光譜基礎(chǔ)課件

1、 光學(xué)基礎(chǔ)1.1什么是光？傳統(tǒng)上說(shuō)，光是人類眼睛可以看見(jiàn)的一種電磁波，也稱可見(jiàn)光譜。在科學(xué)上的定義，光是指所有的電磁波譜。光是由光子為基本粒子組成，具有粒子性與波動(dòng)性，稱為波粒二象性。光可以在真空、空氣、水等透明的物質(zhì)中傳播。對(duì)于可見(jiàn)光的范圍沒(méi)有一個(gè)明確的界限，一般人的眼睛所能接受的光的波長(zhǎng)在380760nm之間。人們看到的光來(lái)自于太陽(yáng)或借助于產(chǎn)生光的設(shè)備，包括白熾燈泡、熒光燈管、激光器、螢火蟲(chóng)等。光的實(shí)質(zhì)：原子核外電子得到能量 躍遷到更高的軌道上 這個(gè)軌道不穩(wěn)定 還要躍遷回來(lái) 躍遷回來(lái)釋放出的就是一個(gè)光子 就是以光的形式向外發(fā)出能量 躍遷的能級(jí)不同 釋放出來(lái)的能量不同 光子的波長(zhǎng)就不同 光的

2、顏色就不一樣了。電磁波譜0.1mm0.76m 0.4m10nm0.01nm無(wú)線電波紅外線可見(jiàn)光紫外線X射線 射線31012hz3951012hz7501012hz301015hz301018hz10km 1km 0.1km1m1mm超長(zhǎng)波長(zhǎng)波中波短波超短波 微波30103hz0.3106hz3106hz300106hz0.31012hz 亞毫米波10m30106hz光是什么能引起人的視覺(jué)的電磁波不同的頻率使人感覺(jué)到不同顏色1.3光的一些特性 白光是由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫等各種色光組成的叫做復(fù)色光。紅、橙、黃、綠等色光叫做單色光。 色散：復(fù)色光分解為單色光而形成光譜的現(xiàn)象叫做光的色散。色散

3、可以利用棱鏡或光柵等作為“色散系統(tǒng)”的儀器來(lái)實(shí)現(xiàn)。 特性：反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振等 紅移在物理學(xué)和天文學(xué)領(lǐng)域，指物體的電磁輻射由于某種原因波長(zhǎng)增加的現(xiàn)象，在可見(jiàn)光波段，表現(xiàn)為光譜的譜線朝紅端移動(dòng)了一段距離，即波長(zhǎng)變長(zhǎng)、頻率降低（與藍(lán)移相反）。紅移的現(xiàn)象目前多用于天體的移動(dòng)及規(guī)律的預(yù)測(cè)上。光學(xué)分析涉及到的概念1）散射 2) 折射 折射是光在兩種介質(zhì)中的傳播速度不同； 3) 反射4) 干涉 干涉現(xiàn)象；5) 衍射 光繞過(guò)物體而彎曲地向他后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象；6) 偏振 光波電矢量振動(dòng)的空間分布對(duì)于光的傳播方向失去對(duì)稱性的現(xiàn)象7）雙折射：光束入射到各向異性的晶體，分解為兩束光而沿不同方向折射的現(xiàn)

4、象。它們?yōu)檎駝?dòng)方向互相垂直的線偏振光。 8）慢軸方向：在晶體有一個(gè)或個(gè)特定的方向，當(dāng)普通光順著這方向傳播時(shí)并會(huì)產(chǎn)生雙折射。這方向稱之為光軸。在晶體的界面上，與光軸平的方向稱為快軸，與光軸垂直的方向則稱為慢軸。光的偏振2.1光譜分析 光譜分析法是基于物質(zhì)發(fā)射的電磁輻射及電磁輻射與物質(zhì)的相互作用而建立起來(lái)的分析方法。三個(gè)基本過(guò)程：（1）能源提供能量；（2）能量與被測(cè)物之間的相互作用；（3）產(chǎn)生被檢測(cè)信號(hào)。特點(diǎn)：（1）所有光分析法均包含三個(gè)基本過(guò)程；（2）選擇性測(cè)量，不涉及混合物分離（不同于色譜分析）；（3）涉及大量光學(xué)元器件。光分析法光譜分析法非光譜分析法原子光譜分析法分子光譜分析法原子吸收光譜原

5、子發(fā)射光譜原子熒光光譜X射線熒光光譜折射法圓二色性法X射線衍射法干涉法旋光法紫外光譜法紅外光譜法分子熒光光譜法分子磷光光譜法核磁共振波譜法2.2.1光源 依據(jù)方法不同，采用不同的光源：火焰、燈、激光、電火花、電弧等；依據(jù)光源性質(zhì)不同， 分為：連續(xù)光源：在較大范圍提供連續(xù)波長(zhǎng)的光源，氫燈、氘燈、鎢絲燈等； 線光源：提供特定波長(zhǎng)的光源，金屬蒸氣燈(汞燈、鈉蒸氣燈)、空心陰極燈、激光等；2.2.2單色器單色器：獲得高光譜純度輻射束的裝置，而輻射束 的波長(zhǎng)可在很寬范圍內(nèi)任意改變。主要部件：（1）進(jìn)口狹縫；（2）準(zhǔn)直裝置(透鏡或反射鏡)：使輻射束成為平行光線； （3）色散裝置(棱鏡、光柵)：使不同波長(zhǎng)的

