各種印跡法的詳細(xì)介紹課件

1、印跡法（Blotting）技術(shù)簡(jiǎn)介李娟 馬曉偉oct18,2010定義：印跡法（Blotting） 是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。 Southern blotting 1975年，Edward M. Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 （NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法Northern blotting 1979年，McMaster和Carmichael對(duì)RNA進(jìn)行印跡分析，發(fā)明 Northern印跡技術(shù) Western blotting 1979年，George Stark對(duì)電泳后的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行印跡分析從而

2、 發(fā)明western印跡技術(shù)概述 生物大分子印跡法實(shí)際上是凝膠電泳技術(shù)、固定化技術(shù)及分子親和技術(shù)三者融為一體的綜合性技術(shù)，其核心在于把凝膠電泳已分離的區(qū)帶轉(zhuǎn)移并印跡于固定化膜上。蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用的Western雜交方法與DNA分析應(yīng)用中的Southern雜交法RNA分析中的Northern雜交法相似，均是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體上，并均以針對(duì)特定氨基酸或核苷酸序列所制備的特異性樣品作為探針檢測(cè)其相同或相似序列。Northern BlottingRNA提取 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色Western Blotting基本原理 在電場(chǎng)的作

3、用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。Western Blotting 操作流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗孵育二抗孵育底物顯色使用的儀器SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理： SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu) SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子,這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其原來(lái)所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來(lái)所帶的電荷可以忽略不計(jì),消除了不同分子之

4、間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的條帶帶也為蛋白質(zhì)的亞基 SDS濃縮膠配方轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)麗春紅染色 麗春紅帶負(fù)電荷，可以與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合，同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合，從而形成紅色的條帶，麗春紅對(duì)蛋白的染色是可逆的，染色后可以用PBS或TBS-T溶液洗去封閉脫脂奶粉（5）BSA（牛血清白蛋白）Western Blotting 膜封閉液洗轉(zhuǎn)印膜：室溫用TBS-T漂洗3次x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。2) 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉2h，也可在4度過(guò)夜。3)

5、 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min. 一抗、二抗孵育1. 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)抗體效價(jià)選擇合適的抗體濃度，將一抗溶液與濾膜溫育。室溫6小時(shí)左右，4過(guò)夜2. 倒掉一抗溶液，用TBS-T漂洗液濾膜3次，每次7min3. 加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 室溫2小時(shí)4. 倒掉二抗溶液，用TBS-T漂洗液濾膜3次，每次7min,即可準(zhǔn)備顯影二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）將在暗室中將顯色劑A,B 溶液按1：1混合，后均勻涂抹在膜上結(jié)合有二抗的地方即可催化底物發(fā)出熒光將膠片貼在膜的發(fā)光區(qū)上，根據(jù)熒光強(qiáng)弱選擇合適的曝光時(shí)間曝光結(jié)束

6、后將膠片放入顯影液中至出現(xiàn)條帶后再放入定影液中轉(zhuǎn)膜：膜的選擇，轉(zhuǎn)膜方法取舍樣品處理Western blotting 常見(jiàn)問(wèn)題分析及其應(yīng)用 馬曉偉轉(zhuǎn)膜-轉(zhuǎn)膜方法的選取常用的有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)：濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。另外用這種方法轉(zhuǎn)移雙向電泳中常規(guī)使用的大膠比較困難。 轉(zhuǎn)膜操作流程關(guān)于轉(zhuǎn)膜的注意事項(xiàng)： 1.膠在負(fù)極，膜靠近正極； 2.轉(zhuǎn)膜緩沖液一定要事先預(yù)冷，最好提前一天配好放4 冰箱； 4.濾紙不要大過(guò)膜，防止短路； 5.夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒(méi)有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全； 6

7、.注意一定要戴手套或用塑料鑷子接觸膜，因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫?huì)影響轉(zhuǎn)膜效率并會(huì)使膜臟掉； 7.在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。半干轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因?yàn)殡姌O板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場(chǎng)強(qiáng)度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法又快（15-45 分鐘）又好。多數(shù)半干轉(zhuǎn)移方法使用一種以上的緩沖系統(tǒng)，可以同時(shí)高效轉(zhuǎn)移大小不同的蛋白。然而，半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)因緩沖液較少不適于長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)移。 半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的，時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的；而濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定。兩種轉(zhuǎn)移系

8、統(tǒng)中都必須注意防止在濾紙、凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡，氣泡阻礙轉(zhuǎn)移并在印跡膜上產(chǎn)生“禿斑”（即非轉(zhuǎn)移區(qū)）。小分子量的蛋白半干轉(zhuǎn)效果比較好，大分子量（100KD 以上）建議濕轉(zhuǎn)干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。負(fù)載電壓不宜超過(guò)1V/cm2膠面積。2培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上1020min。 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后按比例加入loading-Buffer（含DTT ）,100 ，10min。 12000g離心，4，2mi

9、n。 取少量上清進(jìn)行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70一個(gè)月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。3組織： 勻漿 對(duì)于心肝脾腎等組織可每50100mg加1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解液?？墒謩?dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進(jìn)行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70一個(gè)月

10、，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。western顯色的方法主要有以下幾種i. 放射自顯影ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECLiii. 底物熒光ECFiv. 底物DAB呈色 現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。Western Blotting常見(jiàn)問(wèn)題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止

11、部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？ 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫背景太高膜沒(méi)有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過(guò)高 原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜緩沖液將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析1. Photoshop 軟件2. Image J 軟件3. Excel 軟件4. Graphpad prism 軟件Western bloting