分子病理學(xué)授課課件

分子病理技術(shù)

一、概論

二、免疫組化

三、原位雜交

四、原位PCR（在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)中講述）

五、原位末端標(biāo)記技術(shù)

（在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法中講）

六、組織芯片技術(shù)（李楊）

七、納米技術(shù)（原子力顯微鏡）復(fù)習(xí)題1什么是分子病理學(xué)？常用分子病理技術(shù)有哪些？2什么是免疫組織化學(xué)？試述免疫酶組織化學(xué)的方法和原理。

一、概論

生物高新技術(shù)——病理學(xué)中的應(yīng)用

向二方面發(fā)展：

計(jì)算機(jī)和圖像分析技術(shù)的應(yīng)用

簡(jiǎn)單的形態(tài)描述——量化方面發(fā)展

直接觀察——遠(yuǎn)程遠(yuǎn)輸“間接”觀察

定量病理學(xué)和遠(yuǎn)程病理學(xué)

原位雜交、原位PCR和原位末端標(biāo)記技術(shù)

分子病理學(xué)水平

近些年來(lái)，尤其是納米技術(shù)的誕生

使人們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)達(dá)原子水平分子病理學(xué)

從分子水平研究患病機(jī)體生命現(xiàn)象的科學(xué)

從分子水平研究疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸機(jī)制的科學(xué)

分子生物學(xué)

細(xì)胞生物學(xué)互相滲透、交叉

經(jīng)典病理學(xué)

分子病理學(xué)的形成是分子生物學(xué)技術(shù)在病理學(xué)中的應(yīng)用的具體體現(xiàn)。

技術(shù)手段

（1）分子免疫學(xué)+病理學(xué)乃至形態(tài)科學(xué)-—

免疫組織化學(xué)

（2）分子生物學(xué)技術(shù)

（探針；PCR；分子雜交）+形態(tài)學(xué)科

ISH、ISPCR和原位末端標(biāo)記技術(shù)

(3)生物芯片技術(shù)—組織芯片技術(shù)

(4)納米技術(shù)—對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)達(dá)原子水平

病理學(xué)發(fā)展以方法為先導(dǎo)

人類科學(xué)進(jìn)步的歷史和學(xué)科的發(fā)展——

以研究方法與工具創(chuàng)新為先導(dǎo)

一項(xiàng)新技術(shù)的創(chuàng)立，隨之帶來(lái)一批新的研究成果

在病理學(xué)領(lǐng)域中

系統(tǒng)解剖—LM—EM—免疫組化技術(shù)

器官病理學(xué)—細(xì)胞病理學(xué)—免疫病理學(xué)原位雜交和原位PCR技術(shù)的興起，又將病理學(xué)這門有著悠久歷史的學(xué)科推進(jìn)到分子病理學(xué)水平

21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)

分子生物學(xué)是生命科學(xué)的帶頭學(xué)科

隨著生物高新技術(shù)在病理學(xué)中應(yīng)用的不斷增多，分子病理學(xué)將在此研究領(lǐng)域中占有越來(lái)越重要的位置一、概論

1.概念：

1）免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）

是組織學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對(duì)組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行組織原位的顯示；是免疫學(xué)與組織化學(xué)相互滲透、相互交叉而產(chǎn)生的一門學(xué)科。

2）免疫組化技術(shù)

是在組織細(xì)胞原位檢測(cè)抗原（或抗體）的一種方法，也是在蛋白水平原位檢測(cè)基因表達(dá)的一種方法。2.歷史

1914年，Coons等人首次用熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)肺炎雙球菌的成功，開創(chuàng)了免疫組化的新時(shí)代

Sternberger改進(jìn)并建立了辣根過(guò)氧化物酶－抗過(guò)氧化物酶（PAP）技術(shù)。

80年代以后，ABC、APAAP、LSAB法等，使免疫組化技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛，成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能、代謝等綜合研究的一種有力工具。

