肝移植相關基礎研究進展(共61張)課件

1、肝移植相關基礎研究進展(共61張)課件肝移植相關基礎研究進展(共61張)課件第一部分全肝移植第2頁，共61頁。第一部分全肝移植第2頁，共61頁。1963年，Starzl 完成人類首例同種異體肝移植1983年，美國NIH確定肝移植為終末期肝病的有效治療手段全球每年10000余例，累計完成16萬例左右肝移植歷史和現(xiàn)狀第3頁，共61頁。1963年，Starzl 完成人類首例同種異體肝移植肝移植歷我國現(xiàn)狀我國的肝移植起步于1977 年，由于供體缺乏、預后不佳等多種原因，停滯了較長一段時間。近幾年，肝移植出現(xiàn)了全國性的大發(fā)展。中國每年約1500例，迄今總例數(shù)約10000-15000例。第4頁，共61頁。

2、我國現(xiàn)狀我國的肝移植起步于1977 年，由于供體缺乏、預后不面臨問題 移植肝損傷 免疫排斥反應肝癌或肝炎肝移植后疾病復發(fā)供體缺乏第5頁，共61頁。面臨問題 移植肝損傷第5頁，共61頁。肝移植物損傷機制炎癥損傷 移植物失功能 氧化應激微循環(huán)缺血預處理缺血再灌注損傷保存液開發(fā)縮短冷熱缺血時間移植前移植中移植后抗氧化免疫抑制肝功能維持免疫排斥 保存損傷抑制炎癥改善微循環(huán)第6頁，共61頁。肝移植物損傷機制炎癥損傷 移植物失功能 氧化應激微循環(huán)缺血預根據(jù)小移植肝損傷機制，探索符合臨床實踐的小移植肝保護措施，是這一領域研究重點腺病毒載體介導的CTLA4Ig表達對大鼠肝移植免疫的抑制1、早期通過HGF的作用

3、，促進肝再生，提高生存率；組織不會生成腫瘤樣組織；SCs細胞還可以作為基因治療的受體細胞將治療基因帶 到肝內(nèi)。吻合肝動脈大鼠小移植肝模型Hepatic FailureA2A受體激活可降低小移植肝細胞凋亡，維持肝臟組織正常結(jié)構(gòu),可改善受體生存率小肝綜合征：術(shù)后持續(xù)性膽汁淤積， 凝血機制紊亂，門靜脈高壓，大量腹水，肝功能恢復延遲小移植肝基礎研究的目標集中于日本、香港、美國、韓國、中國南京等少數(shù)中心研究內(nèi)容之四：表達肝細胞生長因子的骨髓間充質(zhì)干細胞保護大鼠小肝移植物的研究保存液的自主開發(fā) ZW液對大鼠移植肝缺血再灌注的保護及器官冷保存的應用研究 采用的ZW液含有植物藥物，如川芎嗪、山莨菪堿、丹參、苦

4、參堿、苦黃等。 上述藥物將都具有抗炎抗氧化保肝的作用，它們均作為藥物的單體成分，其化學結(jié)構(gòu)、藥代、藥效和藥理作用機制明確，副作用很小，并已制備出多種劑型供臨床選用 。第7頁，共61頁。根據(jù)小移植肝損傷機制，探索符合臨床實踐的小移植肝保護措施，是個體差異。常用的免疫抑制劑都是供體抗原非特異性的。 抑制肝癌、肝炎肝移植后疾病復發(fā) 誘導供體抗原特異性的免疫耐受免疫抑制劑的應用第8頁，共61頁。個體差異。免疫抑制劑的應用第8頁，共61頁。 HBV infectionChronic HBV CirrhosisHepatic FailureLiver CancerLiver TransplantCandi

