免疫細(xì)胞的分離技術(shù)2011課件

1、 一、免疫細(xì)胞的種類與特征 二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù) 三、免疫細(xì)胞分離的臨床意義第三節(jié)免疫細(xì)胞的分離技術(shù) 免疫系統(tǒng)的組成免疫系統(tǒng)免疫器官中樞: 胸腺、骨髓周圍：淋巴結(jié)、脾臟、粘膜 相關(guān)淋巴組織等免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞 、 粒細(xì)胞、DC、肥大細(xì)胞、 NK細(xì)胞免疫分子：抗體、補體、細(xì)胞因子、MHC、 TCR、粘附分子等 Innate immunity 固有免疫 定義：人類在種系進(jìn)化過程中形成的、經(jīng)遺傳獲得 的免疫，遇病原體后首先并迅速起防衛(wèi)作 用的免疫應(yīng)答組成：皮膚、粘膜及其產(chǎn)物、細(xì)胞（NK細(xì)胞、單 核-吞噬細(xì)胞、DC、NKT、中性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞、B1細(xì)胞）等特點：先天具有、無潛伏期、

2、無特異性、無記憶性 作用時間：0-96小時 Adaptive immunity 獲得性(適應(yīng)性)免疫 定義：機體在生活過程中，因接觸抗原性物質(zhì)而獲 得的免疫。T、B細(xì)胞識別病原體成分后產(chǎn) 生的免疫應(yīng)答 特點：后天獲得、有潛伏期、特異性，記憶性 參與細(xì)胞：T細(xì)胞和 B細(xì)胞 起作用時間：晚，一般在感染后4-5天發(fā)揮作用一、免疫細(xì)胞的種類與特征 免疫細(xì)胞的起源與分化抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell, APC）加工處理抗原，將抗原肽提呈給抗原特異性淋巴細(xì)胞的一組免疫細(xì)胞。血液中主要的APC細(xì)胞主要包括單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞其他細(xì)胞自然殺傷(NK)細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜酸性

3、粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，血小板等NK細(xì)胞肥大細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞血小板免疫細(xì)胞的特征1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征 理化性狀 生物學(xué)特性人CD分組分 組 CD（舉例）T細(xì)胞 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、 CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B細(xì)胞 CD19、CD20、CD21、 CD40、CD79a(Ig)、CD79b (Ig)、 CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、 CD269(BCMA)、CD

4、307(IRTA2)髓樣細(xì)胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、 CD257(BAFF)、CD312(EMR2) 血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、 CD61 (整合蛋白3) 、CD62P(P選凝素)NK細(xì)胞 CD16 (FcRIII) 、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、 CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、 CD336(NKp44)、CD337(NKp30) 非譜系 CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、C

5、D45RO、CD46(MCP)、 CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、 CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD289(TLR9)、 CD305(LAIR-1)、 CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC) 人CD分組分 組 CD（舉例）黏附分子 CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18 (整合蛋白2) 、 CD29 (整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、 CD62E(E整合蛋白)、CD62L (L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、 CD325(N-cadherin)、

6、CD326(EpCAM)細(xì)胞因子/ CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw137、CD178(FasL)、 趨化因子受體 CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、 CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4)內(nèi)皮細(xì)胞 CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、 CD144(VE鈣黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、 CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322) 碳水化合物結(jié)構(gòu) CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327

7、CDw329(siglec6、7、9)樹突狀細(xì)胞 CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、CD274CD276(B7H1-B7H3) 、 CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)干細(xì)胞/祖細(xì)胞 CD133、CD243 基質(zhì)細(xì)胞 CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、 CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1)紅細(xì)胞 CD233CD242 免疫細(xì)胞分離基本原理 不同細(xì)胞密度不同 不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同 不同細(xì)胞表面分化抗原不同根據(jù)不同的實驗?zāi)康目梢圆扇∠铝胁煌姆蛛x方法免疫細(xì)胞的分離技術(shù)1、密度

8、梯度離心法2、黏附分離法（尼龍毛法、貼壁法、親和板法）3、磁性分離法4、熒光激活分離法5、其他分離法（花環(huán)沉降法）（一）外周血單個核細(xì)胞分離 外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì) 胞 Ficoll分離液法主要用于分離外周血中的單個核細(xì) 胞，是根據(jù)不同細(xì)胞密度不同的分離法不同細(xì)胞密度不同 單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度 為1.077左右 人的紅細(xì)胞密度為1.093，1.077 粒細(xì)胞密度為1.092， 1.077 血小板密度 1.077 肝素抗凝靜脈血與等量Hanks液或PBS混勻沿管壁緩慢疊加于Fico

