單分子操作及其應(yīng)用解析課件

1、單分子操作 及其應(yīng)用單分子操作 及其應(yīng)用單分子操作技術(shù)單分子操作與研究應(yīng)用存在的問題與解決途徑單分子操作技術(shù)單分子操作技術(shù) 單分子操作技術(shù)是指應(yīng)用一定的實驗儀器和方法，在單分子水平上對生物大分子的行為（包括構(gòu)象變化、相互作用、相互識別等）進行實時動態(tài)檢測以及在此基礎(chǔ)上的操縱調(diào)控等，是納米技術(shù)和分子生物物理學(xué)的自然延伸和必然趨勢。它包括原子力顯微鏡（AFM）、玻璃微針、光鑷和磁鑷、單分子熒光光譜技術(shù)等。包含兩個基本要素：測力或施力裝置、生物分子的定位裝置操作方式有兩種：接觸式，（如使用玻璃微針或AFM針尖），通過與連在 DNA 上的小球機械接觸（或直接與生物分子接觸）來操縱分子；非接觸式（如通過

2、光場或磁場控制小球間接的操作生物分子），非接觸式操縱方式測力范圍較接觸式小，但精度高，應(yīng)用范圍較廣泛。單分子操作技術(shù) 單分子操作技術(shù)是指應(yīng)用單分子操作技術(shù)特點與經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)相比，單分子操作技術(shù)避免了從大量實驗結(jié)果中取平均的需要，因而可以提供更為詳細的生物信息。是在單分子上進行的高效、直接、簡便的操作單分子操作技術(shù)特點單分子操作技術(shù)原理原子力顯微鏡技術(shù)其目的是為了使非導(dǎo)體也可以采用掃描探針顯微鏡( SPM)進行觀測，其通過探針與被測樣品之間的微弱的相互作用力來獲得物質(zhì)表面的形貌。光鑷技術(shù)利用激光動量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的輻射壓力，從而形成具有梯度力場的光學(xué)陷阱，處在陷阱中的微粒受到梯度力場的作用，就

3、被“鉗住”?？捎糜跍y量生物大分子間微弱的力以及生物大分子的很小位移。磁鑷技術(shù)是把生物分子的一端連接在載玻片上，另一端連上一個超順磁性小球，外加一磁場吸引磁性小球，改變外磁場就可以拉伸或轉(zhuǎn)動順磁小球，從而拉伸或扭轉(zhuǎn)生物分子，小球在其平衡位置附近做布朗運動其位置由光學(xué)顯微鏡記錄單分子操作技術(shù)原理磁鑷技術(shù)是把生物分子的一端連接在載玻片玻璃微針利用商業(yè)拉針儀器可以拉出比原子力顯微鏡微懸臂的彈性系數(shù)更小的微針尖，將針尖進行修飾連接上生物分子（一般是DNA）的一端，另一端連在一個可移動的精密樣品臺上，樣品臺拉伸DNA并使針尖偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)量可以用來計算力單分子光譜技術(shù)是將熒光基團標(biāo)記在生物大分子上，標(biāo)記在生物

4、大分子上的熒光基團發(fā)生各種特性變化，通過光譜分析等就能夠得到有關(guān)分子間相互作用、 酶活性、 反應(yīng)動力學(xué)、 構(gòu)象動力學(xué)、 分子運動自由度以及在化學(xué)和靜電環(huán)境下活性改變的信息。單分子操作及其應(yīng)用解析課件單分子操作技術(shù)的研究應(yīng)用核酸與蛋白質(zhì) DNA拉伸與扭曲 DNA凝聚 核酸解鏈與從新折疊 單分子酶學(xué)單分子操作技術(shù)的研究應(yīng)用核酸與蛋白質(zhì)DNA拉伸核酸單分子操作研究起始于1992 年Smith 等對單個DNA 分子的彈性測量。一段雙鏈DNA 分子的一端連接到玻璃表面上,另一端連接到磁性小球上，DNA 分子連接到不同固體表面是通過生物素-鏈霉抗生物素蛋白、地高辛免疫的特異反應(yīng)來實現(xiàn)的；整個體系的組裝在溶

5、液中完成, 在外加磁力的作用下, DNA 被拉伸, 借助于顯微鏡,就能測量到小球的位移。可以得到在不同鹽濃度緩沖液中的單個 DNA 多聚體( 48502 個堿基對) 的力-延伸曲線,并且在這個實驗中力最大只增加到10 皮牛頓。DNA拉伸當(dāng)大于60pN外加作用力作用于DNA上時，一個意想不到的現(xiàn)象出現(xiàn)了：雙鏈DNA分子發(fā)生了70的過度延伸。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是由于DNA發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)到了一個稱之為sDNA的時相。在Cluzel等的實驗中利用一根光纖作為力傳感器，DNA分子一端連接在光纖上，另外一端連接在小球上，小球通過吸力作用被固定在一個微吸液管上。移動微吸液管，DNA分子就被拉伸，光 纖因

