保健食品抗氧化功能的斑馬魚(yú)檢測(cè)

保健食品抗氧化功能的斑馬魚(yú)檢測(cè)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了一種保健食品抗氧化功能的快速檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于保健食品產(chǎn)品、配方和原料抗氧化功能的快速檢測(cè)和篩查。有以下特征的受試物不適用于本標(biāo)準(zhǔn)的方法：——受試物不能溶解、乳化或制備成均勻分散的懸浮液；——受試物溶液顏色較深或不溶性顆粒，對(duì)測(cè)試的干擾無(wú)法消除；——受試物會(huì)產(chǎn)生自體熒光，對(duì)測(cè)試的干擾無(wú)法消除。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21808化學(xué)品魚(yú)類(lèi)延長(zhǎng)毒性14天試驗(yàn)GB14924.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)SN/T0476進(jìn)出口鹵蟲(chóng)卵檢驗(yàn)方法NY5073無(wú)公害食品水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量NY5072無(wú)公害食品漁用配合飼料安全限量GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)及定義無(wú)可觀(guān)察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration（NOEC）與對(duì)照相比，對(duì)試驗(yàn)生物未產(chǎn)生顯著效應(yīng)的最高受試物濃度。［來(lái)源：GB/T21808,2.5］。親魚(yú)指用來(lái)繁殖測(cè)試所需魚(yú)卵的成年斑馬魚(yú)?；钚匝醮豶eactiveoxygenspecies（ROS）是含氧的化學(xué)物質(zhì)，包括：0廣、H2O2及HO2?、?OH等，是體內(nèi)氧化反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是體內(nèi)過(guò)氧化效應(yīng)產(chǎn)生的根源,與人體衰老、慢性炎癥、癌癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防和治療密切相關(guān)。方法原理體內(nèi)的ROS水平高低是由體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)所決定。體內(nèi)ROS水平上升時(shí)，會(huì)消耗體內(nèi)抗氧化物質(zhì)，如果體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的合成速度慢且抗氧化酶對(duì)ROS的清除速度不夠快時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白的過(guò)氧化水平升高，引起衰老等跟過(guò)氧化相關(guān)的生理現(xiàn)象。如果受試物能夠加快體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的合成速度、提升抗氧化酶的活力，就能迅速消除體內(nèi)產(chǎn)生的ROS,從而降低ROS誘發(fā)的脂質(zhì)和蛋白過(guò)氧化水平，使體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除保持在一個(gè)有益于身體健康的的平衡狀態(tài)。因此，ROS是一個(gè)能夠更直接地反映體內(nèi)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除之間平衡狀態(tài)的指標(biāo)。受試物處理后體內(nèi)ROS水平的降低也能直接反映受試物的抗氧化能力。CM-H2DCFDA（5-（and-6）-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,acetylester）是一一種常用的ROS特異性熒光檢測(cè)試劑，將CM-H2DCFDA加入養(yǎng)有斑馬魚(yú)的水體之后，CM-H2DCFDA會(huì)在斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS的氧化作用下形成高熒光強(qiáng)度的DCF（2',7'-di-chlorofluorescein，二氯熒光素），DCF的產(chǎn)生量與體內(nèi)ROS水平正相關(guān)。