液相色譜基礎知識-(00001)PPT幻燈片

關于色譜色譜是一種分離工具，而不是傳統(tǒng)意義上的分析儀器常見的分離方式：蒸餾、離心、電泳、過濾、超濾等等色譜是其中一種分離工具色譜法簡介色譜法（Chromatography）溯源俄國科學加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開創(chuàng)了應用吸附原理分離植物色素的新方法并見諸于俄文的文獻1906年正式命名（見諸文獻）色譜法；Chromatography50年代開始廣泛研究和應用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應用始于70年代色譜的發(fā)明人俄國科學家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻什么是液相色譜氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相什么是高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器……廣泛應用于各個領域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學/食品及農業(yè)……在技術，理論及應用上仍處于發(fā)展階段液相色譜的基本流程圖流動相

泵色譜柱檢測器

泵輸液分離

檢測

記錄AEGBCDF進樣閥進樣HPLC的儀器配置色譜泵自動進樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑HPLC的應用在食品研究中的分析應用食品中的天然成分碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素〕維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素〕農藥和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS〕和亞硝酸HPLC的應用在獸藥研究中分析應用在醫(yī)藥研究中分析應用藥物分析有USP、BP、CP等標準常用藥物研究中的應用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應用：腎上腺皮質激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡愃幬镅芯恐械膽茫呵嗝顾亍㈩^孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應用：生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應用：光學異構體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構體毒性很強)醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學研究。

HPLC的應用在生物化學和生物工程中的應用氨基酸、多肽和蛋白質的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類)在精細化工分析中的應用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農藥、染料、炸藥等工業(yè)產品在無機離子分析中應用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析HPLC的應用在公安、刑警破案工作需要毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農藥殘留、酚類和胺類的檢測*************************************

2004年獲悉，世界上化合物總數(shù)達到4700萬，其中絕大部分是有機化合物，而大約有70％以上是不揮發(fā)的。對HPLC來說，只要被分析物質在流動相溶劑（各種各樣〕中有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各業(yè)有著廣泛的應用潛力。高效液相色譜基本概念色譜圖：HPLC圖形結果（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間。←色譜峰保留時間（分）基線↓峰高峰寬響應值液相色譜圖相關術語色譜峰－Peak色譜柱流出組分通過檢測器時產生的響應信號的微分曲線峰底－PeakBase峰的起點與終點之間連接的直線峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬－PeakWidth在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離半（高）峰寬－PeakWidthatHalfHeight通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側相交兩點之間的距離液相色譜圖相關術語峰面積－PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應值標準偏差；σ－StandardError0.607倍峰高處所對應峰寬的一半拖尾峰－TailingPeak后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰－LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰－GhostPeak并非由試樣所產生的峰；亦稱假峰液相色譜圖相關術語基線－Baseline在正常操作條件下，僅由流動相所產生的響應信號的曲線基線飄移－BaselineDrift基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲；N－BaselineNoise由各種因素所引起的基線波動譜帶擴展－BandBroadening由于縱向擴散,傳質阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象液相色譜圖相關術語死時間，t0－Deadtime不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間保留時間，tR－Retentiontime組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間死體積，V0－Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積保留體積，VR－Retentionvolume組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積液相色譜應用：制備型液相色譜分離及純化樣品是液相色譜原理的直接利用對分離及純化的要求化合物的穩(wěn)定性樣品的復雜性制備量的要求純度的要求，及純度的鑒定方法的安全性液相色譜應用：分析型液相色譜定量分析主要基于與標準品的比較是其最大應用領域定性分析；不是色譜的強項基于樣品的保留時間比較借助于和其聯(lián)用的紫外、質譜或其他檢測器對定量及定性分析的要求靈敏度、精度及準確度的要求樣品量的要求；復雜樣品的分析能力容易使用色譜方法轉換如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱轉換進樣量轉換流速液相色譜實驗所需的基本參數(shù)

液相色譜實驗所需的基本參數(shù)流動相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內徑、長短流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測器參數(shù)：紫外檢測波長，靈敏度等溫度控制進樣量以上參數(shù)即構成一個具體的HPLC方法；亦稱色譜條件評價液相色譜方法的標準問題：什么樣的分離結果是好的？分離度？靈敏度？什么是色譜的分離度分離度的公式：R：分離程度的量度影響分離度的因素：K’、α及N分離度方程：

K‘是容量因子，表達了被分離組分與柱填料之間作用的強弱

α是分離因子，描述兩個被分離組份分離的好壞程度，是化學因素N是理論塔板數(shù)，描述色譜峰譜帶展寬的程度若N增加2倍或3倍,R會如何變化?分離度方程解析：柱效項N＝理論塔板數(shù)：分離效率的量度PW=.5PW=2色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計算公式：W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5s分離度與N的關系分離度方程解析：分離因子項若=1.1or1.4，R會如何變化？＝分離因子：峰分離程度的量度V1V2V3V0時間0.5125分離因子：α定義：

a=1時兩組分分不開，改變a的途徑改變固定相或改變流動相(組成)改變溫度改變樣品的本身性質通過改變流動相組成改變α，同樣強度的不同溶劑改變色譜柱改變分離因子α的例子若=1,2,10or20,R會如何變化?分離度方程解析：容量因子項K＝容量因子：保留能力的量度V0V1V2V3時間0.5125

k值k項k對分離度影響

00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95容量因子k與分離度的關系與R的關系容量因子k

與峰高的關系改變k’值的方法：調節(jié)流動相的極性（比例）、pH、離子強度等梯度淋洗改變容量因子K’的例子譜圖α、k’及

N如何控制分離度對稱因子計算示意圖色譜峰的對稱性—對稱因子：

a.拖尾因子

b.不對稱因子峰對稱因子計算公式對稱因子(fs)：式中：

fs=0.95~1.05為正常峰

fs＜0.95為前延峰

fs＞1.05為拖尾峰液相色譜原理－更進一步的探討離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離主要適用于弱酸性化合物的分離降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質C18填料使用條件應在填料基質的范圍內硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內離子抑制色譜實例而在乙腈/水并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。離子抑制色譜的使用范圍下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法使用“離子對色譜法” 在高pH值下用離子抑制色譜柱：D18-613(聚合物基質)，室溫流動相：乙腈/0.01MNH4OH +0.01MTBA流速：1.0ml/min檢測：UV-240nm樣品：巴比妥的衍生物