轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究概況課件

第九章我國轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究概況1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物前景廣闊提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速度改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)珍稀藥用蛋白的生產(chǎn)（生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器）提供器官移植的供體23第一節(jié)豬的基因工程育種一、立項(xiàng)背景和研究目標(biāo)1、我國是傳統(tǒng)的養(yǎng)豬大國，是世界上養(yǎng)豬最多的國家。

就全國而言,生豬存欄和出欄基本保持平穩(wěn)發(fā)展,存欄和出欄呈現(xiàn)同步發(fā)展的趨勢(shì)。2008年3月存欄4.1億頭，6月達(dá)到4.7億頭。能繁母豬比重超過12%。4Meatstructure,%chickenBeefandmuttonpork5不同品種豬-毛色黑色毛色為黑白花、除頭、耳、背、腰、臀為黑色外，其余均為白色，黑白交界處有4～5cm的黑皮白毛的灰色帶

7毛色為中間白，兩頭烏為特征。又稱“兩頭烏”。但也有少數(shù)豬在背部有黑斑。

體毛黑色，四肢末端為白色

8被毛黑色，在肩和前肢有一條白帶圍繞被毛灰白，夾有黑斑，雜有部分紅色。10頭大，額皮中部隆起成塊，俗稱“蓋碗”嘴筒長(zhǎng)直頭型11頭中等大，面微凹頭中等大，面直12耳小而立耳小向前平伸，14耳型耳特大，下垂耳小豎立15體型腹大下垂，背平腹大拖地，背凹17體型腹大下垂，不拖地腹大下垂，不拖地18四肢外展X型內(nèi)展19幾個(gè)概念活體重胴體重瘦肉率眼肌肉質(zhì)性能20豬的宰前活重（kg)宰前12小時(shí)停食稱重屠宰日齡按當(dāng)?shù)亓?xí)慣并注明

21胴體重胴體重：去除頭、蹄、尾、內(nèi)臟、包括板油、腎的左右兩半胴體總重。22眼肌面積測(cè)量最后肋骨處背最長(zhǎng)肌橫斷面面積，用硫酸紙描繪眼肌面積（2次）24眼肌面積測(cè)量2用硫酸紙描繪眼肌面積（2次），用求積儀或方格計(jì)算紙求出眼肌面積（cm2）或用下列公式：眼肌面積（cm2）=眼肌高度（cm）×眼肌寬度（cm）×0.7眼肌高度眼肌寬度253、豬是單胃動(dòng)物，飼料的主要成份是糧食和塊根、塊莖。所以，豬的飼料和人的口糧是競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系，不是互補(bǔ)的關(guān)系。養(yǎng)豬太多和豬的飼料轉(zhuǎn)化效率太低，將會(huì)給種植業(yè)帶來很大負(fù)擔(dān)。2728養(yǎng)豬主產(chǎn)區(qū)主要分布在糧食主產(chǎn)區(qū)應(yīng)為比較合理的布局當(dāng)前我國生豬生產(chǎn)主要集中在四川盆地、黃淮流域玉米、小麥主產(chǎn)區(qū)、東北玉米主產(chǎn)區(qū)和長(zhǎng)江中下游水稻主產(chǎn)區(qū)等四大地區(qū)。從畜牧經(jīng)濟(jì)學(xué)角度出發(fā)，養(yǎng)豬業(yè)為耗糧型畜牧業(yè)，需要消耗大量的玉米等糧食作物，為降低成本，將糧食就地轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品，以提高農(nóng)作物附加值，養(yǎng)豬主產(chǎn)區(qū)主要分布在糧食主產(chǎn)區(qū)應(yīng)為比較合理的布局。

294、在制訂“863”計(jì)劃生物技術(shù)領(lǐng)域“七五”計(jì)劃時(shí)，很自然的把利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)生長(zhǎng)速度快、飼料報(bào)酬高的基因工程豬作為動(dòng)物生物技術(shù)的首要課題。5、課題的目標(biāo)是通過10-15年的研究，利用在豬體內(nèi)表達(dá)外源性豬的生長(zhǎng)激素基因，生產(chǎn)出增重速度提高20％，飼料消耗節(jié)約15％，并能保持我國豬肉特有品質(zhì)的基因工程豬品種。30二、目的基因的分離和表達(dá)載體的構(gòu)建在我國設(shè)立轉(zhuǎn)基因豬的研究課題之前，已有美國、英國和澳大利亞等三個(gè)國家設(shè)立了同樣的課題。美國利用現(xiàn)成的人生長(zhǎng)激素基因作為目的基因，英國利用牛的生長(zhǎng)激素基因，澳大利亞則構(gòu)建了含有豬生長(zhǎng)激素基因cDNA片段和染色體組基因片段的混合結(jié)構(gòu)（mini-gene）。