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)DCF的熒光信號(hào)，就可以得到體內(nèi)ROS的相對(duì)水平。將受試物和CM-H2DCFDA共同加入養(yǎng)有斑馬魚(yú)的水體一段時(shí)間后，如受試物具有抗氧化活性，DCF的產(chǎn)生量減少，熒光信號(hào)強(qiáng)度就會(huì)減弱。本方法是對(duì)斑馬魚(yú)的ROS進(jìn)行活體檢測(cè)，不需要取血或?qū)唏R魚(yú)解剖、勻漿，解決了因區(qū)。5自身不穩(wěn)定造成的檢測(cè)結(jié)果不可靠的問(wèn)題。試劑和材料CM-H2DCFDA試劑（分子式：C27H19cl3O8,分子量：577.8）：ROS檢測(cè)試劑。三卡因（Ethyl3-aminobenzoatemethanesulfonatesalt，別名MS-222，CAS號(hào)：886-86-2）:用于麻醉斑馬魚(yú)。斑馬魚(yú)繁殖容器：用于繁殖斑馬魚(yú)魚(yú)卵。用聚苯乙烯或其它惰性材料制成的容器，容器中有可移動(dòng)的網(wǎng)格或透明板來(lái)隔開(kāi)雄魚(yú)和雌魚(yú)，同時(shí)要有聚苯乙烯或其它惰性材料做成的隔柵或絲網(wǎng)來(lái)隔離成魚(yú)和魚(yú)卵，網(wǎng)格尺寸應(yīng)保證產(chǎn)下的魚(yú)卵可以順利漏過(guò)。斑馬魚(yú)孵育容器：用于斑馬魚(yú)魚(yú)卵和幼魚(yú)的孵育。用聚苯乙烯或其它惰性材料制成的容器，如24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔黑色酶標(biāo)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)罐等。液體量取器材及其它易耗品：移液槍、容量瓶、燒杯、鋁箔、巴氏吸管等。其它常規(guī)試劑：如鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化鉀等，試劑純度不低于化學(xué)純等級(jí)。儀器和設(shè)備斑馬魚(yú)養(yǎng)殖設(shè)備：設(shè)備需配有溫控裝置，養(yǎng)殖容器用玻璃或聚碳酸酯等惰性材料制成，用于飼養(yǎng)成年斑馬魚(yú)。。斑馬魚(yú)魚(yú)卵和幼魚(yú)培養(yǎng)設(shè)備：帶有溫控和進(jìn)風(fēng)裝置，推薦使用生化培養(yǎng)箱。電子天平：精度0.1mg。水質(zhì)檢測(cè)設(shè)備：鹽度計(jì)（電導(dǎo)率測(cè)定儀）、硬度計(jì)、pH計(jì)、溶解氧測(cè)定儀。普通體視顯微鏡：用于在明場(chǎng)下觀(guān)察斑馬魚(yú)個(gè)體發(fā)育和行為是否正常。多功能酶標(biāo)儀：用于檢測(cè)CM-H2DCFDA被ROS氧化后的產(chǎn)物DCF的熒光信號(hào)。DCF的最佳激發(fā)波長(zhǎng)是492-495nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)在517-527nm，多功能酶標(biāo)儀能夠檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)應(yīng)該盡量接近上述最佳波長(zhǎng)范圍，以確?？梢詸z測(cè)到DCF的熒光信號(hào)。試驗(yàn)準(zhǔn)備1受試魚(yú)類(lèi)魚(yú)種的選擇推薦使用野生型人8品系斑馬魚(yú)（），親魚(yú)應(yīng)具有較好的繁殖能力一一魚(yú)齡以6-12個(gè)月為佳。使用其它品系的斑馬魚(yú)時(shí)，要根據(jù)實(shí)際情況對(duì)試驗(yàn)條件做相應(yīng)調(diào)整，并在報(bào)告中說(shuō)明魚(yú)種選擇理由和試驗(yàn)方法。7.1.2親魚(yú)的馴養(yǎng)在繁殖前，親魚(yú)應(yīng)在符合下列條件的環(huán)境中馴養(yǎng)14天以上：a）水：詳見(jiàn)7.2.1a）成魚(yú)養(yǎng)殖用水。水溫：26-28.5℃。光照：推薦光照/黑暗周期為14小時(shí)/10小時(shí)，每天光照應(yīng)不少于12小時(shí)。d）溶解氧：6mg/L-飽和溶解氧。e）喂養(yǎng)：每天至少喂食兩次，可以搭配喂食活餌飼料（鹵蟲(chóng)幼蟲(chóng)）和熱帶魚(yú)配合飼料，每天至少喂食一次活餌飼料。