干細胞的體外培養(yǎng)_第1頁
干細胞的體外培養(yǎng)_第2頁
干細胞的體外培養(yǎng)_第3頁
干細胞的體外培養(yǎng)_第4頁
干細胞的體外培養(yǎng)_第5頁
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文檔簡介

1、關(guān)于干細胞的體外培養(yǎng)第1頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三一、干細胞的概念干細胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細胞,在一定條件下,它可以分化成多種功能細胞。干細胞是一種未充分分化,尚不成熟的細胞,具有再生各種組織器官和人體的潛在功能,醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細胞”。 第2頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三干細胞幾個主要特征具有自我更新能力與自我維持能力,可以無限增殖分裂。干細胞一旦形成,在機體內(nèi)終生都具有自我更新能力,以維持自身數(shù)目的恒定。既具有生理性的更新能力,也具有對損傷或疾病導(dǎo)致的反應(yīng)

2、有修復(fù)能力,如骨髓間充質(zhì)干細胞等。 干細胞維持自穩(wěn)性的機制:對稱分裂和不對稱分裂第3頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 4 干細胞的對稱分裂和不對稱分裂對稱分裂 (symmetry division)不對稱分裂 (asymmetry division)干細胞 分 化 細 胞 干細胞 分化細胞第4頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三干細胞幾個主要特征干細胞本身不是終末分化細胞;具有多向分化的能力(多能性或全能性),即可以分化發(fā)育成各種胚層組織的細胞(ES細胞),或可以分化成為本系統(tǒng)各譜系的細胞(特定組織干細胞,如造血干細胞)。第5頁,共74頁,202

3、2年,5月20日,13點35分,星期三干細胞幾個主要特征干細胞的自我更新與分化需要特定的微環(huán)境,也就是說干細胞往哪一種方向分化,必須在該細胞生存的特定微環(huán)境前提下進行分化。已有諸多的實驗表明,如將ES細胞種植入小鼠大腦內(nèi),這些干細胞將向神經(jīng)系統(tǒng)分化。在不同生長因子刺激下干細胞可表現(xiàn)出不同分化潛能第6頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三干細胞幾個主要特征干細胞分裂產(chǎn)生的子細胞只能有兩種命運保持為干細胞或分化為特定細胞。第7頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三二、干細胞的分類1、按分化潛能大小來分類:全能干細胞( Totipotent stem cell

4、 ):能分化成所有組織和器官的干細胞,它具有形成完整個體的分化潛能。如受精卵,胚胎干細胞。多能干細胞( pluripotent stem cell ),具有分化出多種組 織細胞的潛能,但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力,發(fā)育 潛能受到一定的限制。如骨髓多能造血干細胞是典型的例 子,它可分化出至少十二種血細胞 。專能干細胞( unipotent stem cell ),這類干細胞只能向 一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細胞分化,如上皮組織 基底層干細胞、肌肉中的成肌細胞等。第8頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三2、根據(jù)來源來分: 來源于胚胎- 胚胎干細胞 ESC (Embryo

5、nic Stem Cell ) 胚胎性生殖細胞 EGC (Embryonic Germ Cell ) 來源于成體組織- 成體干細胞 ASC (Adult-derived Stem Cell )第9頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三胚胎干細胞指從著床前的胚胎內(nèi)細胞團(桑椹胚)或原始生殖細胞獲得的一種具有多潛能性、可發(fā)育成為各種細胞、同時可保持不分化狀態(tài)而持續(xù)生長的克隆細胞系。它可以無限增殖并分化成為全身200多種細胞類型,進一步形成機體的所有組織、器官。為全能干細胞。 第10頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三成體干細胞是成體組織內(nèi)具有自我更新及分化