5、dates20% 20%20%-50%HBV: Disease ProgressionTime: 20-30 years肝移植術(shù)后腫瘤、乙肝復發(fā)第9頁，共61頁。 HBV infectionChronic HBV Cirr肝移植術(shù)后腫瘤、乙肝復發(fā) 肝移植病毒學肝癌研究免疫抑制劑的應用，是否誘導腫瘤與病毒復發(fā)第10頁，共61頁。肝移植術(shù)后腫瘤、乙肝復發(fā) 肝移植病毒學肝癌研究免疫抑制劑誘導特異性的免疫耐受轉(zhuǎn)座元介導的人IL-10基因抗大鼠肝移植排斥反應轉(zhuǎn)FasL基因的樹突狀細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受 腺病毒載體介導的CTLA4Ig表達對大鼠肝移植免疫的抑制導入MHC基因的自體骨髓細胞輸注誘導豬肝移

6、植免疫耐受 雷公騰多甙對大鼠肝移植急性排斥反應的影響 第11頁，共61頁。誘導特異性的免疫耐受第11頁，共61頁。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞抗大鼠肝移植急性排斥反應 Adoptive transfusion of donor alloantigen activated CD4+CD25+ regulatory T cell in the rejection of DA-LEW liver transplantation. Surgery 建立DA-LEW大鼠急排模型CD4+CD25+Treg分離、激活Foxp3基因CD4+CD25+Treg功能研究CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞體外擴增觀察

7、排斥指標第12頁，共61頁。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞抗大鼠肝移植急性排斥反應 拓展供肝來源 老年供肝、脂肪肝供肝等邊緣性供肝 活體供肝 第13頁，共61頁。拓展供肝來源 老年供肝、脂肪肝供肝等邊緣性供肝第13頁，第二部分活體肝移植第14頁，共61頁。第二部分活體肝移植第14頁，共61頁。美 國每年尸體供肝約4000例實際等待供肝者超過20000例供肝嚴重短缺！拓寬供肝來源，大勢所趨！平均等待時間超過600天，等待期死亡率20%-25%中國每年需要肝移植的終末期肝病超過10萬例中國每年實際肝移植病例數(shù)不足2000例中 國第15頁，共61頁。美 國每年尸體供肝約4000例實際等待供肝者超過2

8、000減體積肝移植劈離式肝移植活體肝移植 （Living Donor Liver Transplantation, LDLT)上述術(shù)式肝移植的供肝都是小移植肝！解決全球性供肝來源匱乏有效途徑第16頁，共61頁。減體積肝移植解決全球性供肝來源匱乏有效途徑第16頁，共61頁廣義上說，活體移植肝體積遠低于正常肝臟，在理論上，LDLT的移植物都是小移植肝最常用評價方法： 移植物與受者體重比（GRWR）； 供肝體積（GV）和標準肝體積（SLV）之比 （GV/SLV）目前，學術(shù)界認為 臨床上，小移植肝是指GRWR0.8%的移植物； 動物實驗中，小移植肝是指GV/SLV小于50的移植肝什么是小移植肝？第17

9、頁，共61頁。廣義上說，活體移植肝體積遠低于正常肝臟，在理論上，LDLT的中國活體肝移植工作的開始1995年1月，本組（南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝臟移植中心）完成國內(nèi)首例活體肝移植。第18頁，共61頁。中國活體肝移植工作的開始1995年1月，本組（南京醫(yī)科大學第LDLT目前存在的問題外科技術(shù)移植物體積過小再生特點免疫學特點HCC受者腫瘤復發(fā)乙肝復發(fā)成人活體肝移植應用日趨廣泛，全球已報道供肝者死亡達14例，供者面臨更大風險，供肝體積受到更嚴格限制小移植肝綜合癥已成為影響活體肝移植術(shù)后受體預后的關鍵原因 小肝綜合征：術(shù)后持續(xù)性膽汁淤積， 凝血機制紊亂，門靜脈高壓，大量腹水，肝功能恢復延遲第19頁，

