“癌癥的基因診斷和反義核酸基因治療治療”課件

1、“癌癥的基因診斷和反義核酸基因治療治療” 專題匯報“癌癥的基因診斷和反義核酸基因治療治療”專題匯報 一、一般情況介紹時間：9月11日9月17日地點：福建省血液病研究所 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液內(nèi)科學(xué)員來源：黑龍江 云南 江西 湖南 廣東 南寧 福建講授方式 CAI 博導(dǎo) + 博士 + 技術(shù)員內(nèi)容：理論和實驗部分 理論部分：13個專題（講座） 實驗部分：8項內(nèi)容（示范） 一、一般情況介紹福建醫(yī)科大學(xué)內(nèi)科博士點福建省“211工程”重點學(xué)科福建省科委的優(yōu)先發(fā)展研究所福建省教委和福建省衛(wèi)生廳的重點學(xué)科國家藥品監(jiān)督管理局的臨床藥理基地專業(yè)技術(shù)人員67人，教授6人，副高10人 國家級專家博導(dǎo)3人 碩導(dǎo)

2、9人62項科研成果（國際、國家、省部及省廳級）培養(yǎng)博士22人 碩士45人研究方向 癌癥的基因診斷和基因治療 細胞因子與造血調(diào)控 造血細胞培養(yǎng)與造血干細胞移植福建省血液病研究所簡介福建醫(yī)科大學(xué)內(nèi)科博士點研究方向福建省血液病研究所簡介1、反義核酸基因治療癌癥研究現(xiàn)狀與展望2、基因轉(zhuǎn)移在腫瘤治療中的應(yīng)用3、反義技術(shù)在體外凈化中的應(yīng)用4、癌癥Bcl-2基因5、癌癥的c-myc基因 診斷及反義核酸基因治療6、癌癥MDR1基因7、慢粒白血病bcr-abl融合基因的檢測及基因治療8、寡脫氧核苷酸的合成及純化9、癌癥基因缺損的測序診斷10、核酶在癌癥基因治療中的應(yīng)用11、肽核酸在癌癥治療應(yīng)用中進展12、白血病

3、細胞因子自分泌及其意義13、裸鼠、Scid鼠腫瘤模型的建立及其應(yīng)用內(nèi)容 理論1、反義核酸基因治療癌癥研究現(xiàn)狀與展望內(nèi)容 理論1、免疫組化2、癌基因熒光定量PCR3、癌細胞系的培養(yǎng)與保存技術(shù)4、FCM5、癌癥基因缺損的測序診斷技術(shù)6、基因藥物反義核酸的純化7、動物模型的建立及 反義核酸治療癌癥動物實驗技術(shù)考試1.5小時實驗部分1、免疫組化實驗部分現(xiàn)代科學(xué)證明 人類所有的疾病都與基因變異或受損有關(guān)人類現(xiàn)有的18000種疾病第一類單基因病 如 血友病、多指病第二類多基因病 如癌癥、糖尿病、 高血壓、冠心病、哮喘病等第三類獲得性基因病 如病毒性肝炎二、反義核酸基因治療癌癥研究現(xiàn)狀與展望現(xiàn)代科學(xué)證明人類

4、現(xiàn)有的18000種疾病二、反義核酸基因治療癌基因:具有遺傳效應(yīng)的DNA片斷人類總基因15.3萬個 3.8萬已肯定 11.5萬個可能長度 為地球 太陽來回6次基因組或稱詞典 20bp/second需11年讀完基因:具有遺傳效應(yīng)的DNA片斷DNA由堿基互補的兩條單鏈組成， 模板鏈稱正義鏈 互補單鏈稱反義鏈反義核酸 人工合成一段與靶基因mRNA以 堿基互補結(jié)合，從而阻斷其表達 的寡核苷酸序列包括：反義DNA 反義RNA 核酶 Antisense Oligodeoxynucleotides AS-ODNDNA由堿基互補的兩條單鏈組成，反義核酸作為基因治療藥物必須具備的條件1、能進入靶細胞內(nèi)，并有一定濃