用于孵化鹵蟲(chóng)幼蟲(chóng)的鹵蟲(chóng)卵應(yīng)按SN/T0476的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，有毒有害物質(zhì)的含量應(yīng)符合NY5073的規(guī)定執(zhí)行。配合飼料的衛(wèi)生安全指標(biāo)應(yīng)符合GB14924.2和NY5072的規(guī)定。f）斑馬魚(yú)疾病處理：對(duì)于患病的斑馬魚(yú)不做任何疾病處理，發(fā)現(xiàn)患病個(gè)體應(yīng)立即隔離并人道地處死。g）馴養(yǎng)期間，親魚(yú)的整體死亡率不超過(guò)10%時(shí)，該批魚(yú)可以使用；超過(guò)10%，應(yīng)舍棄整批魚(yú)并人道地處死。7.1.3斑馬魚(yú)魚(yú)卵的繁殖和孵育第一天，斑馬魚(yú)飼養(yǎng)房間燈光關(guān)閉前5小時(shí)左右，將親魚(yú)放在斑馬魚(yú)繁殖容器內(nèi)做繁殖前適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間雌雄親魚(yú)以網(wǎng)格板或透明板隔開(kāi)，雌雄比例為2:1,密度不超過(guò)3尾魚(yú)/L，不喂食。b）第二天，斑馬魚(yú)飼養(yǎng)房間的燈光開(kāi)啟后10分鐘內(nèi)，移除繁殖容器中隔開(kāi)雄魚(yú)和雌魚(yú)的網(wǎng)格或擋板，讓斑馬魚(yú)開(kāi)始繁殖。繁殖開(kāi)始后1個(gè)小時(shí)左右將親魚(yú)從繁殖容器中拿掉,收集魚(yú)卵。將存活的魚(yú)卵用成魚(yú)養(yǎng)殖用水清洗干凈后,放入惰性材料制成的容器（如培養(yǎng)皿、培養(yǎng)罐等）中進(jìn)行孵育。魚(yú)卵應(yīng)在容器底部稀疏地分布,不能緊密聚集,液面高度以不超過(guò)容器的2/3為宜。將容器放在溫度可控的環(huán)境中進(jìn)行孵育,容器的水溫控制在26-28.5℃。魚(yú)卵收集后6小時(shí)應(yīng)再次檢查,清理死亡的魚(yú)卵。此后,每天檢查并清理一次死亡的魚(yú)卵,同時(shí)每次更換至少2/3的水體。斑馬魚(yú)開(kāi)始孵化后,換水時(shí)要將卵膜清理干凈。在孵育過(guò)程中,如果要移動(dòng)魚(yú)卵/幼魚(yú),推薦使用巴斯德吸量管。在換水或移動(dòng)魚(yú)卵/幼魚(yú)的過(guò)程中,盡量避免讓魚(yú)直接暴露在空氣中。早期發(fā)育階段的正常魚(yú)卵和死亡魚(yú)卵的典型圖片見(jiàn)附錄A的圖1和圖2。7.2試驗(yàn)用水水質(zhì)a）成魚(yú)養(yǎng)殖用水。將飲用水凈化處理后（反滲透水、去離子水或雙蒸水均可），每升水加入400mg左右的人工海鹽和10mg左右的NaHCO3即可作為成魚(yú)養(yǎng)殖用水，人工海鹽和NaHCO3的用量可根據(jù)根據(jù)水質(zhì)情況適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。水體的電導(dǎo)率維持在450-550S/cm，pH維持在6.8-7.5，總硬度（以CaCO3計(jì)）維持在50-100mg/L。飲用水水質(zhì)應(yīng)符合GB5749的規(guī)定。b）魚(yú)卵和幼魚(yú)孵育使用E3培養(yǎng)液（60XE3培養(yǎng)液配制方法：NaCl：344mg,KCl：15.2mg,CaCl2-2H2O：58mg,MgSO4?7H2O：98mg,定容至20mL）。c）E3培養(yǎng)液也可用作試驗(yàn)用水，用于配制受試物貯備液和配制試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)溶液a）試驗(yàn)溶液盡量用試驗(yàn)用水配制,受試物難以用水溶解時(shí)方可考慮使用低毒的助溶劑或分散劑。推薦的溶劑有：二甲基亞砜、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、三甘醇。適合的分散劑有：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐溫80、0.01%的纖維素甲醚、聚氧乙烯化氫化蓖麻油。當(dāng)使用某種助溶劑時(shí),所有組別中的助溶劑濃度應(yīng)該保持一致，且濃度不大于1%（W/V或V/V）。同時(shí)，應(yīng)加設(shè)溶劑對(duì)照組試驗(yàn)，溶劑對(duì)照組不能對(duì)斑馬魚(yú)的存活有明顯影響或其它任何可觀(guān)察的不利影響,也不能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。