DNA和RNA提取方法及原理

DNA和RNA提取方法及原理DNA和RNA提取方法及原理1第二部分：DNA提取常見問題分析及對策DNA提取專題第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題分析及對策DNA提取專題第一部分2前言

DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象。為了進(jìn)行測序、雜交和基因的表達(dá)，獲得高分子量和高純度的DNA是非常重要的前提。前言DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是3DNA提取原則保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性純化后不應(yīng)存在對酶有抑制作用的物質(zhì)排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取原則保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性4DNA提取的幾種方法染色體DNA的提取CTAB法SDS法其它DNA提取的幾種方法染色體DNA的提取CTAB法5DNA提取的幾種方法

非染色體DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法

線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法DNA提取的幾種方法非染色體DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取6基因組DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15℃。基因組DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)7

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.08

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－CTAB法CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解9

SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑10SDS法流程圖

（以動物組織為例）

動物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法SDS法流程圖（以動物組織為例）動物組織細(xì)胞裂解上層溶11基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法12基因組DNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的?；蚪MDNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方13基因組DNA－其它方法濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物基因組DNA－其它方法濃鹽法：利用RNP和DNP在鹽溶液中14質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分15質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和16質(zhì)粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大17細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同18第一部分：DNA提取方法簡介內(nèi)容第二部分：DNA提取及常見問題分析第一部分：DNA提取方法簡介內(nèi)容第二部分：DNA提取及常見問19DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備20材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融基因21細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低基22核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)23核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：24多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化多糖的去除：核酸分離、純化25多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌多酚的去除：核酸分離、純化鹽離子的去除：26核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaOAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉27基因組DNA的檢測

提取的基因組DNA片段在20kb－30kb之間高質(zhì)量的基因組DNA帶型單一無拖尾現(xiàn)象DNA濃度及純度的檢測

A260=1約50μg/mL雙鏈DNA；A260/280約為1.8基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在20kb－30k28DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留

原因?qū)Σ咧匦录兓疍NA，過吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）加入RNase降解RNADNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PC29DNA提取常見問題問題二：DNA降解。材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融

原因?qū)Σ弑M量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量，細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。材料不新鮮或反復(fù)凍融30DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗滌時DNA丟失

原因?qū)Σ弑M量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁。高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）。增加吸附的時間，或低溫沉淀小心操作DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。原因?qū)ΡM量選用新31RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分：RNA提取方法簡介RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分：R32分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達(dá)狀況33RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RN34提取RNA的注意事項(xiàng)經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw和實(shí)驗(yàn)室用品上可能有RNase，會導(dǎo)致RNase污染。使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。提取RNA的注意事項(xiàng)經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw和實(shí)驗(yàn)室用品上可35常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時也使RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活36RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分：RNA提取方法簡介RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分：R37RNA提取的步驟材料的裂解雜質(zhì)的去除RNA的吸附或沉淀異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機(jī)相。硅質(zhì)材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經(jīng)DEPC處理的水溶解RNARNA提取的步驟材料的裂解雜質(zhì)的去除RNA的吸附或沉淀異硫氰38材料準(zhǔn)備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提。組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位,細(xì)菌和酵母需要勻漿處理。對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲存液中保存。液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補(bǔ)充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。RNA的提取材料準(zhǔn)備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的39雜質(zhì)的抽提采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間，使蛋白質(zhì)、多糖和DNA分布到中間層和有機(jī)相中，RNA留在水相中對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機(jī)溶劑抽提RNA的提取雜質(zhì)的抽提采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻RNA的提取40RNA的沉淀和溶解含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質(zhì)或使用異丙醇沉淀RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70％乙醇洗滌，晾干用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解RNA樣品收集后或需長期保存時應(yīng)置于－70℃或加入RNase抑制劑，分裝使用RNA的提取RNA的沉淀和溶解含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗41RNA的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理乙二醛化瓊脂糖凝膠電泳含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測（A260=1，約40μg/mLRNA；A260/A280約為1.9-2.1）RNA的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理421抽提過程不徹底存在蛋白或多糖多酚的污染2DNA的污染

