一種在豌豆植物中瞬時表達(dá)外源蛋白的新方法

1、一種在豌豆植物中瞬時表達(dá)外源蛋白的新方法關(guān)鍵詞：豌豆；瞬時表達(dá)；發(fā)芽種子；真空侵染中圖分類號：Q819文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1質(zhì)粒、菌株、抗體及植物材料實(shí)驗(yàn)過程中所用抗生素利福平、卡那霉素、四環(huán)素及乙酰丁香酮均購自北京鼎國生物技術(shù)。用來鑒定豌豆早褐病毒載體pCAPE2-GFP的引物為：5-CGGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-TT-35-GGGGTACCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-C-3用來鑒定pCAPEl載體的引物為：5-CGTTAGATTGCGCTGTGG-35-TGCCTTTGCTACGAACCT-3以上引物由上海生物工程

2、合成。分別以豌豆早褐病毒載體pCAPE2-GFP和pCAPEl為模板進(jìn)展PCR鑒定，PCR反響條件為94預(yù)變性3min； 9450s，50 50s.7250s，33個循環(huán)；72 8min。反響完畢后進(jìn)展瓊脂糖凝膠電泳。本研究選擇真空處理時間、菌體工作液濃度及真空壓力3個因子對該體系進(jìn)展優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)過程中以綠色熒光蛋白green fluorescent protein，GFP表達(dá)率表達(dá)綠色熒光蛋白的植株占總株數(shù)的比率來評價該體系的工作效率，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每次處理種子數(shù)目不少于20粒，結(jié)果取平均值。在真空壓力0.08MPa和菌體工作液濃度OD00=1.01.5恒定的條件下選擇真空處理時間分別為：

3、1、10、15min對豌豆種子進(jìn)展真空侵染，侵染后播種于土壤中，幼苗出土后紫外燈下跟蹤綠色熒光蛋白的表達(dá)情況并記錄。選擇一樣的菌體工作液濃度，分別采用葉片注射法及發(fā)芽種子真空侵染法進(jìn)展接種，紫外燈下跟蹤觀察GFP的表達(dá)情況并拍照記錄。在外源蛋白表達(dá)頂峰期分別搜集可溶性總蛋白，15%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)展電泳后轉(zhuǎn)膜，并以Rubisco大亞基作為內(nèi)參，以GFP抗體檢測外源蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1豌豆早褐病毒載體的PCR鑒定結(jié)果豌豆早褐病毒的兩個載體同時接種植物才能完成正常的侵染工作，通過PCR法對pCAPE2-GFP載體上的GFP基因片段和pCAPEI上的特異片段進(jìn)展鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈

4、陽性，結(jié)果如圖1所示。2.2.2發(fā)芽種子真空侵染體系的優(yōu)化2.2.3發(fā)芽種子真空侵染法與葉片注射法的比較1215d時提取豌豆植物可溶性總蛋白，以Rubisco大亞基作為內(nèi)參通過蛋白雜交法比較兩種接種方法外源蛋白的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，Rubisco大亞基雜交結(jié)果說明各泳道57植物蛋白質(zhì)上樣量根本一致，GFP雜交結(jié)果說明兩種接種方法外源蛋白的表達(dá)量相當(dāng)。3討論參考文獻(xiàn)References：2RAMWSSAR K，SABALZA M，CAPELL T，et al.Maize plants：An ideal production platform for effective and safe

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