b）試驗(yàn)中不需要調(diào)節(jié)試驗(yàn)溶液的pH值。如果加入受試物后試驗(yàn)溶液的pH值有明顯變化，按照GB/T21808中6.3.2的相關(guān)規(guī)定對(duì)受試物貯備液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。c）如果試驗(yàn)溶液富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),容易腐敗變質(zhì),且無(wú)法通過(guò)換液來(lái)遏制水體變質(zhì),可考慮加入一定量的亞甲基藍(lán)來(lái)抑菌，以減緩水質(zhì)惡化。如果使用亞甲基藍(lán)，溶液中的終濃度應(yīng)不大于0.1ppm（即100g/L）,且所有試驗(yàn)組的終濃度應(yīng)保持一致。d）小分子單體化合物的檢測(cè)濃度上限為1000g/mL,混合物或分子量＜3KD的大分子化合物的測(cè)試濃度上限為2000g/mL。對(duì)于很難溶解或均勻分散的物質(zhì)、分子量3KD的大分子化合物，均不適合采用水溶暴露方式,應(yīng)考慮采用其它方式進(jìn)行處理。e）如果受試物溶解后顏色較深,則需要稀釋至淺色；如果受試物溶解后有顆粒,則需要稀釋至無(wú)肉眼可見(jiàn)的顆粒；同時(shí)需要考慮在最終計(jì)算數(shù)據(jù)是否要扣除受試物的本底值。試驗(yàn)程序準(zhǔn)備斑馬魚(yú)幼魚(yú)的選取試驗(yàn)開(kāi)始時(shí),選擇選取體型和行為正常、體長(zhǎng)接近的受精后3天斑馬魚(yú),放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,斑馬魚(yú)最大負(fù)荷不超過(guò)10尾/mL。暴露條件a）持續(xù)時(shí)間：從加入受試物開(kāi)始，持續(xù)暴露20小時(shí)。暴露期間不投餌。b）光照：暴露期間避光處理，避免光照對(duì)受試物穩(wěn)定性的影響。c）更換試驗(yàn)溶液：通常暴露時(shí)間在24小時(shí)及以?xún)?nèi)不需要更換溶液。如果受試物富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，試驗(yàn)溶液容易腐敗變質(zhì)，可考慮換液，換液頻率可根據(jù)水質(zhì)情況調(diào)整。d）水溫：26-28.5℃。e）溶解氧：6mg/L-飽和溶解氧。f）pH：6.8-7.5。預(yù)試驗(yàn)a）預(yù)試驗(yàn)用于確定受試物的NOEC濃度，為后續(xù)正式試驗(yàn)的濃度設(shè)置提供參考。以幾何級(jí)數(shù)濃度系列設(shè)置5個(gè)初始受試物濃度，濃度的間隔系數(shù)3.2。b）向24孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入適量的受試物儲(chǔ)備液，用E3培養(yǎng)液稀釋成一組適宜的濃度系列。另外置一個(gè)E3培養(yǎng)液對(duì)照組。如果必須使用助溶劑，所有組別中的助溶劑濃度應(yīng)保持相同，還應(yīng)設(shè)置一個(gè)相應(yīng)的助溶劑對(duì)照組。每個(gè)孔1mL溶液，每個(gè)孔均放入10尾受精后3天的斑馬魚(yú)。如果一次試驗(yàn)需要使用多個(gè)24孔培養(yǎng)板時(shí)，每個(gè)板上至少需要設(shè)置一個(gè)E3培養(yǎng)液對(duì)照組或一個(gè)助溶劑對(duì)照組。c）在暴露開(kāi)始后1小時(shí)、8小時(shí)和20小時(shí)進(jìn)行觀(guān)察，及時(shí)清除死亡的斑馬魚(yú)，并對(duì)斑馬魚(yú)的死亡和其它毒性效應(yīng)進(jìn)行記錄，確定受試物的NOEC。在最后一次觀(guān)察時(shí)，向水溶液中加入麻醉劑，將斑馬魚(yú)麻醉后在普通體視顯微鏡的明場(chǎng)下觀(guān)察（推薦使用三卡因作為麻醉劑，三卡因的使用濃度不超過(guò)160g/mL），觀(guān)察時(shí)斑馬魚(yú)應(yīng)頭朝左、腹部朝下、完全側(cè)躺，所有斑馬魚(yú)的體位應(yīng)該保持一致。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：靜止不動(dòng)、無(wú)心臟跳動(dòng)、軀干呈白色不透明顏色、對(duì)機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)。異常表型：心包水腫、血流缺失/減少、出血、腦變性/萎縮/水腫、下頜畸形、眼畸形/水腫、肝臟變性/腫大/萎縮、卵黃囊吸收延遲、軀干彎曲/縮短、肌肉變性、鰾未充氣。