3離子濃度較高

原因?qū)Σ?保證徹底的裂解和一定轉(zhuǎn)數(shù)一定時間的離心；增加有機(jī)溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化2減少處理樣品的量；加入不含RNase的DNase處理；再次純化3增加漂洗次數(shù)RNA提取常見問題問題一：RNA樣品不純1抽提過程不徹底存在蛋白或多糖多酚的污染原因?qū)?431樣品含有雜質(zhì)雜液2樣品過量或樣品裂解和勻漿不徹底3RNA未有效的吸附沉淀或洗脫4樣品RNA含量少

原因?qū)Σ?去除樣品中的雜質(zhì)，離心除凈樣品中的培養(yǎng)基或儲存液2減少樣品用量；充分研磨樣品，增加裂解液的用量和裂解的時間3延長吸附時間或保證異丙醇沉淀的時間和離心時間；再次洗脫4重復(fù)吸附，加入肝糖等有助RNA沉淀的試劑RNA提取常見問題問題二：RNA得率低1樣品含有雜質(zhì)雜液原因?qū)?去除樣品中的雜質(zhì)，離心441樣品不新鮮或樣品保存不當(dāng)，RNA降解2污染了RNase3樣品儲存不當(dāng)

原因?qū)Σ?盡量取新鮮的樣品；取樣后立即放入液氮保存；或放入專門的儲存液內(nèi)；研磨樣品及時補(bǔ)充液氮2認(rèn)真地處理相應(yīng)的器具和試劑；嚴(yán)格地操作3-70℃凍存，分裝使用；加入RNase抑制劑RNA提取常見問題問題三：RNA容易降解1樣品不新鮮或樣品保存不當(dāng)，RNA降解原因?qū)?盡量45

DNA和RNA提取方法及原理DNA和RNA提取方法及原理46第二部分：DNA提取常見問題分析及對策DNA提取專題第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題分析及對策DNA提取專題第一部分47前言

DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象。為了進(jìn)行測序、雜交和基因的表達(dá)，獲得高分子量和高純度的DNA是非常重要的前提。前言DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是48DNA提取原則保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性純化后不應(yīng)存在對酶有抑制作用的物質(zhì)排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取原則保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性49DNA提取的幾種方法染色體DNA的提取CTAB法SDS法其它DNA提取的幾種方法染色體DNA的提取CTAB法50DNA提取的幾種方法

非染色體DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法

線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法DNA提取的幾種方法非染色體DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取51基因組DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15℃。基因組DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)52

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.053

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－CTAB法CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解54

SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑55SDS法流程圖

（以動物組織為例）

動物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法SDS法流程圖（以動物組織為例）動物組織細(xì)胞裂解上層溶56基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法57基因組DNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的?；蚪MDNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方58基因組DNA－其它方法濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物基因組DNA－其它方法濃鹽法：利用RNP和DNP在鹽溶液中59質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分60質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和61質(zhì)粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大62細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同63第一部分：DNA提取方法簡介內(nèi)容第二部分：DNA提取及常見問題分析第一部分：DNA提取方法簡介內(nèi)容第二部分：DNA提取及常見問64DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備65材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融基因66細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低基67核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)68核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：69多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化多糖的去除：核酸分離、純化70多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌多酚的去除：核酸分離、純化鹽離子的去除：71核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaOAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉72基因組DNA的檢測

提取的基因組DNA片段在20kb－30kb之間高質(zhì)量的基因組DNA帶型單一無拖尾現(xiàn)象DNA濃度及純度的檢測

A260=1約50μg/mL雙鏈DNA；A260/280約為1.8基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在20kb－30k73DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留

原因?qū)Σ咧匦录兓疍NA，過吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）加入RNase降解RNADNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PC74DNA提取常見問題問題二：DNA降解。材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融

原因?qū)Σ弑M量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量，細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。材料不新鮮或反復(fù)凍融75DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗滌時DNA丟失

原因?qū)Σ弑M量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁。高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）。增加吸附的時間，或低溫沉淀小心操作DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。原因?qū)ΡM量選用新76RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分：RNA提取方法簡介RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分：R77分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達(dá)狀況78RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RN79提取RNA的注意事項(xiàng)經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw和實(shí)驗(yàn)室用品上可能有RNase，會導(dǎo)致RNase污染。使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。提取RNA的注意事項(xiàng)經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw和實(shí)驗(yàn)室用品上可80常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時也使RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活81RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分：RNA提取方法簡介RNA提取專題第二部分：RNA提取及常見問題分析第一部分