微生物檢驗(yàn)的基本程序

1、微生物檢驗(yàn)的基本程序1 檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備 2樣品的采集 3樣品的送檢 4樣品的處理方法5 致病菌檢驗(yàn)參考菌群的選擇 6樣品的檢驗(yàn) 7檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備準(zhǔn)備好所需的各種儀器：如冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡等按技術(shù)要求將各種玻璃儀器進(jìn)行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無(wú)菌室備用。準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑、藥品，制備好普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂或其他選擇性培養(yǎng)基。根據(jù)需要分裝試管或滅菌后傾注平板或保存在46 的水浴中或保存在4 的冰箱中備用。做好無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)的滅菌工作，提前1h滅菌3060min。檢驗(yàn)人員的工作衣、鞋、帽、口罩等滅菌后備用。工作人員進(jìn)入無(wú)菌室后，實(shí)驗(yàn)沒(méi)有完成之前不得隨便出入無(wú)菌室。微生物實(shí)驗(yàn)

2、室檢驗(yàn) 流 程 無(wú)菌取樣樣品均質(zhì)樣液稀釋樣品接種恒溫培養(yǎng)結(jié)果觀察食品微生物檢測(cè)常規(guī)微生物項(xiàng)目：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)，此類(lèi)細(xì)菌不致病，但會(huì)嚴(yán)重影響食品的外觀及風(fēng)味。目前常用微生物培養(yǎng)法來(lái)計(jì)數(shù)菌落，允許有該類(lèi)菌落，但菌落總數(shù)不能超標(biāo)。致病微生物項(xiàng)目：沙門(mén)氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等。致病微生物在食品中是絕對(duì)不允許存在的，所以快速檢測(cè)食品中是否存在有致病微生物，是食品安全檢驗(yàn)的重中之重。食品微生物檢驗(yàn)指標(biāo) 我國(guó)衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)有菌落總數(shù),大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。1.菌落總數(shù)：菌落總數(shù)是指食品檢樣

3、經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1g或1mL檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。2.大腸菌群：大腸菌群是寄居于人及溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的腸居菌，它隨著的大便排出體外。食品中如果大腸菌群數(shù)越多，說(shuō)明食品受糞便污染的程度越大。3.致病菌：致病菌既能夠引起人們發(fā)病的細(xì)菌。對(duì)不同的食品和不同的場(chǎng)合，應(yīng)該選擇一定的參考菌群進(jìn)行檢驗(yàn)。4.霉菌及其毒素：我國(guó)還沒(méi)有制定出霉菌的具體指標(biāo)，鑒于有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引起疾病，故應(yīng)該對(duì)產(chǎn)毒霉菌進(jìn)行檢驗(yàn)。5.其它指標(biāo)：還應(yīng)包括病毒：肝炎病毒、豬瘟病毒、雞新城疫病毒、馬立克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒、豬水泡病毒等；另外，從食品檢驗(yàn)的角度考慮，寄生蟲(chóng)也被很多學(xué)者列為微生物檢驗(yàn)的指

4、標(biāo)。樣品的采集目的：便于食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督管理; 鑒別食品中是否存在有毒有害物質(zhì);為新產(chǎn)品、新資源利用、新食品、新化工產(chǎn)品、新工藝在投產(chǎn)前進(jìn)行衛(wèi)生鑒定。采樣標(biāo)簽的填寫(xiě)標(biāo)簽內(nèi)容主要：編號(hào)、樣品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)日期、產(chǎn)品批號(hào)、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、采樣時(shí)間、采樣人姓名，現(xiàn)場(chǎng)情況。樣品采集的種類(lèi)大樣，指一整批；中樣，是從樣品中各部分取得的混合樣品，一般為200g；小樣，又稱檢樣，做分析用的，一般為25g采樣的步驟：采樣前調(diào)查現(xiàn)場(chǎng)觀察確定采樣方案采樣 樣品封存 開(kāi)具采樣證明采樣的要求1、嚴(yán)格遵守樣品采集的操作規(guī)程。2、所采樣品必須具有代表性。3、采樣操作要防止污染，防止變質(zhì)、損壞、丟失。4、不得加入防

5、腐劑、固定劑等。 5、樣品采集和現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定必須有二人以上參加 。檢驗(yàn)樣品：食品生產(chǎn)環(huán)境如水、空氣、土壤樣品; 生產(chǎn)各工序樣品如設(shè)備、管道;各類(lèi)食品 發(fā)生食物中毒時(shí)的樣品微生物檢驗(yàn)的取樣方案1 ICMSF取樣方案； 2 美國(guó)FDA的取樣方案；3世界糧農(nóng)組織（FAO）取樣方案；4 我國(guó)的食品取樣方案。ICMSF取樣方案國(guó)際食品微生物規(guī)范委員會(huì)(簡(jiǎn)稱ICMSF)的取樣方案是依據(jù)事先給食品進(jìn)行的危害程度劃分來(lái)確定的。將所有食品分成3種危害度:I類(lèi)危害：老人和嬰幼兒食品及在食用前可能會(huì)增加危害的食品;類(lèi)危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不變; 類(lèi)危害：食用前經(jīng)加熱處理,危害減小的食品。將檢驗(yàn)指標(biāo)對(duì)食品