6、一種或一種以上子細胞的未成熟細胞。來源于成年組織或器官,一般具有組織特異性,只能分化成特定的細胞或組織。為多能干細胞或單能干細胞,如造血干細胞和上皮干細胞等。 第11頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三3、根據(jù)干細胞組織發(fā)生的名稱進行分類:胎胎干細胞造血干細胞骨髓間質(zhì)干細胞肌肉干細胞成骨干細胞內(nèi)胚層干細胞視網(wǎng)膜干細胞胰腺干細胞第12頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三三、干細胞研究的歷史情況 1959年,美國首次報道了通過體外受精(IVF)動物。 60年代,幾個近親種系的小鼠睪丸畸胎瘤的研究表明其來源于胚胎生殖細胞(embryonic germ ce

7、lls, EG細胞),此工作確立了胚胎癌細胞(embryonic carcinoma cells, EC細胞)是一種干細胞。 1968年,Edwards 和Bavister 在體外獲得了第一個人卵子。 70年代,EC細胞注入小鼠胚泡產(chǎn)生雜合小鼠。培養(yǎng)的EC細胞作為胚胎發(fā)育的模型,雖然其染色體的數(shù)目屬于異常。1978年,第一個試管嬰兒在英國誕生。 第13頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三1981年,從小鼠胚泡內(nèi)細胞團分離出小鼠ES細胞,并建立了小鼠ES細胞體外培養(yǎng)條件。將ES細胞注入小鼠,能誘導(dǎo)形成畸胎瘤。 1984-1988年,Anderews 等人從人睪丸畸胎瘤細胞系

8、Tera-2中產(chǎn)生出多能的、可鑒定的(克隆化的)細胞,稱之為胚胎癌細胞(embryonic carcinoma cells, EC細胞)。克隆的人EC細胞在視黃酸的作用下分化形成神經(jīng)元樣細胞和其他類型的細胞。 1989年,Pera 等分離了一個人EC細胞系,此細胞系能產(chǎn)生出三個胚層的組織。這些細胞是非整倍體的(比正常細胞染色體多或少),他們在體外的分化潛能是有限的。 第14頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三1998年美國有兩個小組分別培養(yǎng)出了人的多能干細胞: James A. Thomson在 Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的研究小組的方法是:人卵體外受精后,將胚胎培育到囊

9、胚階段,提取 inner cell mass細胞,建立細胞株。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的另一個研究小組的方法是:從受精后59周人工流產(chǎn)的胚胎中提取生殖母細胞( primordial germ cell ),建立細胞株。1999年12月,美國科學(xué)家在美國科學(xué)院院刊報告說,小鼠肌肉組織的成體干細胞可以“橫向分化”為血液細胞。隨后,世界各國的科學(xué)家相繼證實,成體干細胞,包括人類的成體干細胞具有可塑性。1999年12月,干細胞研究進展被科學(xué)雜志評選為該年度世界十大科學(xué)進展之首。2007年日本的Yamanaka研究小組和美國的James Thomson 研

10、究小組分別獲得誘導(dǎo)多能性干細胞 (induced pluripotent stem cell,iPS細胞)。 第15頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三至今已分離得到的胚胎干細胞物種有:小鼠的胚胎干細胞(1981)金黃地鼠(1988)、貂(1993)、豬(1994,1997)、雞(1996)、恒河猴(1995)、絨猴(1996)。分離得到人的胚胎干細胞(1998),胚胎生殖細胞(1998),目前不斷報道成年組織來源的的干細胞。第16頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三四、胚胎干細胞的體外培養(yǎng)(一)技術(shù)原理基本原則:促進ES增殖的同時,維持其未分化的二

11、倍體狀態(tài)。有飼養(yǎng)層(feeder layer)培養(yǎng)法:以小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系(STO)或小鼠胚胎成纖維細胞( Mouse Embryo Firbroblasts, MEF)制備飼養(yǎng)細胞單層,主要是利用其分泌的生長因子FGF和抑制干細胞分化因子白血病抑制因子(LIF)共同作用,保持干細胞在體外克隆而不分化。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法:利用各種能分泌抑制分化因子的細胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備條件培養(yǎng)基。第17頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三(二)基本過程飼養(yǎng)層細胞制備或條件培養(yǎng)基制備胚胎的制備和培養(yǎng)胚胎干細胞的分離胚胎干細胞的培養(yǎng)胚胎干細

