-病毒感染的檢查方法與防治原則課件

1、第25章 病毒感染的檢查方法與防治原則內(nèi) 容第一節(jié) 病毒感染的診斷(檢查方法）第二節(jié) 病毒感染的特異性預(yù)防(自學(xué)）第三節(jié) 病毒感染的治療（自學(xué)）第一節(jié) 病毒感染的診斷（Diagnosis of viral infection） 標(biāo)本采集與送檢原則 病毒感染的檢查方法一、標(biāo)本采集與送檢原則 按疾病種類與病程采取不同標(biāo)本 在發(fā)病早期與用藥之前采取標(biāo)本 無(wú)菌操作，有菌標(biāo)本用“雙抗”（青、鏈霉素）或 “三抗”（青、鏈霉素+兩性霉素B）處理 冷藏速送，病變組織用50甘油保存 血清學(xué)檢測(cè)：IgM 單份血清, IgG 雙份血清 二、檢查方法 病毒的形態(tài)學(xué)檢查 病毒的血清學(xué)檢查 病毒的分子生物學(xué)檢查 病毒的分

2、離培養(yǎng)與鑒定快速診斷呼腸病毒感染回腸上皮細(xì)胞電鏡照片ElectronmicrographsInclusion bodyCytomegalic cell that contains a dense, owls eye, acidophilic intranuclear inclusion body Negry body(1) 中和試驗(yàn)(Neutralization test)(2) 血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition test)(3) 免疫標(biāo)記法(FIA、EIA、RIA)(4) 蛋白印跡(Western blot)2. 病毒血清學(xué)檢查方法：Immunofluor

3、escense testImmunofluorescense testPositive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)ELISAColoured wells indicate reactivityAIDS的確診試驗(yàn)Western blot3. 病毒分子生物學(xué)檢查 核酸電泳(nucleic acid electrophoresis) 核酸雜交(nucleic acid hybridization) 核酸擴(kuò)增(PCR） 基因芯片(gene chip) 基因測(cè)序(gene sequence)方法：4. 病

4、毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定病毒的分離培養(yǎng)方法： 動(dòng)物接種 雞胚培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng): 動(dòng)物接種(animal inoculation)動(dòng)物：鼠、兔、猴、黑猩猩等優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高、動(dòng)物 體內(nèi)常帶有潛伏病毒。 目前已很少應(yīng)用。 雞胚培養(yǎng)(embryonated egg culture)受精卵孵育9-14天雞胚接種病毒孵育2-7天收獲相應(yīng)的材料進(jìn)行鑒定雞胚接種部位：尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種(3) 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的方式分: 單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer cell

5、culture） 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspended cell culture）根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、染色體特征及傳代次數(shù)分: 原代培養(yǎng)細(xì)胞 二倍體細(xì)胞株 傳代細(xì)胞系或株(3) 細(xì)胞培養(yǎng) (cell culture)原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)epithelial cells原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)特點(diǎn): 對(duì)多種病毒敏感 生長(zhǎng)能力有限, 獲取成本高 可攜帶潛伏病毒應(yīng)用: 病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 不能用于制備疫苗體外分裂50100代仍保持二倍染色體數(shù)目的單層細(xì)胞特點(diǎn): 對(duì)多種病毒敏感 不帶異種蛋白(人源性) 不帶病毒,無(wú)致瘤潛能應(yīng)

6、用: 病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 制備疫苗二倍體細(xì)胞株 (diploid cell strain)fibroblastic cells傳代細(xì)胞系 (continuous cell line )特點(diǎn): 對(duì)多種病毒敏感性高 繁殖能力強(qiáng),傳代時(shí)間長(zhǎng) 有致癌危險(xiǎn)(來(lái)源于癌細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞株)應(yīng)用: 病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 不能用于制備疫苗能在體外無(wú)限傳代的細(xì)胞系。如 HeLa, Hep-2epithelioid cells4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定病毒鑒定： 病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 病毒形態(tài)學(xué)鑒定 病毒抗原鑒定 病毒基因鑒定 細(xì)胞病

7、變效應(yīng) ( cytopathic effect, CPE) 病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖引起的光鏡下可見(jiàn)的細(xì)胞病理改變。 CPE：病毒感染細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom). CPE：病毒感染細(xì) 胞與鄰近細(xì)胞融合CPE：形成包涵體（inclusion body）Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of th

8、e cell sheet. 紅細(xì)胞吸附（hemadsorption, HAd）受染細(xì)胞膜表面血凝素（HA） RBC表面HA受體 干擾現(xiàn)象（interference）風(fēng)疹病毒人胚腎細(xì)胞 病毒增殖，CPE（）埃可病毒人胚腎細(xì)胞 病毒增殖，CPE（）人胚腎細(xì)胞風(fēng)疹病毒？?？刹《綜PE(-)埃可病毒(-) 風(fēng)疹病毒(+) CPE(+)?？刹《?+) 風(fēng)疹病毒(-) 4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定：蝕(空)斑形成試驗(yàn) 50%組織細(xì)胞感染量病毒總量(活病毒+死病毒)：感染性病毒量:血凝試驗(yàn)蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay）

9、原理：將適當(dāng)稀釋濃度的病毒液定量接種于敏感的單層細(xì)胞，經(jīng)一段時(shí)間培育后，在細(xì)胞上覆蓋一層未凝固瓊脂，待其凝固后繼續(xù)培養(yǎng)，由于病毒的增值使感染的單層細(xì)胞病變脫落，形成肉眼可見(jiàn)的空斑，一個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的，計(jì)數(shù)平板中空斑數(shù)可計(jì)算出樣品中活病毒的數(shù)量。 通常以每毫升病毒液的空斑形成單位（plaque forming unit, PFU),既 PFU/ml表示。PLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAY蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay） Vero cells, whi

10、ch grew confluently on the bottom of the plastic plate (1.5 cm diameter), were infected with herpes simplex virus 用途： 測(cè)定感染性病毒量 單位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的一 個(gè)空斑稱為空斑形成單位。 分純病毒蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay） 50%組織細(xì)胞感染量(50% tissue culture infectious dose, TCID50)概念: 測(cè)定病毒感染細(xì)胞后引起50%細(xì)胞病變或死亡的最

11、小病毒量。方法: 將待測(cè)病毒液作10倍系列稀釋，分別接種于單層細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后觀察CPE等指標(biāo)，以能使50%細(xì)胞感染的病毒最高稀釋度作為終點(diǎn)。用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出50%組織細(xì)胞感染量。用途: 判斷病毒的感染性和毒力50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)香港大學(xué)專家：患者鼻咽標(biāo)本Vero細(xì)胞培養(yǎng)CPE EM觀察：冠狀病毒隨后加拿大和美國(guó)CDC等SARS國(guó)際協(xié)作組的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也培養(yǎng)出了冠狀病毒利用免疫熒光法將分離病毒與SARS患者血清進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，反應(yīng)呈陽(yáng)性從冠狀病毒基因組的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從培養(yǎng)上清中擴(kuò)增出了冠狀病毒基因測(cè)序經(jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性為64%左右SARS冠狀病毒的分離和鑒定加拿大專家完成了全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)與已知人和動(dòng)物的冠狀病毒的同源性差異較大確定為一種新的冠狀病毒。荷蘭的病毒學(xué)家：用這種冠狀病毒感染猴子出現(xiàn)了與SARS病人相同的臨床表現(xiàn)和病理特征再次從動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)引起SARS的病原體是這種冠狀病毒W(wǎng)HO將其命名為SA