近些年來(lái)，由于原位雜交技術(shù)、流式細(xì)胞儀及圖像分析等技術(shù)的興起和應(yīng)用，使免疫組化引向基因水平和定量檢測(cè)

形成免疫組化新的分支

雜交免疫組化和定量免疫組化。

90年代初,原位PCR技術(shù)的誕生

免疫組化主要是用來(lái)原位PCR結(jié)果的化學(xué)放大和顯示，標(biāo)志著免疫組化技術(shù)又進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段。

2.按標(biāo)記物標(biāo)記的部位分

直按法（一步法）

間接法（二步法）

橋聯(lián)法（多步法）

目前應(yīng)用最為廣泛的為免疫酶法

根據(jù)三抗、酶的不同又分為

PAP法、APAAP法、BA法

ABC法、LSAB法和SP法等。

3.免疫熒光法

已知的抗體或抗原分子標(biāo)記上熒光素

與其相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)

形成的免疫復(fù)合物上帶有一定量的熒光素

熒光顯微鏡下——熒光的抗原抗體結(jié)合部位

檢測(cè)出抗原或抗體間接法免疫熒光原理示意圖4.免疫酶組織化學(xué)

60年代初，HRP-抗體分子上，開創(chuàng)了酶標(biāo)記抗體的新技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用最廣泛的酶是HRP，其次是AP。

（1）PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB

其靈敏度是免疫熒光法的100-1000倍

（2）ABC法:Ag→Ab1→Bio-Ab2→ABC→DAB

（3)APAAP法:

Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR

（4）LSAB或SP法:

Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SADAB

（AP-SA）→（FR/NBT）直接法免疫酶組織化學(xué)原理示意圖間接法免疫酶組織化學(xué)原理示意圖AgAgAb1Ab2Ab1Bio-Ab2LSABABCPAPAPAAPHRP-DABAP-堅(jiān)固紅NBT多步法免疫酶組織化學(xué)原理示意圖三、免疫組織化學(xué)方法基本步驟

1.試劑配制

（1）檸檬酸鹽緩沖液

（2）TBS(Tris緩沖生理鹽水)

（3）1MTris-HCl緩沖液(pH7.4)

（4）顯色液:

（5）Mayer蘇木精復(fù)染液

3.結(jié)果判定

HRP-DAB:陽(yáng)性呈棕黃或棕黑色

AP-Fastred:玫瑰紅色

AP-NBT,BCIP:紫藍(lán)色HRP-DAB:棕黃或棕黑色4.對(duì)照實(shí)驗(yàn)

（1）空白對(duì)照：一抗由TBS

或其他無(wú)關(guān)抗體取代。

（2）陰性對(duì)照：二抗和/或三抗一抗

由TBS或其他無(wú)關(guān)抗體取代。

（3）陽(yáng)性對(duì)照：用含已知靶抗原的切片

作陽(yáng)性對(duì)照。四、免疫組化染色的一般注意事項(xiàng)

1.內(nèi)源酶的滅活及內(nèi)源生物素的處理

HRP—3％的H2O2水溶液

含豐富血細(xì)胞的標(biāo)本中，與H2O2產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)，出現(xiàn)冒泡而破壞組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。

可以用3％的H2O2甲醇液內(nèi)源性生物素的去除：

目的：正常細(xì)胞也含有生物素，尤以肝、脾、腎組織含量為多。在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合后繼抗體，形成親和素(或鏈親合素)-生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽(yáng)性發(fā)生。

方法：在采用生物素方法染色前，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行親和素處理，使其結(jié)合位點(diǎn)飽和。2.消除非特異性背景著色

常見于蛋白質(zhì)(抗體)吸附到組織切片中高度荷電的膠原及結(jié)締組織成分上。

方法：在滴加一抗前在標(biāo)本上加一種無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)溶液，以封閉荷電點(diǎn)不給一抗留有吸附的余地，以保證一抗不會(huì)吸附到膠原纖維及結(jié)締組織成分上。