12、胞的鑒定凍存與復(fù)蘇細胞克隆形態(tài)堿性磷酸酶檢測核型的鑒定分化能力的觀察嵌合能力的測定第18頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三1、飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞( MEF):取孕12.5-14.5 d鼠胚胎軀干,以植塊培養(yǎng)法或分散細胞培養(yǎng)法制備,取第三代至第五代細胞作為飼養(yǎng)層細胞。STO細胞:按照一般已建細胞系培養(yǎng)方法。DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液。采用胎數(shù)多小鼠一次大量培養(yǎng)MEF凍存,用時復(fù)蘇。第19頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 MEF和STO的優(yōu)缺點:MEF分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制分化因子的能力比STO強,STO作飼養(yǎng)細胞時常需

13、在培養(yǎng)基中加入LIF。MEF不能長期傳代,需經(jīng)常準備懷孕小鼠制備第三代至第五代細胞,STO則可長期傳代培養(yǎng)。MEF不具耐藥性,不能作為轉(zhuǎn)染外源性基因的胚胎干細胞篩選用。SNL細胞為轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因的STO細胞,可分泌足夠的抑制分化因子,并因帶有neor抗性基因可用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細胞篩選。胚胎干細胞培養(yǎng)過程中,死亡MEF或STO的染色體可能導(dǎo)致胚胎干細胞的突變及影響正常核型的保持。不易獲得純的胚胎干細胞作為生化和分子生物學(xué)方面的分析。使用前如用絲裂霉素C處理,如清洗不徹底,殘余的絲裂霉素C會影響胚胎干細胞的增殖。第20頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三報

14、道的人源性滋養(yǎng)層細胞:人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞胎兒肌肉或胎兒皮膚細胞新生兒包皮成纖維細胞成人子宮內(nèi)膜細胞人胎盤成纖維細胞人胚胎干細胞經(jīng)體內(nèi)分化獲取的間充質(zhì)干細胞第21頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三2、飼養(yǎng)單層制備MEF或STO連成一片,以含10g/ml絲裂霉素培養(yǎng)液370C作用2-3 h(如細胞層較薄,也可縮短至30min-1.5h),或射線照射(劑量為30-100Gy)。棄含絲裂霉素培養(yǎng)液,PBS洗5次, 射線處理者不用清洗。消化細胞,制備懸液種植至用0.1%明膠處理過(0.1%明膠水溶液覆蓋培養(yǎng)瓶表面,室溫2h以上)的培養(yǎng)瓶,種植細胞數(shù):MEF7.5104-10

15、5個/cm2,STO為5104個/cm2。培養(yǎng)至細胞連成一片沒有間隙(中間可補加處理過的細胞),制備好的飼養(yǎng)單層置培養(yǎng)箱,5天內(nèi)使用,使用前換成干細胞培養(yǎng)液。第22頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三觀察:好的飼養(yǎng)單層,細胞連成一片,無間隙,死亡細胞和雜細胞極少。MEF和STO產(chǎn)生的抑制分化因子一部分分泌到培養(yǎng)液中,一部分錨定在細胞外基質(zhì)上。無間隙的飼養(yǎng)單層保證了胚胎干細胞都能與飼養(yǎng)層細胞接觸而達到最佳效果。第23頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三3、用于培養(yǎng)胚胎干細胞的條件培養(yǎng)基直接在胚胎干細胞培養(yǎng)液中加入重組的LIF,使終濃度為1000U/ml

16、。Baffalo大鼠肝細胞株BRL條件培養(yǎng)基(BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌(瘤)和胚胎干細胞分化的因子DIF。收集培養(yǎng)72h的培養(yǎng)液,過濾除菌,用前6-7份+3-4份胚胎干細胞培養(yǎng)液,再添加8-10%胎牛血清。年齡 2-3周大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)基(RH-CM):分泌抑制胚胎干細胞分化因子。收集1-6代細胞培養(yǎng)液,過濾除菌,用前6份+3份胚胎干細胞培養(yǎng)液+1份胎牛血清。第24頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三4、胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)(1)培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液要用超純水或五蒸水,不能有細菌內(nèi)毒素污染,水要現(xiàn)用現(xiàn)制。高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,葡萄糖濃度為(4.5g/L):

