分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)縮減版

如何充分混勻冷凍細(xì)胞團(tuán)塊能否集中提取RNA振蕩強(qiáng)度界面層取舍與產(chǎn)率和純度RNA提取操作細(xì)節(jié)容易出問題環(huán)節(jié)同mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA1.

引物、用途2.

模板：3.

dNTP4.

反轉(zhuǎn)錄酶選擇：總RNA樣）PCR獲得目的片段非定向片段定向

片段引物中引入酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則提問：需要考慮幾方面的因素？向一如果目的片段中含有不能避開的酶切位點(diǎn)怎么辦？通過

操作對(duì)目的片段/載體進(jìn)行改造目的片段進(jìn)行改造要考慮：P2X7AGAGTAATC

TACOverlap

PCR法獲得重組質(zhì)粒構(gòu)建W(M)P2X7表達(dá)重組質(zhì)粒目的片段進(jìn)行定點(diǎn)突變GAGATTGAAATCGAGATCGAGATAde構(gòu)建W(M)P2X7單表達(dá)重組質(zhì)粒Overlap

PCR法獲得去BglⅡ位點(diǎn)的P2X7片段GAG

GAAP2X7目的片段進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物鑒定提問：PCR產(chǎn)物需要鑒定嗎？成做到何種程度？如何選擇內(nèi)切酶？酶切鑒定后是否足夠？PCR產(chǎn)物純化提問：PCR產(chǎn)物能直接酶切連接嗎？為何？模版、體如何純化？提問：PCR后測(cè)OD估算產(chǎn)物的量可以嗎？為何？PCR產(chǎn)物切膠純化提問：電泳、切膠、回收注意事項(xiàng)電泳：切膠：回收：分子量大吸附能力強(qiáng)

太大或者太小的片段研究變異性質(zhì)利用PCR方法獲得變異片段到引物中。將目的序列Overlap

PCR。****去除中間較大片段或連接兩個(gè)無關(guān)片段針對(duì)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變二.目的片段與載體的連接質(zhì)粒提問：質(zhì)粒？有無辦法提高質(zhì)粒產(chǎn)量？提質(zhì)粒提出兩種是怎么回事？?質(zhì)粒和質(zhì)粒的停質(zhì)粒不相容性與質(zhì)粒特點(diǎn)不同。不質(zhì)粒的提取提問：堿變性法的基本原理特DNA提問：溶液1、2、3起什么作用？操作關(guān)鍵降提問：如何確定質(zhì)粒分子量？T載體提問：T載體是什么樣的載體？提問：T載體能直接在細(xì)菌中嗎？如何提問：用途？限制？提問：連接效率？目的片段與載體的連接載體與片段的連接提問：通常連接反應(yīng)需要多少載體及片段？的載（提問：連接條件？提問：粘性末端連接策略？切后提問：平末端連接策略？三.

細(xì)菌轉(zhuǎn)化提問：常用于克隆的菌株有哪些？特點(diǎn)？高缺乳提問：什么情況下會(huì)出現(xiàn)菌落？為什么？提問：轉(zhuǎn)化過程中16小時(shí)無菌落，繼續(xù)培養(yǎng)到30小時(shí)后出現(xiàn)小菌落怎么辦？往不長(zhǎng)提問：α互補(bǔ)？U提問：挑選什么樣的克??？提問：重組質(zhì)粒需要進(jìn)行哪些鑒定？特點(diǎn)：快；缺點(diǎn)：可能有假陽(yáng)性。電質(zhì)粒上所包含的酶切位點(diǎn)進(jìn)行單酶切或雙酶切；目的片段上所含的酶切位點(diǎn)進(jìn)行單酶切；采用質(zhì)粒上及目的片段上的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切鑒定外源蛋白的表達(dá)策略優(yōu)缺點(diǎn)？關(guān)注點(diǎn)？?優(yōu)缺點(diǎn)？?關(guān)注點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)：操作容易、周期短、產(chǎn)量高。缺點(diǎn)：

無糖基化、

活性（容易形成包含體）去掉