siRNA與癌癥治療的探究

siRNA與癌癥治療的探究siRNA的簡介

小干擾RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）有時稱為短干擾RNA（shortinterferingRNA）或沉默RNA（silencingRNA），是長度20到25個核苷酸的雙股RNA，在生物學上有許多不同的用途。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達。此外，也參與一些與RNAi（RNAinterference核糖核酸干擾）相關的反應途徑，例如抗病毒機制或是染色質(zhì)結構的改變、阻斷細胞內(nèi)可能發(fā)生的有害活動，如腫瘤細胞的生長，但是要成功地將siRNA傳送到特異性的細胞中而不對其它細胞產(chǎn)生不利影響還一直是個難題。本次siRNA的結構siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸，圖示如下：

每一股各有一個5'磷酸基末端與一個3'羥基末端。此結構經(jīng)dicer作用而得，dicer是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉(zhuǎn)基因病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)。

此外，siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術導入細胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果。本質(zhì)上，任何已知序列的基因都可以、也因此是經(jīng)過適當剪裁而具有序列互補性的siRNA的作用對象。這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標的一項重要工具。siRNA與癌癥治療的探究RNAi

RNA沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象,是生物抵抗異常DNA(病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高重復的基因組序列)的保護機制,同時在生物發(fā)育過程中扮演著基因表達調(diào)控的角色，它可以通過降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮作用，因此在治療癌癥腫瘤中有很大的應用前景。siRNA與癌癥治療的探究siRNA發(fā)揮RNAi作用的過程

siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA激活的RISC

通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。

另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默。siRNA與癌癥治療的探究歸納siRNA的特點

依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點。

2長度約在22nt左右。1是RISC組分。4生成需要Argonaute家族蛋白存在3植物體內(nèi)也存在內(nèi)源的siRNA。5siRNA在RNAi應用中的缺陷

在RNAi實驗中，化學合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導入細胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA進入細胞后容易被降解；進入細胞siRNA在細胞內(nèi)的RNAi效應持續(xù)時間短。針對這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導的siRNA體內(nèi)表達。該方法的基本思路是：將siRNA對應的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子后，這樣就能在體內(nèi)表達所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默效果。質(zhì)粒表達siRNA的優(yōu)點

通過質(zhì)粒表達siRNAs大都是用PolIII啟動子啟動編碼shRNA(smallhairpinRNA)的序列。選用PolIII啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4—5個連續(xù)的U即終止，非常精確。當這種帶有PolIII啟動子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于，通過siRNA表達質(zhì)粒的選擇標記，siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當然還有一點，那就是由于質(zhì)粒可以復制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。

此外，帶有抗生素標記的siRNA表達載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)粒可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達數(shù)星期甚至更久（比如Clontech（現(xiàn)屬于Takara）的RNAi-Ready表達載體）。另外帶有熒光標記的siRNA表達載體也受到研究者的重視與歡迎，因為帶熒光標記的表達載體，可以讓研究人員通過熒光標記很容易觀察到載體的轉(zhuǎn)染效率及目的基因的沉默效率。可通過熒光顯微鏡觀察含有\(zhòng)shRNA的細胞或通過流式細胞儀富集被轉(zhuǎn)染的細胞。同時熒光蛋白的表達與shRNA的表達是獨立的，因此不影響shRNA基因沉默的效果。帶有標記的siRNA表達載體研究人員將編碼人類端粒酶RNA（humantelomeraseRNA，hTR），長67bp的寡核苷酸引入pSIREN——一種重組腺病毒構建中的穿梭載體。然后將U6-RNA啟動子和siRNA編碼insert從pSIREN上剪切下來，亞克隆進pAdeno-X，構建出了質(zhì)粒pAd-hTR。接著研究人員將pAd-hTR轉(zhuǎn)染進哺乳動物細胞系HEK-293，獲得了攜帶有hTR靶向的siRNA（Ad-hTR-siRNA）的腺病毒。通過一系列的實驗，研究人員證明了Ad-hTR-siRNA介導的端粒酶沉默在HeLa細胞中的作用。同時將Ad-hTR-siRNA與Ad-NT-siRNA進行比對，發(fā)現(xiàn)前者能極大的降低HeLa細胞中hTRmRNA水平（by70.21%），和端粒酶活性（by58.87%）。而且會引起HeLa細胞凋亡。利用Ad-hTR-siRNA進行皮下腫瘤異種移植治療可以減緩腫瘤的生長，其中至少部分是由于體內(nèi)細胞凋亡（P<0.05）?？偠灾?，這些研究結果證明了hTRsiRNA在HeLa細胞系中有效和特異的端粒酶的敲除，從而指出了這種siRNA表達重組腺病毒系統(tǒng)在癌癥基因治療方面的前景。siRNA病毒載體減緩腫瘤生長siRNA在卵巢癌治療中的實驗探究siRNA在胃癌治療中的實驗探究siRNA與癌癥的實驗siRNA在其他癌癥治療中的應用siRNA與癌癥治療的探究