31此外一些與豬生產(chǎn)性能有關(guān)的基因豬應(yīng)激敏感基因(RYR1),Ch6,PSE肉,應(yīng)激雌激素受體基因(ESR),Ch1,產(chǎn)仔數(shù)促卵泡素β亞基基因(FSHβ),Ch2，產(chǎn)仔數(shù)RN基因,Ch15,酸肉,Napole產(chǎn)量黑素皮質(zhì)激素受體4(MC4R)基因,Ch1,ADG,BF,FI心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)基因,Ch6,IMF脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP)基因,Ch4,IMF豬肌肉生長(zhǎng)抑制素(MYOG),Ch9,瘦肉率32蘭尼定受體(RYR1)/氟烷基因(Hal)1843C>T突變位點(diǎn)是造成豬應(yīng)激綜合癥的主效基因位點(diǎn)。

HhaⅠ酶切

對(duì)于Hal基因，淘汰nn、Nn個(gè)體，留用NN個(gè)體。

33雌激素受體基因(ESR)

ESR基因是影響豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因

PvuⅡ酶切

發(fā)現(xiàn)BB型比AA型豬頭胎總產(chǎn)仔數(shù)高3.37頭

34克隆的豬生長(zhǎng)激素基因全長(zhǎng)約5.0kb，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子以及5ˊ端和3ˊ端調(diào)控序列組成。目的基因的分離和表達(dá)載體的構(gòu)建

以豬生長(zhǎng)激素為例豬生長(zhǎng)激素Genomic基因結(jié)構(gòu)序列被置于羊MT基因啟動(dòng)子控制之下，轉(zhuǎn)基因在豬體內(nèi)將受重金屬離子誘導(dǎo)而表達(dá)。5′MAR有屏蔽相鄰基因影響的作用，而3′端增加微衛(wèi)星旨在提高整合率。351、分離了2.5kb的一個(gè)豬生長(zhǎng)激素基因片段，除去了它的5ˊ端和3ˊ端調(diào)控序列，只保留它的4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。2、將這個(gè)2.5kb的豬生長(zhǎng)激素基因融合到長(zhǎng)度為1.1kb羊MT－1基因啟動(dòng)子的下游,構(gòu)建成oMT／pGH融合基因，是目的基因的基本表達(dá)結(jié)構(gòu)。3、為了基因的整合效率，還在融合基因的下游3’增加了一段豬的微衛(wèi)星DNA序列；4、而在它的5ˊ端，又裝上雞溶菌酶基因的MAR序列，目的是為了克服或者更準(zhǔn)確地說是減少基因表達(dá)時(shí)受鄰近基因的干擾，便于從體外調(diào)控基因的表達(dá)。為了能夠人為地控制外源性豬生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)，采取了基因融合表達(dá)的戰(zhàn)略，用羊的重金屬螯合蛋白MT－1基因啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)豬的生長(zhǎng)激素結(jié)構(gòu)基因表達(dá).3637

我國是首先使用豬的染色體組基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的，實(shí)踐證明，這種結(jié)構(gòu)是有很多優(yōu)點(diǎn)的。第一、是沒有異種蛋白質(zhì)表達(dá)，生產(chǎn)出的豬仍然是純天然的；第二、基因表達(dá)適度和可控性強(qiáng)，表現(xiàn)在生產(chǎn)出生長(zhǎng)速度比對(duì)照快70％的轉(zhuǎn)基因豬，而健康狀況同正常豬沒有差別；第三、豬的死亡率低，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的效率比同類實(shí)驗(yàn)約高出一倍。38（一）母豬的超數(shù)排卵直到目前為止，全世界生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的主要方法仍然是直接向單細(xì)胞的胚胎注射純化的DNA分子。在這種技術(shù)體系中，對(duì)母豬進(jìn)行激素處理，使其生產(chǎn)大量受精卵，是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的先決條件。