17、有助于囊胚貼壁、內(nèi)細胞團增殖及胚胎干細胞集落形成。使用前還要添加-巰基乙醇(0.1mmol/L)或單硫甘油( 0.15mmol/L):保護細胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的巰基不被氧化,促進胚胎干細胞的貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清:必不可少,但也有缺點。第25頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三血清缺點:成分復(fù)雜,不利于整合到胚胎干細胞基因組中外源性基因功能的測定;可能含有一些未知的促進胚胎干細胞分化的因子;含有微量的血紅蛋白和內(nèi)毒素,干擾胚胎干細胞生長。無血清胚胎干細胞培養(yǎng)液無上述缺點,但細胞貼附力不如有血清培養(yǎng)基。第26頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35

18、分,星期三(2)胚胎干細胞的分離小鼠:母小鼠超數(shù)排卵交配(注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素)胚胎采集:取孕3.5d(囊胚期或桑椹期)的母小鼠取胚胎胚胎培養(yǎng):培養(yǎng)皿內(nèi)制備直徑0.5cm左右露滴狀培養(yǎng)液液滴,并覆蓋透明石蠟油,胚胎置于液滴中培養(yǎng)胚胎干細胞分離:普通分離法、免疫外科法,棄除滋胚層細胞,獲得內(nèi)細胞團(inner cell mass,ICM),并分散為3-4個細胞在一起的細胞團第27頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三人胚胎干細胞來源 a.自終止妊娠(5-9周人工流產(chǎn))的胎兒中提取生殖母細胞( primordial germ cell )。 28 Gear

19、hart法第28頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三29 b.取自體外受精胚胎囊胚期內(nèi)層細胞。用這種方法,每個胚胎可取得1520個細胞用于培養(yǎng)。 Thomson法第29頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三c.通過體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)(SCNT技術(shù))獲取30 第30頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三其它干細胞的分離與純化 干細胞表面有許多特殊的標記,以造血系統(tǒng)為例,干細胞的表面標志有Sca-1和c-kit等。另外各種成體干細胞還有各自獨特的標記物,如人造血干細胞表現(xiàn)為CD34+和Thy10+而CD10,CD14,CD15,CD16,

20、CD19,CD20皆為陰性另外干細胞還有不同于一般分化細胞的物理特性,比如干細胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用這些特性及表面標志,采用熒光細胞分離器從單細胞懸液中即可分離純化干細胞。 第31頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三(3)胚胎干細胞培養(yǎng)有飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng):將內(nèi)細胞團吸置處理過的飼養(yǎng)層上,一個內(nèi)細胞團放置一個孔,370C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)2d后出現(xiàn)小集落,并逐步增大,6-10d可消化傳代,消化時,消化30s后棄消化液,殘余消化液繼續(xù)作用,當飼養(yǎng)單層出現(xiàn)裂隙(或顯微鏡下細胞之間分開),終止消化,一般為2-3min加適量培養(yǎng)

21、液,輕輕吹打成單細胞懸液,接種新飼養(yǎng)層擴大培養(yǎng)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng):明膠包被培養(yǎng)板,條件培養(yǎng)基。已建系胚胎干細胞:將已培養(yǎng)2-3d生長旺盛干細胞消化成單細胞懸液,添加新的培養(yǎng)液,按照1:3或1:6比例轉(zhuǎn)鐘。第32頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三注意事項:最初分離的內(nèi)細胞團以3-4個細胞團為宜,但集落形成后,傳代過程中一定要消化成單細胞,否則胚胎干細胞會互相誘導(dǎo),易于分化。培養(yǎng)條件要始終如一。為了增強胚胎干細胞粘附力,除明膠包被外,還可以用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進粘附。第33頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三(4)培養(yǎng)結(jié)果hES細胞集落(10)胚

22、胎干細胞呈集落狀(島嶼狀)生長,邊緣整齊,表面平滑,結(jié)構(gòu)致密,隆起生長,細胞之間界限不清。消化成單細胞后細胞小而圓,核大,胞漿小。第34頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell第35頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot re