最常用的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液是產(chǎn)生二抗的同種動(dòng)物的非免疫血清。3.緩沖液的選擇

目的：保證免疫組織化學(xué)染色的最佳條件，即合適的離子濃度和pH值。

但不同的酶促反應(yīng)要求不同的pH值和不同的離子。

HRP免疫組織化學(xué)染色需近中性環(huán)境，pH7.4-7.6較為合適。

AP--需選堿性緩沖液，pH8.2較為合適。4.抗原修復(fù)

目的

石蠟切片,甲醛固定，使抗原性物質(zhì)或由于形成醛鍵、羧甲鍵等原因而被封閉了部分抗原決定簇；或由于蛋白之間發(fā)交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽.

在染色時(shí)，有些抗原需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露。方法

（1）化學(xué)方法：酶--抗原決定蔟暴露

胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等

（2）物理/化學(xué)方法：主要有

單純加熱方法：檸檬酸鹽緩沖液

高壓加熱方法：

微波方法：利用熱效應(yīng)和微波的直接作用，打開蛋白之間的交聯(lián)鍵，將已被封閉的抗原決定簇暴露和修復(fù)。5.一抗的選用、稀釋度及孵育時(shí)間

一抗是免疫組織化學(xué)染色中最重要的試劑

抗體工作稀釋度取決于：

①特異性抗體的濃度，即滴度；

②抗體的純度；

孵育時(shí)間：特異性染色較強(qiáng)且無(wú)背景著色，是較理想的稀釋度。加長(zhǎng)孵育時(shí)間可有效地降低所用抗體的濃度，有利于提高染色質(zhì)量，節(jié)省抗體

室溫過(guò)夜是較好的方法，但也可用37℃1小時(shí)或4℃過(guò)夜的方法。6.選擇適宜的檢測(cè)方法

血涂片，骨髓涂片–內(nèi)源性HRP豐富

APAAP或堿磷酶標(biāo)記的方法

肝、腎等組織——內(nèi)源性生物素豐富

PAP方法

一般的免疫組化—ABC和SP7.顯色中的一些問(wèn)題

顯色的停止點(diǎn)：目的物達(dá)最深染色而背景無(wú)著色。顯色時(shí)間過(guò)短，著色過(guò)淺；顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，背景著色又過(guò)深，都將影響結(jié)果的判斷，均應(yīng)避免。

通常顯色結(jié)果以陽(yáng)性對(duì)照得出最佳結(jié)果的時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)。

納米技術(shù)

物質(zhì)基礎(chǔ)：原子力顯微鏡

納米技術(shù)、信息技術(shù)和生物技術(shù)----

21世紀(jì)社會(huì)發(fā)展的三大支柱

我國(guó)—啟動(dòng)

01.6.29,科技部和中科院—“沈陽(yáng)材料科學(xué)

國(guó)家（聯(lián)合）實(shí)驗(yàn)室”。這一裝備先進(jìn)

的實(shí)驗(yàn)室將主攻納米級(jí)材料

01.7（3-5),國(guó)際納米材料項(xiàng)目論壇會(huì)議上，

科技部將斥資10億—支持國(guó)家納米技術(shù)，

資金在5年內(nèi)全部到位

納米技術(shù)--在10-7-10-9m范圍內(nèi)，對(duì)物質(zhì)內(nèi)原子、分子的運(yùn)動(dòng)和變化進(jìn)行研究、操縱和加工的技術(shù)。

納米（nm）也即10-9m。納米技術(shù)的誕生，使人們認(rèn)識(shí)事物的本質(zhì)和變化規(guī)律達(dá)原子水平。納米技術(shù)最早在材料科學(xué)中應(yīng)用

目前已取得了較大進(jìn)展。

科學(xué)家預(yù)言，納米技術(shù)將引起下一次