要點(diǎn)：1、摸索出超排時(shí)激素的最佳劑量2、多獲得處于單細(xì)胞階段的原核期的胚胎三、轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的建立3940應(yīng)該在發(fā)情周期的第15-18天，按每公斤體重一次肌肉注射15個(gè)單位的用孕馬血清促性腺激素

PMSG，促進(jìn)卵巢上卵泡的發(fā)育。在注射PMSG第72小時(shí)，每頭豬一次注射人絨毛膜促性腺激素

HCG500單位，促進(jìn)卵子的排出，并在注射HCG后立刻進(jìn)行自然交配或人工授精（表6-1）。

例：湖北白豬41什么時(shí)候沖卵可以得到較高比例的單細(xì)胞胚胎，要靠大量實(shí)驗(yàn)才能找到。除了促進(jìn)母豬多排卵以外，多獲得處于單細(xì)胞階段的原核期的胚胎也是至關(guān)重要的，因?yàn)橹挥信咛ピ趩渭?xì)胞階段時(shí)，才能用于基因轉(zhuǎn)移。但是，豬是持續(xù)排卵的動(dòng)物，卵子從卵巢上排出是一個(gè)連續(xù)過程，從排出第一個(gè)卵到排出最后一個(gè)卵，往往要持續(xù)數(shù)小時(shí)。42在注射PMSG之后的124-129小時(shí)之間沖卵，可以獲得較高比例的單細(xì)胞胚胎(表6-2)。在注射HCG后立刻進(jìn)行自然交配或人工授精。大群豬的超排實(shí)驗(yàn)證明，激素處理可以使受精卵的獲取量提高2.1倍。43自體移植：就是從一頭豬的體內(nèi)沖出單細(xì)胞胚胎之后，經(jīng)體外注射DNA處理，再把胚胎移植回同一頭豬的體內(nèi)。條件：1、必須能夠通過超排處理，一次獲得較多胚胎，因?yàn)樵跊_卵過程中和顯微注射時(shí)都會(huì)損失一部分胚胎，如果超排處理兩頭供體才能夠移植一頭受體，就不可能實(shí)行自體移植。2、顯微注射技術(shù)必須很熟練，能在很短時(shí)間內(nèi)完成注射并且胚胎注射后的死亡率要很低，否則豬要長(zhǎng)時(shí)間等在手術(shù)臺(tái)上，對(duì)其健康和轉(zhuǎn)基因后胚胎的成活都不利。（二）自體移植技術(shù)在提高轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)效率中的作用44優(yōu)點(diǎn)：不但可以省去受體豬，而且豬的受孕率和產(chǎn)仔率均顯著高于異體移植（表6-3）。原因：有可能是胚胎與母體發(fā)育同期化的程度比異體移植的受體好，也可能胚胎和母體間的相容性比異體好。45轉(zhuǎn)基因豬的篩選一般是用PCR擴(kuò)增特異DNA片段或用斑點(diǎn)雜交作為初篩手段，然后用southern雜交來進(jìn)一步證實(shí)。