23、presents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.第36頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三5、胚胎干細胞的凍存和復(fù)蘇凍存液:胚胎干細胞培養(yǎng)液+10%-15%DMSO。凍存細胞密度:106-107個/ml凍存與復(fù)蘇方法同普通細胞。LIF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞,仍然用不含LIF的胚胎干細胞培養(yǎng)液凍存。第37頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三(三)胚胎干細胞的鑒定1、 ES細胞生物學(xué)特性(1)ES細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形

24、態(tài)結(jié)構(gòu),胞體體積小,核大,有一個或幾個核仁。細胞中多為常染色質(zhì),胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單,散布著大量核糖體和線粒體,核型正常,保留了二倍體性質(zhì)。正常ES細胞染色體正常,如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動物個體。 第38頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三(2)ES細胞生長特性ES細胞在體外分化抑制培養(yǎng)中,呈克隆狀生長,細胞緊密地聚集在一起,形似鳥巢,細胞界限不清,克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化的扁平狀上皮細胞。 ES細胞增殖迅速,每1824 h分裂增殖 1次。此外,其還可以在體外進行選擇、操作、凍存。凍存的細胞可在需要時隨時解凍,繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性,并且來自一個克隆的細胞具有同

25、樣的特征。第39頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三40 人胚胎干細胞(hES)的特點 形態(tài):圓形或橢圓,體積較小,核質(zhì)比較大,體外抑制分化培養(yǎng)時呈鳥巢狀,集落生長并緊密堆積,細胞界限不明顯。第40頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 (3)ES細胞的高度分化潛能 ES細胞在體外需在飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)才能維持其未分 化狀態(tài),一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進行分化。在單層培養(yǎng)時細胞自發(fā)分化成多種細胞, 懸浮培養(yǎng)中: “簡單類胚體” “囊狀胚體” 細胞分化物。ES細胞可進行誘導(dǎo)分化 *用RA(維生素A酸或視黃酸)作誘導(dǎo)90以上的ES細胞 分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞, *聚

26、集培養(yǎng)的ES細胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮 的心肌細胞。 *將ES細胞注射到同源動物皮下,可形成組織瘤,其細胞 組成可代表3個胚層細胞。 *用ES細胞作核供體進行細胞核移植,可以得到可發(fā)育重 構(gòu)胚和動物個體。第41頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 (4)堿性磷酸酶的表達 許多資料表明,小鼠、大鼠的桑椹胚細胞和囊胚細胞均有堿性磷酸酶(AKP)表達,小鼠的EC細胞和ES細胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細胞和ES細胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此,AKP常用來作為鑒定EC細胞或ES細胞分化與否的標志之一。第42頁,共74頁,

27、2022年,5月20日,13點35分,星期三 (5)胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達 早期胚胎細胞表面均表達胚胎階段特異性表面抗原(SSEA-1)。在胚胎的原始外胚層細胞、ES細胞、EC細胞和原始生殖細胞的表面均可檢測到SSEA-1的表達。小鼠SSEA-1的表達自8細胞期開始,直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細胞全部呈強陽性,晚期囊胚中部分ICM呈強陽性,部分呈弱陽性,少部分為陰性。因此,SSEA也常作為ES細胞鑒定的一個標志。第43頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 2、ES細胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面: 形成畸胎瘤。將ES細胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤,包

28、括三個胚層細胞; 形成類胚體。培養(yǎng)ES細胞在非粘附底物中懸浮生長,或控制增殖細胞數(shù)目,能夠使之生成類胚體,它是一個與畸胎瘤相似的多種細胞系混雜的集合體、具有三個胚層組織; 第44頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 直系分化。通過控制ES細胞生長環(huán)境,或遺傳操縱特定基因表達,ES細胞可直接分化成某特定種系細胞,例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細胞,可使之分化為神經(jīng)細胞; 形成嵌合體。將ES細胞注射到同種動物囊胚腔中后,可以形成嵌合體(chimera),ES細胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗一個細胞系是否為ES細胞的標準。 第45頁