5、度2、細胞內(nèi)長半衰期3、對抗細胞內(nèi)、血漿和體液的核酶的降解4、特異性識別靶細胞并穩(wěn)定結(jié)合5、能人工合成6、使用安全有效反義核酸作為基因治療藥物必須具備的條件1、能進入靶細胞內(nèi)，并注意1、AS-OND長度的優(yōu)化選擇 16-20bp最佳2、AS-ODN進入靶細胞內(nèi)的機制 蛋白受體介導(dǎo)的胞吞作用 AS-ODN帶負電荷3、AS-ODN的修飾和細胞內(nèi)穩(wěn)定性 甲基磷酸酯 硫代磷酸酯 肽核酸注意HOPOOHH堿基HCH2HOOHH堿基HCH2HHOPOX-=OHOH堿基CH2OOH堿基CH2HX-=O1、新的化學(xué)物質(zhì)寡核苷酸2、新的藥物受體mRNA3、新的受體結(jié)合方式堿基互補雜交4、新的藥物受體結(jié)合反應(yīng) R

6、nase H介導(dǎo)的靶mRNA的降解反義藥物與傳統(tǒng)藥物的不同特異性強 準確性高 應(yīng)用前景廣闊組織分布 除腦以外的所有組織 主要為腎肝脾及骨髓1、新的化學(xué)物質(zhì)寡核苷酸反義藥物與傳統(tǒng)藥物的不同特異性強AS-PS-ODNBcl-2 mRNA抑制細胞凋亡c-myc mRNA細胞增殖和分化c-myb mRNA(p75)造血細胞增殖和分化MDR1 mRNA(p170)多藥耐藥Bcr-abl mRNA(p210)抗凋亡AS-PS-ODNBcl-2 mRNA抑制細胞凋亡c-myc反義核酸對腫瘤細胞株的作用細胞株: HL-60 K562 U937原代白血病細胞株: AML ALL APL CML等反義核酸作用的靶

7、基因: Bcl-2 c-myc c-fos c-syc MDR bcr-abl p53反義核酸對腫瘤細胞株的作用細胞株: HL-60 K562 U反義藥物對實體瘤動物模型的藥效學(xué)研究動物模型MMP-2PKC-ac-mycPKAI端粒酶RNAC-raf-1PKAbcl-2人結(jié)腸癌人膀胱癌人黑色素瘤人腎癌人惡膠質(zhì)瘤人肺癌人結(jié)腸癌肝細胞癌效果預(yù)防肝轉(zhuǎn)移抗癌效果呈序列特 異性和濃度依賴性顯著抑制腫瘤生長, 延長生存期腫瘤生長抑制率為50%腫瘤縮小50%腫瘤生長呈劑量 依賴性降低腫瘤生長呈劑量 依賴性抑制抑制肝細胞癌生長癌細胞類型靶基因反義藥物對實體瘤動物模型的藥效學(xué)研究動物模型MMP-2人結(jié)腸反義藥物

8、治療實體瘤的臨床研究ISIS5132 C-raf 各種實體瘤、淋巴瘤 臨床II期 部分病例延長疾病穩(wěn)定期7-10個月ISIS3521 PKC-a 各種實體瘤,包括卵巢癌、 前列腺癌、結(jié)腸癌、腦瘤 臨床II期 部分有效ISIS2503 Ha-ras 間皮瘤、結(jié)腸癌、 胰腺癌等 臨床I期 部分病例延長疾病穩(wěn)定期反義藥物治療實體瘤的臨床研究ISIS5132 C-raf Bcl-2c-mycc-myb MDR1Bcr-abl的表達、檢測和 反義核酸治療的應(yīng)用范圍略Bcl-2c-mycc-myb MDR1Bcr-abl的表達核酶在癌癥基因治療中的應(yīng)用核酶是指一類具有催化活性的RNA分子 可特異性地與靶R