9、ll分層液面上水平離心2000 rpm 20 min離心后管內(nèi)分三層，用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個核細(xì)胞洗滌細(xì)胞兩次RPMI1640重懸細(xì)胞臺盼蘭染液混合計數(shù)細(xì)胞活力檢測：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色活細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞百分率100總細(xì)胞數(shù) 方法用本法分離PBMC，一般純度在90以上，收獲率可達(dá)8090，活細(xì)胞百分率在95以上（二）T淋巴細(xì)胞及其亞群的分離T淋巴細(xì)胞亞群T細(xì)胞的發(fā)育階段分類 初始T細(xì)胞 naive T cells 未經(jīng)抗原刺激的成熟T細(xì)胞，表達(dá)CD45RA效應(yīng)T細(xì)胞 effector T cells 表達(dá)高親和力IL-2R，介導(dǎo)免疫效應(yīng)記憶T細(xì)胞 memory T cells

10、 表達(dá)CD45RO，介導(dǎo)再次免疫應(yīng)答T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)TCR的類型分類 TCR+ T細(xì)胞 TCR+ T細(xì)胞 T淋巴細(xì)胞亞群T細(xì)胞功能分類 輔助性T細(xì)胞 Helper T cells , Th 效應(yīng)T細(xì)胞 Effector T cells , TE細(xì)胞毒T細(xì)胞 Cytotoxic T lymphocytes, CTL遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)T細(xì)胞Delayed T cells，Td初始T細(xì)胞Naive T cells 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Regulatory T cells，Tr記憶T細(xì)胞Memory T cells，Tm抑制性T細(xì)胞Suppressor T cells，Ts 輔助性T細(xì)胞 Helper T ce

11、lls , Th Th1: 細(xì)胞免疫 Th2：體液免疫Th17：炎癥反應(yīng)輔助性T細(xì)胞 Helper T cells , ThTGF-+IL-6輔助性T細(xì)胞 Helper T cells , Th濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfollicularhelper，Tfh）通過細(xì)胞因子IL-10和IL-21來調(diào)節(jié)B細(xì)胞的功能 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的分化Foxp+T調(diào)節(jié)細(xì)胞可以從胸腺直接分化，也可在TGF-作用下從Foxp3-T細(xì)胞分化。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Regulatory T cells，Tr玫瑰花結(jié)法（E花環(huán)沉降法） 尼龍毛柱分離法 淘洗法免疫磁珠法流式細(xì)胞術(shù)分選法（二）T淋巴細(xì)胞及其亞群的

12、分離人T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)CD2分子，即綿羊紅細(xì)胞受體， B細(xì)胞則無。在適當(dāng)?shù)臈l件下，可與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）結(jié)合，形成玫瑰花結(jié)（rosette）,因為紅細(xì)胞環(huán)繞T細(xì)胞，形似花環(huán)，所以又稱E-花環(huán)（E-rosette）該實驗常用于臨床檢測人外周血T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例，由此可間接反映機體的細(xì)胞免疫功能狀況 玫瑰花結(jié)法淋巴細(xì)胞 + SRBC懸液 37C水浴 10 min 低溫低速離心 T細(xì)胞形成E花環(huán)而沉于管底 懸液中為B細(xì)胞。 方法 混合單個核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而T細(xì)胞不與尼龍毛粘附的特性，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法尼龍

13、毛柱分離法簡單，快速，經(jīng)濟，尼龍毛可反復(fù)利用可分離大量細(xì)胞細(xì)胞不會被激活，可用于功能測定純度不高耗時優(yōu)點 缺點 也叫親合板結(jié)合分離法 (immune panning isolation）。利用親合層析和抗體固相包被原理，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，由于各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同抗原性的特點和表面標(biāo)志，加細(xì)胞懸液后，凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)的固相抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲取同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。但淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，本法更合適 淘洗法親和板分離淋巴細(xì)胞

14、示意圖利用T淋巴細(xì)胞表面某種標(biāo)志性抗原與包被在固相載體上的特異性單抗結(jié)合，將T細(xì)胞與其他細(xì)胞分離的方法T淋巴細(xì)胞淘洗分離原理羊抗兔Ig包被平皿CD4 一抗培育T細(xì)胞，倒入平皿，4孵育1小時；收集未粘附的CD4-T細(xì)胞PBS漂洗非特異吸附的CD4-T細(xì)胞收集粘附的CD4+T細(xì)胞，可以用刮板刮取并在顯微鏡下觀察 方法 （以CD4+T細(xì)胞為例）免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離 免疫磁珠法（Magneti

15、c activated cell sorting, MACS）NS陽性選擇法（正選）NS陰性選擇法（負(fù)選） 免疫磁珠細(xì)胞分選裝置將特異性抗T細(xì)胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合T細(xì)胞在磁場中，結(jié)合T細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細(xì)胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫 T細(xì)胞 免疫磁珠法 陽性選擇T細(xì)胞 將多種特異性抗非T細(xì)胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非T細(xì)胞在磁場中，結(jié)合其它細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的T細(xì)胞被洗脫下來免疫磁珠法 陰性選擇T細(xì)胞 CD4+ T Cell Isolation Kit

16、 II Non-CD4+ T cells in PBMC, i.e., CD8+ T cells, / T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, monocytes, granulocytes, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled by using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD8, TCR /, CD19, CD56, CD14, CD16, CD36, CD123, and CD235a (