29、,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三3、ES細胞的鑒定- 細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)- 核型分析- 堿性磷酸酶(AKP)染色- SSEA-I 免疫熒光標記- 分化能力檢測 體外分化試驗 體內(nèi)分化試驗 嵌合體形成試驗 核移植試驗第46頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 (1)ES細胞形態(tài)學(xué)鑒定 依ES細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)(胞體體積小,核大、有一個或幾個核仁)和生長特性(呈克隆狀生長,細胞緊密聚集,形似鳥巢,界限不清)對ES細胞進行初步鑒定。第47頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 (2)核型分析 ES細胞具有正常二倍體核型,可用核型分析進行檢驗第

30、48頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 (3)堿性磷酸酶(AKP)染色原理:AKP在堿性條件(pH9.0-9.6)下能使孵育液中的-磷酸奈酚鈉水解,產(chǎn)生-奈酚,然后再與偶氮鹽偶聯(lián),形成不溶性染料而呈現(xiàn)顏色。步驟:生長胚胎干細胞克隆的蓋片以無水乙醇或冷丙酮固定10-15min水洗滴加孵育液室溫5-10min水洗10min復(fù)染(甲基綠等) 10min。結(jié)果:未分化胚胎干細胞顏色以所用偶氮鹽品種而異,分化者則為復(fù)染液顏色。對照:以已建系ES細胞(或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚)作為陽性對照,作用液中不含-萘酚磷酸鈉為陰性對照。 第49頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35

31、分,星期三第50頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三(4)胚胎干細胞特異表面抗原的表達免疫熒光檢測SSEA胚胎階段特異性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分離的hES 陰性 弱陽性 強陽性Gearhart分離的hES 陽性 弱陽性 陽性小鼠ES 陽性 陰性 陰性鼠和人胚胎干細胞表達的表面抗原有種屬差異。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達 Oct-4只限定在多潛能細胞中表達。人和小鼠的胚胎干細胞都表達轉(zhuǎn)錄因子Oct-4,當胚胎干細胞分化時,其表達能力大大降低。第51頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三52第52頁,共7

32、4頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三(5)分化能力檢測體外分化能力觀察:無飼養(yǎng)層和無抑制分化因子的條件下培養(yǎng),胚胎干細胞會分化成各種細胞或發(fā)育成胚胎體:3d “簡單類胚體” 5-10d“囊狀胚體” 貼壁細胞為細胞分化物。第53頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三體內(nèi)分化能力觀察:ES細胞接種同一品系小鼠腹股溝(107個細胞)或裸鼠、SCID小鼠(106個細胞)約2周后出現(xiàn)腫塊,4-5周進一步增大,摘除腫塊固定切片染色:見三個胚層組織,為畸胎瘤結(jié)構(gòu)裸鼠和SCID小鼠可接種異種細胞和組織的移植也可接種腹腔,2-3周后觀察腫瘤第54頁,共74頁,2022年,5月2

33、0日,13點35分,星期三嵌合能力測定:野灰色小鼠品系(如129鼠)ES注射白化體小鼠(BALB/c小鼠)或純合非野灰色小鼠(C57BL/6小鼠)著床前胚胎內(nèi),或?qū)碓从诎谆w小鼠的ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內(nèi),再移植到假孕母鼠子宮內(nèi),使之發(fā)育成個體。 如ES具有嵌合能力,則會融合到宿主胚胎細胞中,并共同發(fā)育形成各種組織細胞并產(chǎn)生個體小鼠即為嵌合體,其毛色應(yīng)是ES細胞來源品系小鼠和胚胎供體小鼠毛色的雜合,即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。 除毛色觀察,也可檢測同工酶遺傳標記,或采用PCR和小衛(wèi)星DNA方法等鑒定嵌合體。第55頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分