（三）外源GH基因定位和考貝數(shù)的測(cè)定46PCRSOUTHERN47但是，對(duì)于培育轉(zhuǎn)基因品種和目的基因穩(wěn)定性研究來說，只知道基因是否已經(jīng)整合是不夠的，還應(yīng)當(dāng)知道基因在染色體上的整合位點(diǎn)和整合的考貝數(shù)。481、選用經(jīng)過斑點(diǎn)雜交和southern雜交證明是轉(zhuǎn)基因陽性的豬6頭，從靜脈采血各5毫升，盛入放有肝素的生理鹽水中搖勻并放在4℃中靜置，使紅血球沉降至管子的底部。2、取上層的血漿層0.5毫升，接種于含有青霉素、鏈霉素和20％胎牛血清的RPM1/1064培養(yǎng)基中，使血淋巴細(xì)胞增殖．經(jīng)過在37℃下培養(yǎng)60小時(shí)后，加入100μg/ml5ˊ-Brd11，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。3、經(jīng)過洗滌之后，將細(xì)胞重新懸浮在含有2.5μg／ml胸腺嘧啶的新鮮培養(yǎng)基中，放置在37℃下再培養(yǎng)6小時(shí)，并于培養(yǎng)結(jié)束之前30分鐘加入秋水仙素0.04μg/ml。方法：494、細(xì)胞制備完畢，按常規(guī)方法制成外周血淋巴細(xì)胞的染色體標(biāo)本。5、用地高辛（Dig－11－dUTP）通過缺口翻譯的方法標(biāo)記探針。6、將標(biāo)記好的探針去雜交固定在玻片上的豬染色體，分子雜交之后，在PBS中洗滌玻片，并在除去多余的PBS之后，立即滴上膠體金標(biāo)記反應(yīng)液（10μl膠體金標(biāo)記的抗Dig抗體，加290μl含1mg/mlBSA的PBS），室溫下反應(yīng)30分鐘，用凈水多次洗滌，除去氯離子。7、在每張玻片上滴100μl銀增加劑，在室溫中避光放置30分鐘，洗去反應(yīng)劑。8、標(biāo)記完畢的染色體標(biāo)本經(jīng)Giemsa和Hoechst33258染色顯帶，玻片自然干燥后就可以在顯微鏡下觀察結(jié)果。在顯微鏡下挑選中期相染色體清楚的細(xì)胞數(shù)十個(gè)到數(shù)百個(gè)，計(jì)算有銀粒附著的頻率，將銀粒附著頻率最高的染色體位點(diǎn)，定為外源基因整合的位點(diǎn)。50計(jì)算基因整合的考貝數(shù)：方法：1、提取組織中的DNA，再用同位素標(biāo)記的探針去雜交，制成一系列濃度梯度樣品。2、利用FJ-2101型雙道液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)算樣品放射性讀數(shù)，按公式計(jì)算不同樣品基因考貝數(shù)，取其平均數(shù)作為外源基因整合的大致考貝數(shù)。一般文獻(xiàn)中計(jì)算基因整合的考貝數(shù)，都是比較樣品DNA與質(zhì)粒DNA標(biāo)記物的強(qiáng)度，大致估計(jì)出外源基因的考貝數(shù)。我們?cè)谘芯恐胁捎昧朔派湫詷?biāo)記物計(jì)數(shù)的方法，也可以估計(jì)基因的考貝數(shù)。51四、轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)

此表列出了課題生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的情況，同時(shí)在表中也列出了美國、英國和澳大利亞進(jìn)行同類實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，以資比較。

52五、外源基因的遺傳穩(wěn)定性

外源基因一旦整合到豬的染色體上，其遺傳是穩(wěn)定的。例：一個(gè)家系的4代轉(zhuǎn)基因豬中外源GH基因的追蹤試驗(yàn)，可以肯定地證明從G0代傳到G3代時(shí)，基因仍穩(wěn)定地整合在同一條染色體上(表6-7)。這個(gè)家系的豬都在第13號(hào)染色體上含有外源的生長(zhǎng)激素基因。

5354六、轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)性能1、經(jīng)過對(duì)三個(gè)世代的轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行嚴(yán)格的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證明表達(dá)外源性生長(zhǎng)激素基因的確可以提高豬的生長(zhǎng)速度，飼料轉(zhuǎn)化效率和瘦肉率。2、在飼料中蛋白質(zhì)含量達(dá)到18％的條件下，轉(zhuǎn)基因豬的生長(zhǎng)速度提高10－15％，飼料報(bào)酬和瘦肉率提高10％左右。與美國Pursel等和澳大利亞Vize等得到的結(jié)果很相似（Purseletal1989;Vizeetal，1988年）。553、美國Pursel等人得到的轉(zhuǎn)基因豬出現(xiàn)了嚴(yán)重的負(fù)作用，表現(xiàn)出各種病理狀況，而澳大利亞和我國生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因豬似乎很健康。美國Pursel等人生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬時(shí)使用了人的生長(zhǎng)激素基因，而澳大利亞和我國使用的是豬的生長(zhǎng)激素基因。56七、轉(zhuǎn)基因豬研究的發(fā)展前景（表6-8）轉(zhuǎn)基因豬分類：第一類：豬一切表現(xiàn)都正常，生長(zhǎng)速度提高了10－15%，飼料轉(zhuǎn)化效率提高了10%；第二類：豬表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)特性，生長(zhǎng)速度可以提高50%以上，生產(chǎn)每公斤體重可以節(jié)約飼料三分之一，但性狀不能遺傳；第三類：豬是一些因外源基因的插入而產(chǎn)生各種畸變的個(gè)體。