10、共61頁。LDLT目前存在的問題外科技術(shù)小肝綜合征：術(shù)后持續(xù)性膽汁淤積小移植肝基礎研究的目標是：最大限度保障供肝者安全，獲取供肝者最小量供肝，并同時滿足受者生理需要（即獲取最小有效供肝量）小移植肝基礎研究的目標第20頁，共61頁。小移植肝基礎研究的目標是：最大限度保障供肝者安全，獲取供肝者20世紀90年代中期（1995年）以后，隨著部分肝移植深入開展，小移植肝損傷機制與保護措施的基礎研究逐漸成為國際器官移植領域的熱點課題小移植肝損傷機制復雜，國際上研究時間短，10余年歷史,文獻少，很多環(huán)節(jié)尚不清楚根據(jù)小移植肝損傷機制，探索符合臨床實踐的小移植肝保護措施，是這一領域研究重點集中于日本、香港、美國

11、、韓國、中國南京等少數(shù)中心2005年4月，國家衛(wèi)生部批準在南京成立衛(wèi)生部活體肝臟移植重點實驗室，重點研究方向是臨床活體肝移植和小移植肝基礎研究 小移植肝基礎研究國內(nèi)外現(xiàn)狀第21頁，共61頁。20世紀90年代中期（1995年）以后，隨著部分肝移植深入開小體積肝移植物損傷機制與再生特點炎癥損傷 功能維持 氧化應激微循環(huán)缺血預處理缺血再灌注損傷保存液開發(fā)移植前移植中移植后抗氧化免疫抑制促進肝再生免疫排斥 保存損傷門脈高灌注肝再生 降低門脈壓力抑制炎癥改善微循環(huán)第22頁，共61頁。小體積肝移植物損傷機制與再生特點炎癥損傷 功能維持 氧化應激主要研究內(nèi)容第23頁，共61頁。主要研究內(nèi)容第23頁，共61頁

12、。研究內(nèi)容之一：小移植肝動物模型的建立和相關研究 建立大鼠小移植肝模型對不同體積小移植肝功能狀況對照研究吻合肝動脈大鼠小移植肝模型第24頁，共61頁。研究內(nèi)容之一：小移植肝動物模型的建立和相關研究 大鼠小移植肝模型建立 注：. 門靜脈左支進入左葉后，在距基部約2-3mm的左葉實質(zhì)內(nèi)分出中葉的左側(cè)半（左中葉）門靜脈支（箭頭）第25頁，共61頁。大鼠小移植肝模型建立 注：. 門靜脈左支進入左葉后，在距基部三種體積肝移植術(shù)后移植物內(nèi)AST 水平變化比較三種體積肝移植術(shù)后移植物內(nèi)IL-6水平變化比較三種體積肝移植術(shù)后2h、24h病理變化比較移植肝體積越小，門靜脈和肝動脈灌注壓力越高,組織損傷越重，對肝

13、功能影響越大注： *P 0.05 vs 全肝組（Whole graft）; P 0.05 vs 50%小肝組（50% size）三種不同體積肝移植手術(shù)后前后門靜脈壓力變化比較第26頁，共61頁。三種體積肝移植術(shù)后移植物內(nèi)AST 水平變化比較三種體積肝移植肝動脈吻合可顯著改善大鼠小移植肝功能，減輕組織學損傷，促進肝再生吻合肝動脈的小移植肝模型更加符合活體肝移植臨床實際，為小移植肝基礎研究提供良好載體第27頁，共61頁。肝動脈吻合可顯著改善大鼠小移植肝功能，減輕組織學損傷，促進肝全肝組30%小肝組50%小肝組CAB術(shù)后24h, Cyclin D1術(shù)后24h, PCNA小移植肝術(shù)后再生強烈，可能與肝