異常表型的典型圖詳見(jiàn)附錄A的圖3-圖6。異常行為學(xué)指標(biāo)：身體側(cè)翻、游動(dòng)劇烈。正式試驗(yàn)試驗(yàn)分組正常對(duì)照組：含檢測(cè)試劑和斑馬魚(yú)。陽(yáng)性對(duì)照組：含有陽(yáng)性對(duì)照樣品、檢測(cè)試劑和斑馬魚(yú)，每次試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組即可。受試物測(cè)試組：含有受試物、檢測(cè)試劑和斑馬魚(yú)，受試物根據(jù)需要設(shè)置多個(gè)不同的濃度組。溶劑對(duì)照組：含有溶劑、檢測(cè)試劑和斑馬魚(yú)；如果受試物配制過(guò)程中使用了助溶劑或分散劑，則應(yīng)設(shè)置該組。檢測(cè)試劑對(duì)照組：只有檢測(cè)試劑，沒(méi)有斑馬魚(yú)和受試物；設(shè)置該試驗(yàn)組是為了排除檢測(cè)試劑自身的干擾，檢測(cè)試劑的濃度與受試物測(cè)試組相同。受試物對(duì)照組：含有受試物，沒(méi)有斑馬魚(yú)和檢測(cè)試劑；當(dāng)受試物自身的顏色、不溶性顆粒物或熒光對(duì)結(jié)果有干擾時(shí)應(yīng)設(shè)置該組，受試物的濃度跟受試物測(cè)試組對(duì)應(yīng)。受試物濃度設(shè)置根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，確定正式試驗(yàn)的受試物濃度范圍，試驗(yàn)最高濃度組不得高于NOEC值或該類(lèi)受試物的測(cè)試濃度上限（詳見(jiàn)7.2.2.d）。以幾何級(jí)數(shù)濃度系列設(shè)置至少3個(gè)不同的濃度組，濃度的間隔系數(shù)3.2。濃度組別設(shè)置少于3個(gè)時(shí)需說(shuō)明理由。受試物處理根據(jù)試驗(yàn)需求，預(yù)先篩選好足夠數(shù)量的受精后3天斑馬魚(yú)，將斑馬魚(yú)隨機(jī)分配到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔10尾斑馬魚(yú)。向E3培養(yǎng)液中加入受試物，使各試驗(yàn)組受試物的終濃度與預(yù)先設(shè)定的濃度一致。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組和正常對(duì)照組，并在必要時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組。向各組中均加入檢測(cè)試劑CM-H2DCFDA，試劑終濃度相同（推薦濃度為0.5mL），所有組別的溶液體積都是2mL。充分混勻后，將斑馬魚(yú)從24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)移至96孔黑色酶標(biāo)板中，每孔1尾斑馬魚(yú)，每孔150L溶液，每個(gè)試驗(yàn)組至少10個(gè)復(fù)孔。同時(shí)，在96孔酶標(biāo)板上設(shè)置檢測(cè)試劑對(duì)照組，設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。如果在試驗(yàn)前觀(guān)察到受試物自身有顏色、不溶性顆粒物或者熒光，可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，則需要考慮在96孔酶標(biāo)板上設(shè)置多個(gè)不同濃度的受試物對(duì)照組，受試物的濃度跟受試物測(cè)試組一一對(duì)應(yīng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔即可。轉(zhuǎn)移完成后，將96孔酶標(biāo)板用鋁箔紙包裹，在生化培養(yǎng)箱中避光孵育20小時(shí)至試驗(yàn)終點(diǎn)。酶標(biāo)儀檢測(cè)至試驗(yàn)終點(diǎn)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各試驗(yàn)組的熒光信號(hào)值。選擇符合檢測(cè)DCF熒光信號(hào)要求的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。每組的有效數(shù)據(jù)不少于8個(gè)。