主要問題：轉(zhuǎn)基因豬外源基因傳了七代仍未生產(chǎn)出純合的轉(zhuǎn)基因家系，給轉(zhuǎn)基因豬的發(fā)展前景蒙上一層陰影。57表6.8轉(zhuǎn)基因豬的生長(zhǎng)速度和飼料報(bào)酬58突破方面：1、用豬作為一種生物反應(yīng)器已有很成功的例子，美國已在豬的乳腺中表達(dá)了人的C蛋白基因，表達(dá)水平達(dá)到1克／升（Velanderetal，1992年）。也許還可以在豬的血液中表達(dá)某些血液蛋白，使豬的血液變成養(yǎng)豬業(yè)中的一種副產(chǎn)品，這適用于生產(chǎn)那些用量大和單位價(jià)格不太高的產(chǎn)品，如人的血清白蛋白和血紅蛋白等。2、豬的器官作為人的器官移植供應(yīng)來源.3、就改善豬的經(jīng)濟(jì)性狀而言，還有其它一些侯選基因和新的技術(shù)思路。如組織特異性表達(dá)外源性生長(zhǎng)因子或通過基因定位整合技術(shù)提高內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的表達(dá)量，就是很好的探索途徑。59第二節(jié)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器一、立項(xiàng)背景和項(xiàng)目的總體目標(biāo)背景：1987年，美國NIH的科學(xué)家與IntegratedGerutics公司合作，首次展示了用動(dòng)物乳腺生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的可能性（Gordonetal，1987年）。在此后的5年時(shí)間內(nèi)，若干有醫(yī)學(xué)價(jià)值的蛋白質(zhì)基因在牛和羊等大動(dòng)物的乳腺中獲得高效表達(dá)(simonsetal，1988；wall，etal1991年；ebertetal，1991年；krimpenfortetal，1991)。60總體目標(biāo)：建立有效的技術(shù)體系，在目的基因、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、純化工藝和基地建設(shè)等主要技術(shù)環(huán)節(jié)上取得實(shí)破，使我國可以有效地在動(dòng)物乳腺生產(chǎn)高價(jià)值的蛋白質(zhì)，為產(chǎn)業(yè)化打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。一、立項(xiàng)背景和項(xiàng)目的總體目標(biāo)61

目的基因是動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研究的關(guān)鍵問題。

動(dòng)物乳腺表達(dá)外源基因優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)量高、產(chǎn)品生物活性好和原料成本低。

對(duì)象：用量大和需要翻譯后加工的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

原因：發(fā)揮動(dòng)物乳腺的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也是為了不與現(xiàn)有的其它基因表達(dá)體系產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。二、目的基因研究62這些產(chǎn)品大都是血液蛋白和具有特殊營養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)，產(chǎn)品的用量都比較大，難以用其它系統(tǒng)生產(chǎn)。

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1997后，更多的公司加入動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)的開發(fā)，使用的目的基因也更加多樣化。分類：抗體，細(xì)胞因子、疫苗、組織修復(fù)材料、受體、激素、食用蛋白和滋補(bǔ)藥等8大類產(chǎn)品（Ｗall,1999）。我國開始進(jìn)行動(dòng)物乳腺生物應(yīng)器技術(shù)的大規(guī)模研究，比國外晚大約10年時(shí)間。在選擇目的基因時(shí)，主要考慮問題首先是產(chǎn)品有無市場(chǎng)前景，其次考慮有無自己的知識(shí)產(chǎn)權(quán)（表6-10）。64說明：在“九五”的主要目標(biāo)是建立技術(shù)體系，對(duì)于目的基因沒有進(jìn)行嚴(yán)格審查和限制。65三、乳腺組織特異性表達(dá)載體研究

動(dòng)物乳腺組織特異性高效表達(dá)載體是研制動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的重要生物元件，外源基因在動(dòng)物乳腺中的高效表達(dá)，必須依賴好的表達(dá)載體表（表6-11）。66動(dòng)物乳腺組織特異性表達(dá)載體作為一種重要生物元件，受知識(shí)產(chǎn)權(quán)法規(guī)的保護(hù)，國外公司已紛紛申請(qǐng)專利。英國PPL公司申請(qǐng)了BLG的專利，美國Genyme公司申請(qǐng)了β－casein的專利，而荷蘭的Pharming公司申請(qǐng)了αsi-casein的專利。但是這些公司都沒有在中國申請(qǐng)專利，我們?nèi)匀豢梢栽趪鴥?nèi)自由地使用這些載體。我們已完成了BLG和αsi-casein表達(dá)載體的構(gòu)建，并申請(qǐng)了專利保護(hù)。