34、,星期三六、成體干細胞優(yōu)點獲取相對容易 源于患者自身的成體干細胞在應(yīng)用時不存在組織相容性的問題,避免了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑 理論上,成體干細胞致瘤風(fēng)險很低,而且所受倫理學(xué)爭議較少 成體干細胞還具有多向分化潛能 第56頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三但胚胎干細胞也存在自身的優(yōu)勢: 胚胎干細胞能永生化,可以傳代建系,且增殖能力強,來源充沛。 雖然成體干細胞具有向多系分化的能力,但這種分化的“效率”尚不理想。通過體外的擴增培養(yǎng)能提高轉(zhuǎn)化效率,但是體外的轉(zhuǎn)化是否會引起成體干細胞遺傳變化還有待證實,而且這種分化是否是成體干細胞多系分化的結(jié)果尚無法肯定。成體干細胞和胚胎干

35、細胞各有自身的優(yōu)勢和缺陷。同時開展對兩者的研究,能互為裨益,相得益彰。兩者的研究對干細胞領(lǐng)域而言都是必要的。 第57頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三成體干細胞鑒定方法:科學(xué)家尚未就成體干細胞的鑒定標準達成一致,經(jīng)常被采用的鑒定方法包括: 利用分子標記在活體組織中對細胞進行標記,然后確定它們所產(chǎn)生的特定細胞類型。 將細胞從活體動物上分離出來,在對其進行細胞培養(yǎng)的過程中進行標記,之后將細胞移植入另一個動物體內(nèi),觀察該細胞是否可以再生其來源組織。 分離細胞,進行細胞培養(yǎng),并對其分化進行控制,通常采用加入生長因子或向細胞內(nèi)引入新基因的方法,進而觀察細胞的分化方向。 第58頁,

36、共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 目前研究的成體干細胞 (Adult Stem Cells)Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC )Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC )Fetal Liver Stem CellsUmbilical Cord Blood Stem CellsNeural Stem Cells 第59頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三造血干細胞作為干細胞研究與應(yīng)用的突破口1. 造血細胞是細胞增殖分化的最佳模型。2. 造血干祖細胞及各系血細胞的表面標志較

37、為清 楚,細胞表型特征可進行定量分析,且可分選。3. 造血干細胞增殖及向各系分化的重要誘導(dǎo)因 子、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境等因素較為清楚。4. 造血細胞發(fā)揮功能可相對游離,不需“生物支架”、 神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜的“下游”工藝,因 此便于直接應(yīng)用于臨床。第60頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三神經(jīng)干細胞(nural stem cell,NSC) NSC可增殖分化出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種基本細胞:神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。 神經(jīng)干細胞的生化標記為巢素蛋白及波形蛋白。由于分離神經(jīng)干細胞所需的胎兒腦組織較難取材,神經(jīng)干細胞的研究仍處于初級階段。 第61頁,共74頁,

38、2022年,5月20日,13點35分,星期三五、目前干細胞的研究熱點人體干細胞的建株;干細胞保持不分化的培養(yǎng);干細胞的定向誘導(dǎo)分化;干細胞應(yīng)用的法律、倫理道德問題;干細胞、組織工程、器官工程;胚胎組織的種植及定向誘導(dǎo)分化。第62頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三 六、胚胎干細胞研究的應(yīng)用前景ES細胞在哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價值的工具;ES細胞是研究細胞分化的理想手段;ES細胞是研究基因功能的首選細胞;ES細胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的主要途徑之一;ES細胞治療技術(shù)將引起一場醫(yī)學(xué)革命;ES細胞可用于研究細胞癌變機理和新藥物的篩選。第63頁,共74頁,2022年,5

39、月20日,13點35分,星期三 Human Disease modelHepatocytesBlood Cells藥物開發(fā)、毒性測試臨床醫(yī)療應(yīng)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究Human disease model胚胎干細胞的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研發(fā)與臨床應(yīng)用第64頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三來源于干細胞的組織可能用于治療的疾病 細胞類型 治療的疾病神經(jīng)細胞 中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的細胞 糖尿病軟骨細胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細胞 免疫缺乏癥、血液病、白血病肝細胞肝炎、肝硬化皮膚細胞燒傷骨細胞骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)(眼)細胞黃斑癥骨骼肌細胞 肌肉萎縮癥第65頁,共74頁,2022年,5月20日,13點35分,星期三干

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