17、glycophorin A). These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin MicroBeads for depletion. Thereby, highly pure CD4+ T cells are obtained. 免疫磁珠法 陰性選擇CD4+ T細(xì)胞實例 PBMC before separation Untouched CD4+ T cells熒光激活細(xì)胞分離法(fluorescence activated cell sorter, FACS)FACS用途：用流式細(xì)胞儀對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析

18、與分選的一門技術(shù)原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99% 方法 （以CD4+ T細(xì)胞為例）PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清；加入含AB血清的PBS封閉，4孵育10分鐘；加入適量的PerCP-CD3，APC-CD4抗體，4孵育30分鐘；PBS洗滌，低溫離心棄上清并用RPMI 1640重懸；流式細(xì)胞術(shù)分選；（三）B淋巴細(xì)胞及其亞群的分離如果僅考慮PBMC中T細(xì)胞和B細(xì)胞，那么所有從PBMC中分離T淋巴細(xì)胞的

19、方法實際上也可用于分離B淋巴細(xì)胞。B細(xì)胞表面標(biāo)志 SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中以SmIg為B細(xì)胞所特有，是鑒定B細(xì)胞可靠的指標(biāo) CD19/CD5分子：可將B細(xì)胞區(qū)分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞，B1細(xì)胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細(xì)胞僅為CD19陽性，B2細(xì)胞為通常所指的B細(xì)胞 終濃度5 mM L-leucine methyl ester (L-LME)重懸PMBC，混勻，室溫35s離心，400 g，10 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞重懸于25 ml RPMI 1640培養(yǎng)基，過尼龍毛柱，去除細(xì)胞團塊玫瑰花結(jié)法去除T細(xì)胞抗CD19或CD20

20、單抗標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢驗B細(xì)胞純度去除Mo/M法將特異性抗B細(xì)胞表面分子CD19的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合B細(xì)胞在磁場中，結(jié)合B細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細(xì)胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫 CD19+B細(xì)胞 免疫磁珠法 陽性選擇B細(xì)胞 將多種特異性抗非B細(xì)胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非B細(xì)胞在磁場中，結(jié)合其它細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的B細(xì)胞被洗脫下來免疫磁珠法 陰性選擇B細(xì)胞 B Cell Isolation Kit II Non-B cells, i.e., T cells, NK c

21、ells, monocytes, dendritic cells, granulocytes, platelets, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotinylated CD2, CD16, CD14, CD36, CD43, and CD235a (glycophorin A) antibodies. These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin MicroBeads for d

22、epletion. Highly pure B cells are obtained by depletion of magnetically labeled non-B cells.PBMC before separation Untouched B cells免疫磁珠法 陰性選擇B細(xì)胞實例 （四） Mo/M分離技術(shù) 單核-巨噬細(xì)胞包括骨髓中的前單核細(xì)胞、外周血中的單核細(xì)胞、以及組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞(M)。M來源于血液中的單核細(xì)胞，而單核細(xì)胞又來源于骨髓中的前體細(xì)胞。Mo/M細(xì)胞表面標(biāo)志 表面標(biāo)志抗原：CD14，但CD14也表達(dá)在粒細(xì)胞。 CD14主要強表達(dá)在單核-巨噬細(xì)胞，弱表達(dá)在粒細(xì)胞上 無

23、血清RPMI 1640培養(yǎng)液將PBMC 2106 cell/ml重懸；75 ml培養(yǎng)瓶中加入10 ml細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱內(nèi)37孵育1小時；吸盡培養(yǎng)液，RPMI 1640培養(yǎng)液漂洗2遍，去除非黏附細(xì)胞；細(xì)胞刮片輕輕刮取黏附的單核細(xì)胞。黏附法快速，方便純度和得率均較低易引起Mo/M激活，引起基因表達(dá)和分泌蛋白優(yōu)點 缺點 將特異性抗單核細(xì)胞表面分子CD14的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合單核細(xì)胞在磁場中，結(jié)合單核細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細(xì)胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫 CD14+單核細(xì)胞 免疫磁珠法 陽性選擇單核細(xì)胞 將多種特異性抗非單核細(xì)胞表面

24、分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非單核細(xì)胞在磁場中，結(jié)合其它細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的單核細(xì)胞被洗脫下來免疫磁珠法 陰性選擇單核細(xì)胞 Monocyte Isolation Kit II Non-monocytes, such as T cells, NK cells, B cells, dendritic cells, and basophils, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD3, CD7,

25、CD56, CD19, CD16, CD123, and CD235a (Glycophorin A), as well as Anti-Biotin MicroBeads. Highly pure unlabeled monocytes are obtained by depletion of the magnetically labeled cells.PBMC before separation Untouched Monocytes免疫磁珠法 陰性選擇單核細(xì)胞PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清加入含AB血清的PBS封閉，4孵育10分鐘加入適量的FITC-CD14抗體，4孵育30分鐘PBS洗滌，低溫離心棄上清并用RPMI 1640