67動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的操作過程 獲取目的基因（例如血清白蛋白基因）→構(gòu)建基因表達(dá)載體（在血清白蛋白基因前加特異表達(dá)的啟動(dòng)子）→顯微注射導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵中→形成胚胎→將胚胎送入母體動(dòng)物→發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（只有在產(chǎn)下的雌性個(gè)體中，轉(zhuǎn)入的基因才能表達(dá)）。68轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的瓶頸，極大地限制了這項(xiàng)重要技術(shù)的發(fā)展。目前：生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要技術(shù)仍然是向原核期胚胎直接注射純化的DNA分子。

優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性非常好

缺點(diǎn)：不能保證經(jīng)過注射DNA的胚胎都發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，即使已經(jīng)準(zhǔn)確無誤地將幾百個(gè)考貝的DNA分子注入到每一個(gè)胚胎的原核中，發(fā)育成功的幼畜中仍然只有一小部分是整合了外源DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。成功率：綿羊、山羊和豬——1/100;牛——1/500。四、轉(zhuǎn)基因技術(shù)

69技術(shù)路線：

第一種技術(shù)路線是，對(duì)供體母畜實(shí)行激素超排處理，然后進(jìn)行手術(shù)沖取原核期胚胎，在體外進(jìn)行DNA顯微注射后，再把它們移植到同期發(fā)情的受體母畜體內(nèi)。國際上通用的方法。優(yōu)點(diǎn)：注射后的胚胎直接移植到母體內(nèi)發(fā)育，因而每百枚移植的胚胎可以得到較多的仔畜（表6-12）。

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第二種技術(shù)路線是，體外受精技術(shù)加顯微注射。這種技術(shù)不需要供體母畜，直接從屠宰場(chǎng)收集新鮮卵巢，吸取未成熟卵母細(xì)胞，體外培養(yǎng)成熟和體外受精，發(fā)育成的原核胚顯微注射DNA后繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚時(shí)再移植到受體動(dòng)物體內(nèi)?；谠嚬軇?dòng)物技術(shù)和顯微注射相結(jié)合的一種工藝。

優(yōu)點(diǎn)：可以利用屠宰場(chǎng)大量的廢棄卵巢，把實(shí)驗(yàn)規(guī)模做得很大。缺點(diǎn)：需要有很好的體外培養(yǎng)條件，有時(shí)還需要具備有效的胚胎冷凍技術(shù)。Z24－01課題利用新西蘭豐富的卵巢資源，在國外租用實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，注射了兩萬多枚胚胎，冷凍保存了幾千枚注射DNA后發(fā)育而成的囊胚（表6-13）。7273

第三種技術(shù)路線是，通過體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因（表6-14）。先在培養(yǎng)的體細(xì)胞中完成基因轉(zhuǎn)移，然后用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞作核供體，用體外培養(yǎng)的去核卵母細(xì)胞作細(xì)胞質(zhì)受體，經(jīng)過核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎。優(yōu)點(diǎn)：充分運(yùn)用了在體細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因和篩選整合外源基因的細(xì)胞系的高效率，并通過克隆過程和將體細(xì)胞直接變成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。742002年9月28日至10月7日，青島森淼實(shí)業(yè)有限公司與中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所成功地克隆出４只帶有醫(yī)用蛋白的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆奶山羊。75表6-14體細(xì)胞克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物重構(gòu)胚胎數(shù)發(fā)育胚胎數(shù)囊胚數(shù)囊胚率 綿羊337318

64 19%奶牛 88574527831.4%首先，它克服了必須在胚胎的原核期注射DNA的限制，改為向培養(yǎng)的體細(xì)胞轉(zhuǎn)移DNA，把基因轉(zhuǎn)移的工作由現(xiàn)場(chǎng)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，由季節(jié)性變成常年性，使工作更加從容。其次，由于生產(chǎn)出來的仔代全部都是轉(zhuǎn)基因個(gè)體，而且可以預(yù)選性別，可使受體動(dòng)物的數(shù)目大大減少，節(jié)約大量運(yùn)作成本。第三，可以按照市場(chǎng)需要，一次性建立生產(chǎn)畜群，節(jié)約產(chǎn)品投產(chǎn)時(shí)間。體細(xì)胞克隆的方法將取代現(xiàn)有的方法，成為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要技術(shù)。優(yōu)越性：76第三節(jié)器官移植用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