6、此發(fā)生偏移，通過一個位置敏感的光敏二極管檢測傳送的激光束信號來記錄光纖偏移的位置。DNA拉伸當(dāng)大于60pN外加作用力作用于DNA上時，一個意想不到的現(xiàn)象在Smith等的實驗中，兩個小球分別連接到DNA分子的兩端，一個小球由微吸液管控制，另外一個小球由光鑷子控制。光鑷子不僅能“鉗住”小球，也能作為力傳感器，因而能夠測量作用力的大小。移動微吸液管，兩小球之間的距離變大，DNA分子被拉伸，因此得到力延伸曲線。DNA拉伸在Smith等的實驗中，兩個小球分別連接到DNA分子的兩端，原理：雙鏈DNA分子的彈性對分子的螺旋很敏感。利用一個能在連接點處阻止旋轉(zhuǎn)的分子基團(如引人多個生物素和digoxygeni

7、n基團)，旋轉(zhuǎn)DNA分子，DNA分子扭曲，因而能對DNA分子的彈性與扭曲張力之間的關(guān)系進行詳細的研究。在這類實驗中，一般使用在連接點處連接磁性小球，然后用旋轉(zhuǎn)磁鐵誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)。DNA扭曲相應(yīng)的分子構(gòu)造包括三處不同的連接位點( 分別用生物素、digoxygenin 和熒光素修飾) 和一個起旋轉(zhuǎn)作用的單鏈缺口；一個轉(zhuǎn)子小球連接到DNA 分子中央生物素標(biāo)記處；轉(zhuǎn)子小球由流動力( fluid flow) 固定在一個地方,當(dāng)旋轉(zhuǎn)吸液管時,扭轉(zhuǎn)的張力就在DNA 上面部分積聚；撤去流動力, 轉(zhuǎn)子小球轉(zhuǎn)動, 釋放出扭曲張力。轉(zhuǎn)子小球的角速度跟扭矩成正比。能夠測量雙鏈DNA分子的扭轉(zhuǎn)系數(shù)；能測量酶對DNA 作用產(chǎn)生

8、的扭矩。原理：雙鏈DNA分子的彈性對分子的螺旋很敏感。利用一個能在連DNA凝聚DNA凝聚對于親代細胞準(zhǔn)確分裂成兩個子代細胞來說是必須的，因為壓縮狀態(tài)的DNA比處于展?fàn)顟B(tài)的DNA更容易分裂。不同外界因素也能夠誘導(dǎo)DNA凝聚，如多胺(精胺和亞精胺)、三價(或高價)金屬離子、生物大分子熒光染料探針(如吖啶橙)、陽離子聚合物(如聚乙烯乙二醇、PEG)引等。這幾種因素能夠單獨或聯(lián)合作用誘導(dǎo)DNA凝聚。DNA分子與這些因素作用并迅速降溫，從而發(fā)生凝聚，從B型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變到A型結(jié)構(gòu)，凝集成不同形狀。Case等人應(yīng)用單分子操作技術(shù)對DNA凝聚進行了研究。他們研究了原核生物Escherichiaoli沉集素(con

9、densin)蛋白(MukBEF)對DNA的凝聚作用。Strick等后來對真核生物Xenopus laevs沉集素I(condensin I)進行單分子研究。DNA凝聚DNA凝聚對于親代細胞準(zhǔn)確分裂成兩個子代細胞來說是DNA凝聚一段DNA 一端通過生物素鏈霉抗生物素蛋白連接到小球上，小球由光鑷子控制。DNA 分子在含有MukBEF和ATP的緩沖液中溫浴。另外一端通過digoxygen inant idigoxygenin反應(yīng)特異地連接到另一個小球上，小球由微吸液管控制。以恒定速度移動微吸液管,就得到了力-延伸曲線實驗結(jié)果表明力-延伸曲線的增長比裸DNA 提前了,并且當(dāng)力增加到17pN 時,在曲

10、線上出現(xiàn)了一個鋸齒樣的圖形。當(dāng)同一個DNA 被多次拉伸時, 能重復(fù)觀測到鋸齒樣的圖形。最令人驚奇的是DNA 凝聚能在ATP 非水解類似物存在的情況下發(fā)生, 說明并非是ATP水解提供DNA 凝聚的能源,而是核苷結(jié)合提供能源。DNA凝聚一段DNA 一端通過生物素鏈霉抗生物素蛋白連接核酸解鏈與從新折疊在核酸解鏈與重新折疊的實驗中,依賴堿基順序的力信號開始是通過玻璃微針來測量的，后來是用光鑷子、原子力和磁性小球。依賴堿基順序的力信號在近來關(guān)于 RNA 打開的實驗中也觀測到了。核酸解鏈與從新折疊在核酸解鏈與重新折疊的實驗中,依賴堿基順序核酸解鏈與從新折疊相比之前的采用最佳的分子固定連接法和光鑷技術(shù)，使D