14、再生信號通路的激活有關第28頁，共61頁。全肝組30%小肝組50%小肝組CAB術(shù)后24h, Cycli研究內(nèi)容之二：缺血預處理對大鼠小移植肝再生的影響及相關機制研究 缺血預處理對大鼠不同體積小移植肝術(shù)后肝再生的影響 第29頁，共61頁。研究內(nèi)容之二：缺血預處理對大鼠小移植肝再生的影響及相關機制研 通常認為,缺血預處理對移植物有保護作用。 對于30%小肝移植物，缺血預處理明顯加重損傷，抑制了肝再生機制是降低肝內(nèi)細胞因子水平，抑制細胞周期相關蛋白表達第30頁，共61頁。 通常認為,缺血預處理對移植物有保護作用。 對于30研究內(nèi)容之三：腺苷A2A受體對小移植肝缺血再灌注損傷保護作用及其機制的研究 小

15、移植肝缺血再灌注損傷機制研究A2A受體對小移植肝缺血再灌注后,氧化應激反應作用、炎性反應作用、細胞凋亡作用研究第31頁，共61頁。研究內(nèi)容之三：腺苷A2A受體對小移植肝缺血再灌注損傷保護作用A2A受體激活，可減輕小肝移植術(shù)后氧化應激反應,減少小移植肝內(nèi)炎性因子的表達第32頁，共61頁。A2A受體激活，可減輕小肝移植術(shù)后氧化應激反應,減少小移植肝A2A受體激活可降低小移植肝細胞凋亡，維持肝臟組織正常結(jié)構(gòu),可改善受體生存率第33頁，共61頁。A2A受體激活可降低小移植肝細胞凋亡，維持肝臟組織正常結(jié)構(gòu),減體積肝移植大鼠的生存率低移植早期肝細胞再生能力受損移植后“小移植物綜合征”（SFSS)損傷機理

16、門靜脈高灌注 缺血再灌注損傷移植早期肝細胞的快速再生以及移植后肝功能支持是必須的。 研究內(nèi)容之四：表達肝細胞生長因子的骨髓間充質(zhì)干細胞保護大鼠小肝移植物的研究 立論依據(jù)第34頁，共61頁。減體積肝移植大鼠的生存率低研究內(nèi)容之四：表達肝細胞生長因子的肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor, HGF）HGF具有促有絲分裂和細胞保護作用HGF是最強的促肝細胞再生劑HGF應用廣泛HGF的致命弱點：半衰期小于15min解決方法：轉(zhuǎn)基因第35頁，共61頁。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth fact間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells, MS

17、Cs）MSCs為中胚層發(fā)育的早期細胞，具有多向分化潛能，可分化為肝細胞。骨髓干細胞由于其取材方便，而成為研究的熱點。易于攜帶和表達外源基因。第36頁，共61頁。間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells,體內(nèi)外肝細胞來源的不同途徑第37頁，共61頁。體內(nèi)外肝細胞來源的不同途徑第37頁，共61頁。研究內(nèi)容之四：表達肝細胞生長因子的骨髓間充質(zhì)干細胞保護大鼠小肝移植物的研究 肝再生通路與細胞周期IL-6/STAT3通路CDK2/cyclinDCDK4/cyclinE 炎癥損傷HO-1, ET-1，iNOS, Erg-1，HSP70 有關肝纖維化的一些指標：血清總膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平

18、；肝星形細胞-平滑肌肌動蛋白(-SMA)及其活化程度，檢測肝臟膠原分布的相對含量：肝臟羥脯氨酸、層粘蛋白和透明質(zhì)酸水平測定。第38頁，共61頁。研究內(nèi)容之四：表達肝細胞生長因子的骨髓間充質(zhì)干細胞保護大鼠小構(gòu)建腺病毒載體重組子，體外感染骨髓間充質(zhì)干細胞，獲得穩(wěn)定表達人HGF的HGF/MSCs第39頁，共61頁。構(gòu)建腺病毒載體重組子，體外感染骨髓間充質(zhì)干細胞，獲得穩(wěn)定表達HGF/MSCs移植后，實驗組大鼠肝功能改善，肝再生加快，受體生存率提高BAPSHGF/MSCsBrdUTUNELHE * * * *Ceadbcf第40頁，共61頁。HGF/MSCs移植后，實驗組大鼠肝功能改善，肝再生加快，受G