6、輻射以不同的角度進(jìn)行傳播； （4）聚焦透鏡或凹面反射鏡，使每個(gè)單色光束在單色器的出口曲面上成像。2.2.2.1棱鏡與光柵棱鏡 對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有不同的折射率，波長(zhǎng)長(zhǎng)的光，折射率?。徊ㄩL(zhǎng)短的光，折射率大。平行光經(jīng)過(guò)棱鏡后按波長(zhǎng)順序排列成為單色光；經(jīng)聚焦后在焦面上的不同位置上成像，獲得按波長(zhǎng)展開(kāi)的光譜；棱鏡的分辨能力取決于棱鏡的幾何尺寸和材料；棱鏡的光學(xué)特性可用色散率和分辨率來(lái)表征；棱鏡的頂角越大或折射率越大，角色散率越大，分開(kāi)兩條相鄰譜線的能力越強(qiáng)，但頂角越大，反射損失也增大，通常為60度角；分辨率與波長(zhǎng)有關(guān)，長(zhǎng)波的分辨率要比短波的分辨率小，棱鏡分離后的光譜屬于非均排光譜。光柵：透射光柵，反射光

7、柵； 光柵光譜的產(chǎn)生是多狹縫干涉與單狹縫衍射共同作用的結(jié)果，前者決定光譜出現(xiàn)的位置，后者決定譜線強(qiáng)度分布； 光柵越寬、單位刻痕數(shù)越多、分辨率越大2.2.3光源與試樣相互作用的場(chǎng)所2.2.4檢測(cè)器 （1）光檢測(cè)器 硒光電池、光電二極管、光電倍增管、硅二極管陣列檢測(cè)器、半導(dǎo)體檢測(cè)器；（2）熱檢測(cè)器 真空熱電偶檢測(cè)器：紅外光譜儀中常用的一種； 熱釋電檢測(cè)器：2.2.5. 信號(hào)、與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 現(xiàn)代分析儀器多配有計(jì)算機(jī)完成數(shù)據(jù)采集、信號(hào)處理、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果打印，工作站軟件系統(tǒng)光譜分析儀器分辨率分辨率光學(xué)分辨率是衡量分光能力的重要參數(shù)。它取決于在被熱敏元件探測(cè)時(shí)單色光的帶寬。三個(gè)部件對(duì)分辨率有影響：入射

8、狹縫，光柵和探測(cè)器像素尺寸。細(xì)小的狹縫可以得到更好的分辨率，但降低了靈敏度；高刻劃線的光柵增加了分辨率，但降低了光譜范圍；較小的探測(cè)器像素尺寸增加了分辨率，但降低了靈敏度。3 濾光片用來(lái)選取所需輻射波段的光學(xué)器件。濾光片產(chǎn)品主要按光譜波段、光譜特性、膜層材料、應(yīng)用特點(diǎn)等方式分類。 光譜波段：紫外濾光片、可見(jiàn)濾光片、紅外濾光片； 光譜特性：帶通濾光片、截止濾光片、分光濾光片、中性密度濾光片、反射濾光片； 膜層材料：軟膜濾光片、硬膜濾光片； 硬膜濾光片不僅指薄膜硬度方面,更重要的是它的激光損傷閾值,所以它廣泛應(yīng)用于激光系統(tǒng)當(dāng)中,面軟膜濾光片則主要用于生化分析儀當(dāng)中 帶通型： 選定波段的光通過(guò)，通帶

9、以外的光截止。其光學(xué)指標(biāo)主要是中心波長(zhǎng)（CWL），半帶寬（FWHM)。分為窄帶和寬帶。短波通型(又叫低波通)：短于選定波長(zhǎng)的光通過(guò)，長(zhǎng)于該波長(zhǎng)的光截止。 比如紅外截止濾光片長(zhǎng)波通型(又叫高波通)：長(zhǎng)于選定波長(zhǎng)的光通過(guò)，短于該波長(zhǎng)的光截止 共聚焦顯微鏡的特點(diǎn)顯微鏡成像清晰度的決定因素:1.分辨率 指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點(diǎn)間的距離來(lái)表示。2.球差 由于透鏡不能把近軸光線和遠(yuǎn)軸光線在光軸上共聚焦，以至透過(guò)標(biāo)本一點(diǎn)的光線，在通過(guò)透鏡時(shí)不能聚焦成一點(diǎn),而是形成一個(gè)光斑,從而使成像模糊不清。3.色差 由于顯微鏡透鏡類似于三棱鏡,對(duì)不同顏色的光線具有