9、NA分子配對， 對底物進行切割，促進RNA的降解 從而使其失去生物學(xué)功能分六類： 第一型內(nèi)含子 第二型內(nèi)含子 Rnase P 發(fā)夾式核酶 斧頭式核酶 錘頭式核酶核酶在癌癥基因治療中的應(yīng)用核酶是指一類具有催化活性的RNA分NNNNNNNNNUXNNNNNNNNNNNNNNNNNA CNNNNNNN A C A U G A G C GG A N N N N N N N 催化部分 N N NN 前臂后臂N: A/C/G/UX: C/U/A切割點NNNNNNNNNUXNNNNNNNN前臂后臂N: A/C/1、Kobayashi等MDR1基因轉(zhuǎn)錄物核酶 導(dǎo)入MOLT3/TMQ800細胞系, 對長春新堿的

10、敏感性提了35倍3、將bcr/abl接合區(qū)序列的錘頭型核酶 的cDNA插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,導(dǎo)入 K562細胞,抑制生長,誘導(dǎo)凋亡2、Kashani等對H-ras的核酶導(dǎo)入 人膀胱癌細胞株EJ細胞 體外生長受抑制, 體內(nèi)致癌性及侵襲力明顯下降1、Kobayashi等MDR1基因轉(zhuǎn)錄物核酶3、將bcr/肽核酸在癌癥治療中的應(yīng)用反義治療反基因策略：通過寡核苷酸 與雙鏈DNA結(jié)合形成局部 的三鏈結(jié)構(gòu)來抑制基因的轉(zhuǎn)錄 肽核酸基因原位修復(fù)肽核酸在癌癥治療中的應(yīng)用反義治療OBOOP=OOOBOOP=OODNABNHNBO=O=ONH=N=PNAOBOOP=OOOBOOP=OODNABNHNBO=O=ON三、

11、基因轉(zhuǎn)移在腫瘤治療中的應(yīng)用精確定位： 兩方面 (AFP CEA)有效性：安全性：基因表達量和持續(xù)時間的控制： 1、轉(zhuǎn)移基因的要求三、基因轉(zhuǎn)移在腫瘤治療中的應(yīng)用精確定位： 兩方面 (AFP2、基因轉(zhuǎn)移的載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體腺病毒相關(guān)載體物理轉(zhuǎn)移（脂質(zhì)體、裸DNA、生物槍）2、基因轉(zhuǎn)移的載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂細胞腺病毒載體不能將基因整合到細胞染色體上腺相關(guān)病毒載體則避免了上述缺點逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂細胞腫瘤基因的修飾A 腫瘤基因的修正 修復(fù)一個或多個缺陷基因B 前體藥物代謝酶 TK/GCV系統(tǒng)毒性作用和旁觀效應(yīng)C 腫瘤疫苗 3、腫瘤基因治療的策略腫瘤基因的修飾3

12、、腫瘤基因治療的策略未成熟樹突狀細胞提呈成熟樹突狀細胞第二信號腫瘤細胞消化處理抗原+ MHC1,肽復(fù)合物共刺激分子基因轉(zhuǎn)移特異抗原或佐劑基因腫瘤細胞分泌細胞因子殺傷T淋巴細胞毒細胞未成熟樹提呈成熟樹第二信號腫瘤消化處理+ MHC1共刺激分子宿主免疫系統(tǒng)基因的修飾 T細胞修飾白血病患者移植物抗宿主反應(yīng)（+）異基因移植物白血病復(fù)發(fā)低白血病患者 （同 卵雙生或 去除T細胞的病人）白血病復(fù)發(fā)率高移植物抗白血病作用（GVL）宿主免疫系統(tǒng)基因的修飾 T細胞修飾白血病患者異基因移植物白B-細胞+ EBVCTL被殺滅免疫缺陷前B細胞逃脫CTL攻擊淋巴瘤EBV免疫供者取外周血CTLGVLB-細胞CTL被殺滅免疫缺陷前B細胞逃脫CTL攻擊淋巴瘤EB改變宿主對細胞毒藥物的耐藥性 用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移MDR1基因 到小鼠祖細胞 已證實能減少化療引起的骨髓移植改變宿主對細胞毒藥物的耐藥性1、反義藥物因有6個條件， 具有廣闊的應(yīng)用前景2、腫瘤細胞的死亡應(yīng)包括壞死 和凋亡兩個方面3、bcl-2 c-myc bcr-a