一、項(xiàng)目的主要目標(biāo)器官移植是挽救人的性命的重要醫(yī)學(xué)手段，是一種沒有其它方法可以代替的醫(yī)療技術(shù)。在所有家養(yǎng)動(dòng)物中，豬被認(rèn)為是最適宜向人類供應(yīng)器官的動(dòng)物，因?yàn)樗钠鞴俚某叽绾驮S多生理特點(diǎn)更接近于人類。但是，要把豬的器官變成可供人類使用的器官，需要闖過三個(gè)關(guān)口。首先用基因工程技術(shù)克服“超急性排斥”，然后再設(shè)法克服“延緩性排斥”。77引起人體免疫系統(tǒng)對(duì)豬的器官產(chǎn)生“超急性排斥”反應(yīng)的，主要是豬器官細(xì)胞表面的G抗原。G抗原的形成，是半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的作用，致使豬器官細(xì)胞表面形成了GALα1－3GAL的表位，能被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別為異物，從而加以排斥。

最根本和最重要的是去掉合成G抗原的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因，其次是抑制補(bǔ)體系統(tǒng)和Ｔ淋巴細(xì)胞。

去除排斥反應(yīng)78二、研究工作的主要進(jìn)展1、目的基因的克隆

α一半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因（α－GT基因）：用反義RNA的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬，以便檢測(cè)在α－GT基因表達(dá)量減少的情況下，豬的器官在移植到具有H抗原的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中時(shí)，受排斥程度是否會(huì)降低。

FASL基因：ASL基因是調(diào)節(jié)Ｔ淋巴細(xì)胞凋亡的重要因素，T細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞之后，首先表達(dá)FAS基因，使淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生大量效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行攻擊，達(dá)到殺死和排斥異體細(xì)胞的目的。在靶細(xì)胞消失之后，淋巴細(xì)胞表達(dá)FASL基因，在細(xì)胞表面形成配體。配體FASL和另一個(gè)細(xì)胞表面的受體FAS相互作用，激活細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞自行凋亡。如果靶組織的細(xì)胞表面也表達(dá)FASL配體，遭遇淋巴細(xì)胞攻擊時(shí)，不但不會(huì)被殺死，反而會(huì)造成淋巴細(xì)胞凋亡，從而造成機(jī)體的免疫耐受，便于接納異種器官移植。

DAF基因和MCP基因：阻止補(bǔ)體復(fù)合物的形成，大量表達(dá)DAF和MCP基因產(chǎn)物，可以有效抑制人體補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)豬器官的毒殺。792、轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)及目的基因功能研究郭禮和等人用他們克隆的α－GT基因構(gòu)建了反義RNA表達(dá)結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過雜交的方法得到了基因純合的小鼠品系。經(jīng)過對(duì)小鼠的各種組織進(jìn)行RT－PCR和免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)，證明各種組織G抗原的表達(dá)量都有不同程度的下降。郭禮和等人還用FASL基因生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠，這種小鼠的腦組織被移植到患有帕金森氏癥的大鼠腦組織中后，小鼠的組織可以耐受大鼠免疫系統(tǒng)的攻擊，大鼠的病情明顯好轉(zhuǎn)。802、轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)及目的基因功能研究孫方臻等人用DAF基因生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠，利用人血漿體外灌注系統(tǒng)對(duì)部分小鼠進(jìn)行抗超急性排斥反應(yīng)（HAR）的檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，對(duì)照小鼠的心臟在灌注人的血漿之后，心臟和心電活動(dòng)的持續(xù)時(shí)間平均為110分鐘，而不同轉(zhuǎn)基因小鼠個(gè)體心電和心跳的持續(xù)時(shí)間，可以達(dá)到130－260分鐘。813、轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院魏慶信等人利用α－GT反義基因和DAF基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)（表6-15）。

對(duì)初篩出來的陽性hDAF基因豬進(jìn)行染色體原位雜交表明，有6頭原代轉(zhuǎn)基因豬在