢，沒有這么厚哇！”耿英說：“這條褥子是俺們帶回來。還有這被子，都先別管它們了，明兒個再說哇！天兒不早了，咱們睡哇，俺今兒個還真有點兒累了呢！”說著就和衣躺下了。郭氏問：“你怎么不脫了衣服啊？這么睡覺不解乏哇！”耿英只說：“今兒個晚上吃得不少，俺預計要起夜呢！”郭氏說：“那你到時候叫醒娘，娘陪你去啊！”耿英說：“你踏實睡覺哇娘，俺不怕，自家院兒里呢！”于是，郭氏也就不再說什么，吹燈睡了。也難怪，郭氏已經(jīng)是五十出頭人了，這一整天又哭又笑。高興歸高興，身體實在是有些個乏困了，卻也是真?？茨锖兔妹靡呀?jīng)睡熟了，耿英悄悄兒下炕來慢慢打開門，躡手躡腳地挪到堂屋櫥柜前，小心地從里邊抽出了那條三尺多長搟面杖來。然后，小心地拿回屋里輕輕放在自己被褥旁邊。上炕以后，她又慢慢地爬到窗前將窗簾拉開一條縫，恰好能模含糊糊地看到東房前放著壽棺。然后重新躺下，心想，早聽老人們說過，凡是入宅行竊歹人，通常都是在拂曉前最黑暗時候動手，俺應該抓緊時間先睡一會兒！但再一想，萬一睡著了聽不到竊賊來了豈不壞事，于是就不敢靜心睡了。但無奈實在是太累了，以后也就不知不覺地睡著了。朦朧中，耿正突然聽到“咚”一聲。盡管聲音并