19、FP+AlbGFPAlbPSHGF/MSCsabdcBAGFP+AlbGFPAlbDAPI轉(zhuǎn)基因間充質(zhì)干細胞改善小移植肝生存率的可能機制1、早期通過HGF的作用，促進肝再生，提高生存率；2、后期通過MSCs與HGF的協(xié)同作用，降低炎性反應，保持肝臟正常結(jié)構(gòu)，預防移植肝纖維化第41頁，共61頁。GFP+AlbGFPAlbPSHGF/MSCsabdcBAG缺血預處理對大鼠不同體積小移植肝術(shù)后肝再生的影響能明顯減弱肝移植后的免疫排斥反應LDLT目前存在的問題研究內(nèi)容之三：腺苷A2A受體對小移植肝缺血再灌注損傷保護作用及其機制的研究Liver CancerSurgery免疫抑制劑的應用，是否誘導腫瘤與

20、病毒復發(fā)肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor, HGF）供肝體積（GV）和標準肝體積（SLV）之比 （GV/SLV）- Learn to find questionsSCs有強大的更新能力和分化潛能, 在肝移植尤其是小體積肝移植時，輸注MSCs，可望通過其歸巢、擴增、定向分化為肝細胞、膽管上皮細胞，促進肝再生，恢復肝功能。三種不同體積肝移植手術(shù)后前后門靜脈壓力變化比較Liver Transplant三種體積肝移植術(shù)后移植物內(nèi)IL-6水平變化比較把IFN-的基因?qū)隨Cs 內(nèi),發(fā)現(xiàn)腫瘤的微環(huán)境容易使SCs植入,進入腫瘤內(nèi)的SCs 通過分泌細胞因子抑制腫瘤生長。小結(jié)1、

21、在國內(nèi)率先建立吻合肝動脈小移植肝模型，提供了較為符合活體肝移植臨床實際的研究載體2、采用選擇性腺苷A2A受體激活劑，具有簡單易操作的特點，顯著減輕小移植肝損傷，為小移植肝保護措施的臨床應用提供了切實可行的途徑第42頁，共61頁。缺血預處理對大鼠不同體積小移植肝術(shù)后肝再生的影響小結(jié)1、在國小結(jié)3、通常認為，缺血預處理具有保護移植物作用。本組在國際上首次提出，當移植肝體積小于30%時，缺血預處理可能會加重移植肝損傷。同時探討基因轉(zhuǎn)導和T調(diào)節(jié)細胞輸注等多途徑干預對小移植肝的影響。4、在國際上首次將轉(zhuǎn)肝細胞生長因子（HGF）基因的骨髓間充質(zhì)干細胞移植應用于小移植肝保護，有效延長了小移植肝生存時間，為干

22、細胞移植在小移植肝保護中的應用提供了新思路第43頁，共61頁。小結(jié)3、通常認為，缺血預處理具有保護移植物作用。本組在國際上成果發(fā)表于Molecular Therapy、 Surgery、 Transpl Int、Transpl Immunol國際著名SCI期刊，與香港、日本、歐美等國際上著名中心同類研究水平相近，達國際領先第44頁，共61頁。成果發(fā)表于Molecular Therapy、 Sur干細胞在肝臟疾病領域的應用自從1999 年和2000 年科學雜志連續(xù)兩年將干細胞的研究評為年度世界十大科學成就以來,關于干細胞及其在臨床上的應用等研究就蓬勃發(fā)展起來。第45頁，共61頁。干細胞在肝臟疾病