6、衛(wèi)生的重要程度分成一般、中等和嚴(yán)重3檔。根據(jù)以上危害度的分類(lèi)，又將取樣方案分成二級(jí)法和三級(jí)法。二級(jí)法：設(shè)定取樣數(shù)n,指標(biāo)值m,超過(guò)指標(biāo)值m的樣品數(shù)為C,只要C0,就判定整批產(chǎn)品不合格。三級(jí)法：設(shè)定取樣數(shù)n,指標(biāo)值m,附加指標(biāo)值M,介于m與M之間的樣品數(shù)C。只要有一個(gè)樣品值超過(guò)M或C規(guī)定的數(shù)就判整批產(chǎn)品不合格。美國(guó)FDA的取樣方案食品藥品管理局(FDA)的取樣方案與ICMSF的取樣方案基本一致，所不同的是嚴(yán)重指標(biāo)所取的15、30、60個(gè)樣可以分別混合，混合的樣品量最大不超過(guò)375g。也就是說(shuō)所取的樣品每個(gè)為100g，從中取出25g，然后將15個(gè)25g混合成一個(gè)375g樣品，混勻后再取25g作為試

7、樣檢驗(yàn)，剩余樣品妥善保存?zhèn)溆?。食品微生物檢驗(yàn)采樣方法:按照上述采樣方案,能采取最小包裝的樣品就采取完整包裝,必須拆包裝取樣的應(yīng)按無(wú)菌操作進(jìn)行。不同類(lèi)型的食品應(yīng)采用不同的工具和方法:1.液體樣品：充分混勻,以無(wú)菌操作開(kāi)啟包裝,用100mL無(wú)菌注射器抽取,注入無(wú)菌容器。2半固體樣品：以無(wú)菌操作拆開(kāi)包裝,用無(wú)菌勺子從幾個(gè)部位挖取樣品,放入無(wú)菌容器。3.固體食品：大塊整體食品應(yīng)用無(wú)菌刀具和鑷子從不同部位割取,割取時(shí)應(yīng)兼顧表面與深部,注意樣品的代表性; 小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品,放入無(wú)菌容器。 若為檢驗(yàn)食品的污染情況，可取表層樣品；若為檢驗(yàn)食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。 4.冷凍食品：

8、大包裝小塊冷凍食品按小塊個(gè)體采取;大塊冷凍食品可以用無(wú)菌刀從不同部位削取樣品或用無(wú)菌小手鋸從凍塊上舉取樣品,也可以用無(wú)菌鉆頭鉆取碎屑狀樣品,放入容器。 固體食品和冷凍食品的取樣還應(yīng)注意檢驗(yàn)?zāi)康?若需檢驗(yàn)食品污染情況,可取表層樣品;若需檢驗(yàn)其品質(zhì)情況,應(yīng)取深部樣品。5.生產(chǎn)工序監(jiān)測(cè)(1)車(chē)間用水。自來(lái)水樣從車(chē)間各水龍頭上采取冷卻水;湯料等從車(chē)間容器不同部位用100mL無(wú)菌注射器抽取。(2)車(chē)間臺(tái)面、用具及加工人員手的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)。用5cm2孔無(wú)菌采樣板及5支無(wú)菌棉簽擦拭25cm2面積。若所采表面干燥,則用無(wú)菌稀釋液潤(rùn)濕棉簽后擦拭;若表面有水,則用干棉簽擦拭,擦拭后立即將棉簽頭用無(wú)菌剪刀剪入盛樣容器。

9、(3)車(chē)間空氣采樣。直接降塵法。將5個(gè)直徑90mm的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分別置于車(chē)間的四角和中部,打開(kāi)平皿蓋5min,然后蓋蓋送檢。樣品的送檢要求 1、采集好的樣品應(yīng)及時(shí)送到食品微生物檢驗(yàn)室：要快速運(yùn)送，不要超過(guò)3小時(shí)；易變質(zhì)的樣品要冷藏，若路途遙遠(yuǎn)，無(wú)需冷凍樣品可保持在15低溫下運(yùn)送；需保持冷凍狀態(tài)的樣品，可保存在泡沫塑料隔熱箱，維持0。2、樣品送檢時(shí)：必須認(rèn)真填寫(xiě)送檢申請(qǐng)單，以供檢驗(yàn)人員參考。3、送檢過(guò)程：要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)。4、檢驗(yàn)人員接到送檢單后 應(yīng)立即登記,填寫(xiě)序號(hào),并按檢驗(yàn)要求,立即將樣品放入冰箱或冰盒中,并積極準(zhǔn)備條件進(jìn)行檢驗(yàn)。5、食品微生物檢驗(yàn)室必須備有專用冰箱存放樣品