德克薩斯州學M.D.Anderson癌癥中心的項新研究顯示，裝載在一微小的脂肪球中的一種分子開關（siRNA）能夠滲入卵巢癌腫瘤細胞中“掐死”一種討厭的蛋白并明顯縮小腫瘤的尺寸。該項研究的結果刊登在8月15日的ClinicalCancerResearch雜志上，這項研究還成為該期雜志的封面故事。

小鼠模型實驗證實一種強有力的短干擾RNA（siRNA）傳遞系統(tǒng)能夠攻擊癌癥。SiRNA是一種能用于沉默基因關閉有害蛋白制造的偉大技術。在離體實驗中，這種技術的效果很好，但是難點是如何能夠讓它進入到腫瘤中。因為短的RNA片段在沒有被直接注射的情況下無法進入到腫瘤中，并且實驗室用的注射方法在臨床中是不能適用的。

10/27/2022siRNA在卵巢癌癥治療的發(fā)現(xiàn)siRNA與癌癥治療的探究這研究組將能靶向一種促進卵巢癌細胞存活和擴散的蛋白質(zhì)的siRNA轉(zhuǎn)載進一種脂質(zhì)體（一種脂肪球，體積非常小）中。研究人員對感染了三種人類卵巢癌細胞系的小鼠進行了3到5周的處理。這些小鼠接受了含有FAKsiRNA、對照siRNA或空處理。一些小鼠接受了siRNA脂質(zhì)體和化療藥物docetaxel。

實驗結果顯示，接受了FAK沉默脂質(zhì)體的小鼠的腫瘤重量與對照組相比，減少了44％－72％；聯(lián)合使用了FAK沉默脂質(zhì)體和藥物docetaxel的小鼠，其腫瘤腫瘤減少了94％－98％。而且這種聯(lián)合方法對docetaxel抗性卵巢癌細胞系同樣有用。

10/27/2022siRNA與癌癥治療的探究10/27/2022武漢大學中南醫(yī)院胃腸科教授鄧長生在InternationalImmunopharmacology上發(fā)表RNAi文章，解析以siRNA治療胃癌的新成果。胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥致死原因中列第二。武大中南醫(yī)院鄧長生教授、夏冰教授等在先前的研究中發(fā)現(xiàn)了多個易感基因，與湖北漢族人胃癌顯著相關，尤其是在湖北漢族人群腫瘤壞死因子基因位點上，檢測出一新的等位基因，為胃癌的早期診斷和治療提供了一項新方法。找到靶位基因后，鄧長生教授等嘗試用最新的RNAi技術治療胃癌。鄧教授研究小組以survivin為靶位設計siRNA，構建了一個Psilencer2.1-surivinsiRNA質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導入胃癌MGC-803細胞系中，同時還將該細胞系注入裸鼠體內(nèi)，觀察該siRNA的效果。結果發(fā)現(xiàn)，小鼠細胞內(nèi)的surivin基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量顯著下降，并且surivin蛋白表達量也下降，癌細胞凋亡率升高。總的來說，該siRNA靶位可有效的抑制胃癌細胞增殖，可能成為胃癌的潛在治療靶位。siRNA在胃癌癥治療的發(fā)現(xiàn)siRNA與癌癥治療的探究10/27/2022Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，Survivin功能復雜，具有抑制細胞凋亡，促進細胞轉(zhuǎn)化并且參與細胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生等作用。目前，Survivin已成為研究的熱點。Survivin在人類各種腫瘤組織癌細胞中含量很豐富，但在正常細胞中卻幾乎不存在。體內(nèi)外研究表明，Survivin可在多種轉(zhuǎn)化細胞系中表達，并見于所有人類最常見的腫瘤組織，包括肺癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。Survivin蛋白質(zhì)結構siRNA與癌癥治療的探究靶向survivin的siRNA對胃癌BGC-823細胞增殖的影響

設計并合成3條靶向survivin的小分子干擾RNA(siRNA),構建表達性干擾RNA質(zhì)粒(shRNA)shRNAsurvivin-1、shRNA-survivin-2和shRNA-survivin-3,分別轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細胞,實時定量PCR檢測干擾RNA沉默survivinmRNA表達效果,Westernblot觀察對胃癌BGC-823細胞survivin蛋白質(zhì)表達的抑制,MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法分析檢測細胞生長抑制率,流式細胞計數(shù)檢測各組細胞周期和凋亡率,探討干擾RNA對胃癌BGC-823細胞生長的影響。10/27/2022siRNA與癌癥治療的探究結果在體外,shRNA-survivin-1有效沉默人胃癌BGC-823細胞survivinmRNA的表達,使survivinmRNA相對水平明顯降低(P<0.05),survivin蛋白質(zhì)表達抑制,72h細胞生長抑制率達74.92%(P<0.05),shRNA-survivin-1使G2/M期細胞百分比明顯增加,凋亡率顯著增加(P<0.05)。

結論shRNA-survivin-1可以沉默survivin基因的表達,可以顯著抑制胃癌BGC-823細胞的增殖,在一定程度上誘導其自發(fā)凋亡。10/27/2022siRNA與癌癥治療的探究