23、領域的應用自從1999 年和2000 年科干細胞的定義干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，即這些細胞可以通過細胞分裂維持自身細胞群的大小，同時又可以進一步分化成為各種不同的組織細胞，從而構(gòu)成機體各種復雜的組織器官。 第46頁，共61頁。干細胞的定義干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能干細胞分類干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞(embryonic stem cells ,ESC) 是來源于人或動物胚胎內(nèi)細胞團或原始生殖嵴的一種多能細胞系。胚胎干細胞幾乎可以向所有的成年組織分化。成體干細胞(adult stem cells , ASC) 存在于胎兒

24、和成人各種組織及器官中,來源廣泛, 是一類具有多向分化潛能的細胞群體,有橫向分化(trans-differentiation) 能力。第47頁，共61頁。干細胞分類干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞。第47頁，共6胚胎干細胞和成體干細胞的特點胚胎干細胞 更具有全能性,但涉及倫理問題，存在免疫排斥問 題；胚胎干細胞可能分化為腫瘤樣的組織；在臨床應用中受到取材困難等因素的限制。成體干細胞 不涉及倫理問題；組織不會生成腫瘤樣組織；不存在免疫排斥的問題。成體干細胞在臨床應用方面可能有更廣闊的前景。第48頁，共61頁。胚胎干細胞和成體干細胞的特點胚胎干細胞第48頁，共61頁。干細胞的多向分化潛能通常情況

25、下，干細胞具有確定的分化方向及途徑（縱向分化）。如今發(fā)現(xiàn)，在特定條件下，干細胞根據(jù)其特異的微環(huán)境的不同而發(fā)育成與其自身組織來源不同的組織細胞，稱之為干細胞的轉(zhuǎn)分化/橫向分化。第49頁，共61頁。干細胞的多向分化潛能通常情況下，干細胞具有確定的分化方向及途已被實驗證實的多向分化潛能骨髓細胞骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞；肌肉細胞血液細胞；神經(jīng)干細胞血液細胞、骨骼肌細胞；造血干細胞骨骼肌細胞、心肌細胞、肝實質(zhì)細胞、膽管和多種上皮以及內(nèi)皮細胞；肝卵圓細胞胰腺內(nèi)分泌激素形成細胞。第50頁，共61頁。已被實驗證實的多向分化潛能骨髓細胞骨骼肌細胞、心肌細胞、肝干細胞分化為肝系細胞骨髓細胞

26、是較早被認識的成體干細胞之一,人們早就利用骨髓移植來根治造血系統(tǒng)惡性疾病。目前骨髓是肝系細胞主要的肝外來源的說法已經(jīng)較為肯定。有研究表明，骨髓干細胞在誘導因子的作用下能分化為肝系細胞。第51頁，共61頁。干細胞分化為肝系細胞骨髓細胞是較早被認識的成體干細胞之一,人干細胞在肝臟疾病領域的應用我國是病毒性肝炎、原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū), 目前尚缺乏廣泛可行的有效治療手段, 盡管肝移植可作為治療肝衰竭的有效手段, 但手術(shù)復雜、排斥反應、生存率不高等缺點, 尤其是供體肝缺乏, 使得這一治療措施難以廣泛推廣。第52頁，共61頁。干細胞在肝臟疾病領域的應用我國是病毒性肝炎、原發(fā)性肝癌的高發(fā)干細胞在肝臟疾病領域的應用生物人工肝 如果體外能獲得由SCs分化而來的大量的肝細胞, 用于生物人工肝支持系統(tǒng), 或SCs移植入體內(nèi)，可擴增、分化為肝細胞, 必將為肝衰竭的治療帶來新的曙光。第53頁，共61頁。干細胞在肝臟疾病領域的應用生物人工肝第53頁，共61頁。干細胞在肝臟疾病領域的應用干細胞作為細胞移植的細胞來源較肝細胞具有更大的優(yōu)勢: 其只有約10m 大小,經(jīng)門靜脈注射后更易分散到肝實質(zhì),避免阻塞肝竇發(fā)生門靜脈高壓,且能長期保持生成肝細胞和膽管細胞的能力。第54頁，共61頁。干細胞在肝臟疾病領域的應用干細胞