受試物測(cè)試組的熒光信號(hào)值減去檢測(cè)試劑對(duì)照組的熒光信號(hào)值（如果設(shè)置了受試物對(duì)照組，還應(yīng)減去受試物對(duì)照組的數(shù)值，以排除受試物自身的干擾），為CM-H2DCFDA被斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS氧化形成的DCF的熒光信號(hào)值。注意事項(xiàng)每次試驗(yàn)前需要檢測(cè)一次受試物溶液的溶解氧和pH，試驗(yàn)過(guò)程及終點(diǎn)不需要再次檢測(cè)。在轉(zhuǎn)移斑馬魚(yú)的時(shí)候，要注意避免損傷到斑馬魚(yú)。結(jié)果評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將酶標(biāo)儀檢測(cè)到的熒光信號(hào)值記為F，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±SE表示。如果受試物自身的性狀（顏色、溶解性、自體熒光）對(duì)結(jié)果沒(méi)有干擾，將受試物測(cè)試組與正常對(duì)照組的數(shù)據(jù)直接進(jìn)行比較；如果受試物自身的性狀（顏色、溶解性、自體熒光）對(duì)結(jié)果有干擾，應(yīng)先從受試物測(cè)試組的每個(gè)數(shù)據(jù)中減去受試物對(duì)照組的平均值，然后再與正常對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值＜F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值三F0.05,PW0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿(mǎn)足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。抗氧化功能的定量計(jì)算根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)到的熒光信號(hào)值，計(jì)算受試物的抗氧化作用（以ROS清除率表示），公式如下:ROS清除率（％）=（1F（受試物測(cè)試組）-F（檢測(cè)試劑對(duì)照組八x100%（F（正常對(duì)照組）-F（檢測(cè)試劑對(duì)照組））（1），ROS清除率（％）=（1-(2ROS清除率（％）=（1-(2)，）x100%F（正常對(duì)照組）-F（檢測(cè)試劑對(duì)照組））式中F為熒光信號(hào)值。受試物自身的性狀對(duì)結(jié)果沒(méi)有干擾時(shí)用公式（1），受試物自身的性狀對(duì)結(jié)果有干擾時(shí)用公式（2）。如果受試物配制過(guò)程中使用了助溶劑，則公式中的正常對(duì)照組數(shù)值用溶劑對(duì)照組數(shù)值進(jìn)行替換。結(jié)果判定及說(shuō)明當(dāng)一個(gè)受試物的試驗(yàn)結(jié)果滿(mǎn)足下列要求時(shí)，可以判定該受試物有抗氧化功能：受試物測(cè)試組至少有一組的熒光信號(hào)值與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，即p<0.05。ROS清除率的定量計(jì)算結(jié)果不作為判定受試物是否有抗氧化功能的依據(jù)，僅用于比較不同受試物之間抗氧化功能的強(qiáng)弱。10保證試驗(yàn)有效性的條件預(yù)試驗(yàn)中，E3培養(yǎng)液對(duì)照組一一如果使用了助溶劑，也包括溶劑對(duì)照組一一斑馬魚(yú)的死亡率或異常率不得超過(guò)10%，超過(guò)10%則該次試驗(yàn)視為失?。徽皆囼?yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組與正常對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，且平均值之差必須大于2倍的正常對(duì)照組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）；否則，該次試驗(yàn)視為失敗。正式試驗(yàn)中，如果使用了助溶劑，溶劑對(duì)照組與正常對(duì)照組之間不能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，如果溶劑對(duì)照組與正常對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，則該次試驗(yàn)視為失敗。11試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告至少應(yīng)