11、NA 硬度增加的同時，堿基對的敏感性也明顯增加，并且在力-移動曲線中能夠測量10個堿基對范圍內(nèi)的序列特征。另外，解螺旋力在堿基順序不同的位置表現(xiàn)出特征性的跳躍，這些數(shù)值的跳躍直接反應(yīng)出不同狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。核酸解鏈與從新折疊相比之前的采用最佳的分子固定連接法和光鑷技單分子酶學(xué)酶結(jié)合到雙鏈 DNA 上可以短暫地阻止DNA 雙鏈開口叉移動。一旦開口叉移動到結(jié)合蛋白的位置，力將會增加直到積聚到足夠的彈性能量移去蛋白； 因此，蛋白誘導(dǎo)的序列依賴的力信號峰的出現(xiàn)就給出了酶結(jié)合到DNA 上的位置,而峰值就提供了蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物穩(wěn)定性的相關(guān)信息。 Bockelmann 等研究了DNA 和EcoRV 限制

12、性內(nèi)切酶之間的相互作用；Koch 等不僅測量蛋白誘導(dǎo)的力信號峰隨不同速度的變，而且還比較不同蛋白質(zhì)DNA 復(fù)合物的穩(wěn)定性單分子酶學(xué)酶結(jié)合到雙鏈 DNA 上可以短暫地阻止DNA 雙鏈單分子酶學(xué)Charvin 等用Drosophila melanog aster 拓撲異構(gòu)酶和 E. coli 拓撲異構(gòu)酶作用于DNA 分子, 雙鏈DNA 分子解開了連鎖狀態(tài)，應(yīng)用單分子操作技術(shù)能夠及時地跟蹤這個過程。發(fā)現(xiàn)Drosophila melanog aster 拓撲異構(gòu)酶能以相同的速率松弛左手螺旋和右手螺旋, 而 E .coli 拓撲異構(gòu)酶則明顯偏向于松弛左手螺旋。但是, 當(dāng)DNA 形成左手同向螺旋時, E

13、. coli 拓撲異構(gòu)酶也能有效地解開右手螺旋。這對于理解在復(fù)制過程中DNA 雙鏈解連鎖很有幫助。單分子酶學(xué)Charvin 等用Drosophila melaPerkins等對-核酸外切酶消化單個DNA 分子進行了研究；附著在固體表面的酶與DNA 分子相連接，DNA 分子的另外一端連接到聚苯乙烯小球上；酶與小球之間維持一個恒定的作用力, 它們之間的距離通過光鑷子來測量。消化以近乎恒定的速率( 12 核苷酸/秒)進行，在消化過程中可以觀測到不同持續(xù)時間的停頓,長停頓是鏈和序列特異性的haevi tz 等對 E. coli 聚合酶停頓的序列依賴性及其 “校正”機制進行了研究，最近,轉(zhuǎn)錄過程的單分子

14、研究轉(zhuǎn)移到了T7RNA 聚合酶上,這是一個用于在體外合成RNA 的單亞基酶。Perkins等對-核酸外切酶消化單個DNA 分子進行了研蛋白質(zhì)的AFM研究 蛋白單分子外形的 AFM研究： 旋轉(zhuǎn)分子馬達 、質(zhì)子泵和離子泵 、光合作用相關(guān)蛋白、蛋白分子伴侶 蛋白的結(jié)構(gòu)細節(jié)的 AFM研究： 抗體標(biāo)記或酶消化的鑒定 、多肽環(huán)置換或移除的鑒定、多肽末端移除的鑒定 蛋白表面物理特性的 AFM 研究： 蛋白表面的粘彈性、蛋白靜電特性的測量、 蛋白功能特性的 AFM 研究： 細菌蛋白構(gòu)象變化的研究、蛋白分子伴侶的工作周期研究蛋白質(zhì)的AFM研究 蛋白單分子外形的 AFM研究：存在的問題與解決途徑蛋白單分子的可控性

15、成像與操縱為研究驅(qū)動生物過程中的許多分子間相互作用引入了很多可能。但到目前為止,利用 AFM研究的蛋白種類還很少,能檢測到的蛋白性質(zhì)的參數(shù)數(shù)量也是十分有限,因而當(dāng)前亟需進行的工作是進一步擴展 AFM 在蛋白研究中的應(yīng)用范圍, 增強儀器應(yīng)用的功能性。由于 AFM 在機械設(shè)計上的限制,單分子高分辨拓撲結(jié)構(gòu)的記錄時間比大多數(shù)生物過程發(fā)生的時間相比長得多, 提高掃描速度是對掃描器的設(shè)計工藝乃至材料科學(xué)的發(fā)展提出了巨大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有 AFM 探針設(shè)計的設(shè)計具有明顯的物理局限性,由于 AFM 分辨率和功能與探針性能的密切相關(guān)性,因而探針的脂膏工藝的提高也是亟待解決的關(guān)鍵問題存在的問題與解決途徑解決途徑 受材料和制造工藝的水平的限制,將突破點更多地寄托于引入新的設(shè)計思想和測量理念,多種高新儀器與技術(shù)的聯(lián)用可能是解