10、一般陽(yáng)性樣品發(fā)出報(bào)告后3d(特殊情況可適當(dāng)延長(zhǎng))方能處理樣品;進(jìn)口食品的陽(yáng)性樣品,需保存6個(gè)月方能處理;陰性樣品可及時(shí)處理。樣品的預(yù)處理方法(一) 液體樣品的處理1瓶裝液體樣品的處理用點(diǎn)燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸或來(lái)蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用無(wú)菌開(kāi)瓶器將蓋啟開(kāi)；含有二氧化碳的樣品可倒入500mL磨口瓶?jī)?nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣25mL檢驗(yàn)。2盒裝或軟塑料包裝樣品的處理將其開(kāi)口處用75%酒精棉擦拭消毒，用無(wú)菌剪子剪開(kāi)包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布在剪開(kāi)部分，直接吸取樣品25mL ，或傾入另一滅菌容器中再取樣25mL檢驗(yàn)。（二）固體樣品的處理

11、搗碎均質(zhì)法：將中樣(100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g放入帶225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)杯中，800010000r/min均質(zhì)12min即可。是對(duì)大部分食品樣品都適用的辦法。2剪碎振搖法：將中樣(100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣進(jìn)一步剪碎，放入帶225mL稀釋液和適量直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。3研磨法：將中樣(100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣放入無(wú)菌乳缽中充分研磨后，再放入帶有225mL無(wú)菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。4整粒振搖法：完整自然保護(hù)膜的顆粒狀樣品(如蒜瓣、青豆等)直接稱取25g整粒樣品置于帶有22

12、5mL稀釋液和適量直徑5mm左右玻璃珠的無(wú)菌稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。5胃蠕動(dòng)均質(zhì)法：這是國(guó)外使用的一種新型的均質(zhì)樣品的方法。將一定量的樣品和稀釋液放入無(wú)菌均質(zhì)袋中,開(kāi)機(jī)均質(zhì)。均質(zhì)器有一個(gè)長(zhǎng)方形金屬盒,其旁安有金屬葉板,可打擊均質(zhì)袋,金屬葉板由一恒速馬達(dá)帶動(dòng),作前后移動(dòng)而撞碎樣品（三）冷凍樣品冷凍樣品，先將中樣在04 下解凍，時(shí)間不能超過(guò)18h，或在45 下解凍，時(shí)間不能超過(guò)15min。再取檢樣25g做稀釋處理。菌落總數(shù)：因微生物的生活特性各異，不可能在一種培養(yǎng)條件下全部生長(zhǎng)，故檢出的菌落數(shù)小于細(xì)菌總數(shù)，但仍可評(píng)定食品的污染程度，是常用方法。菌落總數(shù)的食品衛(wèi)生

13、學(xué)意義：作為食品被污染程度的指標(biāo)，反映食品的新鮮程度；預(yù)測(cè)食品的存放期限程度：食品生產(chǎn)過(guò)程中變質(zhì)與否、食品生產(chǎn)過(guò)程中食品的一般衛(wèi)生狀況。大腸菌群食品中大腸菌群的數(shù)量測(cè)定：一般采用100克或100毫升食品中的大腸菌群最可能數(shù)（MPN）來(lái)表示。國(guó)標(biāo)測(cè)定方法：乳糖九管發(fā)酵法。 不僅表明樣品中有無(wú)糞便污染，另方面還可根據(jù)數(shù)量的多少，判定樣品受污染的程度致病菌檢驗(yàn)參考菌群的選擇蛋及蛋制品：沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、變形桿菌等水產(chǎn)品海產(chǎn)品：鏈球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌畜禽肉類(lèi)：腸道致病菌和致病性球菌米面類(lèi)：蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌、酵母霉菌等罐頭：耐熱性芽胞桿菌、

14、嗜熱脂肪桿菌、大芽胞桿菌、凝值芽胞桿菌樣品的檢驗(yàn)過(guò)程（一）、收樣： 1、收到樣品后逐一核對(duì)驗(yàn)收，登記編號(hào)。 如2004年收到的50號(hào)樣品，編號(hào)可寫(xiě)成：200400502、立即將樣品放在冰箱或冰盒中，并積極做好準(zhǔn)備工作。（二）、檢驗(yàn)1、選擇檢驗(yàn)方法國(guó)內(nèi)：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)國(guó)外：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：如FAO標(biāo)準(zhǔn)、WHO標(biāo)準(zhǔn)； 每個(gè)進(jìn)口國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)：如美國(guó)FDA標(biāo)準(zhǔn)、日本厚生省標(biāo)準(zhǔn)、歐共體標(biāo)準(zhǔn)等2、檢驗(yàn)要求（1）按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)操作，邊工作邊做原始記錄。（2）檢測(cè)結(jié)束，連同結(jié)果一起交同條線技術(shù)人員復(fù)核。復(fù)核過(guò)程中發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤，復(fù)核人應(yīng)通知檢測(cè)人更正，然后重新復(fù)核。（3）檢測(cè)人和復(fù)核人在原始記錄上簽名，并編寫(xiě)“檢測(cè)報(bào)告底稿”。（4）所有檢測(cè)項(xiàng)目完成后，檢測(cè)人員將原始記錄、樣品卡、報(bào)告書(shū)底稿交科主任作全面校核。3、樣品的保留（1）陰性樣品：在發(fā)出報(bào)告可及時(shí)處理；（2）陽(yáng)性樣