生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)十 動(dòng)物基因組DNA提取

動(dòng)物基因組DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理及方法三、實(shí)驗(yàn)器材四、實(shí)驗(yàn)步驟學(xué)習(xí)和掌握從動(dòng)物組織中提取基因組DNA的原理和操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?核酸的理化性質(zhì)2核酸制備的步驟3核酸制備中常見問題及注意事項(xiàng)

二、實(shí)驗(yàn)原理及方法（1）在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在（2）微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑（3）在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。（4）DNA溶液粘度很大（5）在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來

2.1核酸的理化性質(zhì)2.2核酸制備的一般步驟：

破碎組織細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中破裂細(xì)胞釋放核酸機(jī)械法與非機(jī)械法（非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)最廣泛的方法）(1)核酸的釋放：破裂細(xì)胞、釋放核酸細(xì)胞破碎方法應(yīng)用Ⅰ機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母Ⅱ物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞Ⅲ化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母各種組織細(xì)胞破碎方法以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑DNase抑制

①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。

②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。

核酸制備中常用的去垢劑

核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。

去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；

2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；

3．對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉(2)核酸的分離與純化：

將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離：非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）非需要的核酸分子、試劑和溶液核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑作用：

1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。

3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌(3)核酸的濃縮、沉淀與洗滌核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃樣品經(jīng)常使用

-70℃是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。

-20℃保存,避免反復(fù)凍融

保存介質(zhì)：

滅菌水

TE緩沖溶液(最常用)：TE緩沖液的PH與DNA貯存有關(guān)，PH為8時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PH低于7.0時(shí)DNA容易變性。

10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0

(4)核酸樣品的保存基因組DNA收率較低或無基因組DNA樣本材料太少細(xì)胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全離心力偏小兩相分離不完全……2.3DNA提取試驗(yàn)中常遇到的問題DNA降解的原因樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未清除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時(shí)加入蔗糖的原因加入多糖，保護(hù)DNA長(zhǎng)度核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。③減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解：排除核酸酶

實(shí)驗(yàn)材料：魚實(shí)驗(yàn)試劑：上海生工動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒實(shí)驗(yàn)器材：

儀器：高速離心機(jī)、水浴鍋

試劑：75%乙醇、異丙醇、RnaseA溶液等

耗材：1.5ml離心管、研缽

三、實(shí)驗(yàn)器材四、標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟1.取25-50mg（半個(gè)綠豆大?。﹦?dòng)物組織加到冰浴的1.5ml離心管中，用剪刀剪碎，加入400μlBufferDigestion，振蕩混勻。65℃水浴1.5h至細(xì)胞完全裂解。通常動(dòng)物組織完全裂解需要1-3h，取樣過多會(huì)影響提取DNA的質(zhì)量（動(dòng)物脾臟取樣量應(yīng)<=10mg）。水浴過程中，每10min顛倒混勻一次，可促進(jìn)細(xì)胞裂解。水浴后加入20μlRNaseA(20mg/ml)2.加入200μlBufferPA，充分顛倒均勻，置-20℃于冰箱放置5min。3.室溫10000rpm離心5min，將上清液（500-550μl）轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管。若上清液渾濁，可在加入等體積氯仿混勻，12000rpm離心取上清。4.加入等體積的異丙醇，顛倒5-8次使之充分混勻，室溫放置2-3min。室溫10000rpm離心5min，棄上清。5.加入1ml75%乙醇，顛倒漂洗1-3min，10000rpm離心2min，棄上清。漂洗時(shí)一定要是沉淀懸浮起來。6.重復(fù)步驟5一次。7.開蓋室溫倒置5-10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。此步?jīng)Q不可省略，否則殘留的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)如果殘留的乙醇有掛壁現(xiàn)象，倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。然后開蓋室溫放置5-10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。過度干燥將導(dǎo)致DNA重新溶解困難，肉眼可見DNA沉淀變成半透明狀，離心管無明顯乙醇味道即可，避免使用真空干燥器進(jìn)行干燥。8.得到的DNA用100-200μlTEBuffer溶解。提取的DNA可立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。TEBuffer為10mMTris-HCl,1nMEDTA,pH8.0,可以用ElutionBuffer或水代替。Bufferdigestion：主要成分是Tris-EDTA,SDS。SDS是表面活性劑有助于DNA的釋放，Tris的