10、不同的折射率。所以光線透過(guò)透鏡后,不同色的光聚焦在不同點(diǎn)上,從而使成像模糊,而且像的邊緣尚帶有色暈。光源 用激光做光源，從理論上消除了色差。因?yàn)榧す獾膯紊詮?qiáng)、光源波束集中、波長(zhǎng)相同。共聚焦技術(shù) 在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)小孔，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差。點(diǎn)掃描技術(shù) 將樣品分解成二維或三維空間上的無(wú)數(shù)點(diǎn)，用十分細(xì)小的激光束（點(diǎn)光源）逐點(diǎn)逐行掃瞄、成像，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件組合，最后得到一個(gè)整體平面的或立體的像。信號(hào)放大 電子圖像 光電倍增管放大信號(hào)，計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào)。軟件 計(jì)算機(jī)代替了人眼或照相機(jī)進(jìn)行觀察、攝像，得到的圖象是數(shù)字化的，可以在電腦中進(jìn)行處理，再一次提高圖象的清晰度。激光

11、共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)在結(jié)構(gòu)方面激光做光源，光色純，波長(zhǎng)固定，成像效果好，分辨率高，圖象清晰，熒光檢測(cè)信噪比高可實(shí)現(xiàn)分層掃描可實(shí)現(xiàn)連續(xù)掃描，可動(dòng)態(tài)記錄變化可多根激光管同時(shí)掃描，多色熒光同時(shí)成像掃描速度快，對(duì)樣品損傷小在應(yīng)用方面形態(tài)觀察-高清晰成像半定量-熒光強(qiáng)度分析熒光探針表達(dá)量測(cè)定定位研究-分層掃描多種熒光標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)熒光標(biāo)記物絕對(duì)定量分析擴(kuò)展應(yīng)用-如，F(xiàn)RAP法、細(xì)胞切割、細(xì)胞篩選等寬場(chǎng)照明顯微鏡和共聚焦圖像比較應(yīng)用高清晰成像半定量熒光強(qiáng)度分析熒光探針表達(dá)量測(cè)定分層掃描多種熒光標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)熒光標(biāo)記物絕對(duì)定量分析擴(kuò)展應(yīng)用共聚焦顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域（一）細(xì)胞生物學(xué)： 細(xì)胞結(jié)構(gòu)：細(xì)胞骨架，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流

12、動(dòng)性、受體，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等。（二）生物化學(xué)：酶、核酸、熒光原位雜交、受體分析。（三）藥理學(xué)：藥物對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)分析。（四）生理學(xué)： 膜受體，離子通道，細(xì)胞內(nèi)離子含量、分布及其動(dòng)態(tài)分析。（五）遺傳學(xué)和胚胎學(xué)： 細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，細(xì)胞組織的三維結(jié)構(gòu)，染色體分析，基因表達(dá)，基因診斷（六）神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)，神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞，遞質(zhì)受體，離子內(nèi)外流。（七）微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)，細(xì)菌、寄生蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)（表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)）；（八）病理學(xué)研究及病理學(xué)臨床診斷： 活檢標(biāo)本的快速診斷，腫瘤診斷，自身免疫性疾病的診斷，宮頸上皮細(xì)胞涂片診斷5 光學(xué)斷層相干技術(shù)OCTO

13、ptical Coherence To ography 利用弱相干光干涉儀的基本原理，檢測(cè)生物組織不同深度層面對(duì)入射弱相干光的背向反射或幾次散射信號(hào)，通過(guò)掃描，可得到生物組織二維或三維結(jié)構(gòu)圖像。利用近紅外線及光學(xué)干涉原理對(duì)生物組織進(jìn)行成像。 干涉成像的原理簡(jiǎn)單地說(shuō)就是將光源發(fā)出的光線分成兩束，一束發(fā)射到被測(cè)物體（血管組織），這段光束被稱為信號(hào)臂，另一束到參照反光鏡，成為誒參考臂。然后把從組織（信號(hào)臂）和從反光鏡（參考臂）反射回來(lái)的兩束光信號(hào)疊加。但信號(hào)臂和參考臂的長(zhǎng)度一致時(shí)，就會(huì)發(fā)生干涉。從組織中反射回來(lái)的光信號(hào)隨組織的形狀而顯示不同強(qiáng)弱。把它與從反光鏡反射回來(lái)的參考光信號(hào)疊加，光波定點(diǎn)一致時(shí)信號(hào)增強(qiáng)（增加干涉），光波定點(diǎn)方向相反時(shí)信號(hào)減弱（削減干涉）。分類目前OCT分為兩大類：時(shí)域OCT（TD-OCT）和頻域OCT（FD-OCT）。時(shí)域OCT是把在同一時(shí)間從組織中反射回來(lái)的光信號(hào)與參照反光鏡反射回來(lái)的光信號(hào)疊加、干涉，然后成像。頻域OCT的特點(diǎn)是參考臂的參照反光鏡固定不動(dòng)，通過(guò)改變光源光波的頻率來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的干涉。FD-OCT分為兩種：（1）激光掃描OCT（SS-OCT），這種OCT利用波長(zhǎng)可變的激光光源發(fā)射不同波長(zhǎng)的光波；（2）光譜