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1、第三章 酶Enzyme第一節(jié) 酶的概念及特點 一、 酶的概念 生物體內(nèi)的反應(yīng)是在很溫和的條件(如溫和的溫度、接近中性的pH)下進行的,而同樣的反應(yīng)若在非生物條件下進行,則需要高溫、高壓、強酸、強堿等劇烈的條件。 酶的概念酶是由生物細胞產(chǎn)生的以蛋白質(zhì)為主要成分的生物催化劑。 酶催化作用并不局限于活細胞內(nèi),在許多情況下,細胞內(nèi)產(chǎn)生的酶需分泌到細胞外或轉(zhuǎn)移到其它組織器官中發(fā)揮作用,如胰蛋白酶、脂酶、淀粉酶等水解酶。把由細胞內(nèi)產(chǎn)生并在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶稱為胞內(nèi)酶,而將細胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌細胞外起作用的酶叫胞外酶。 一、 酶的概念 在本章節(jié)中把酶所催化的反應(yīng)稱作酶促反應(yīng),發(fā)生化學(xué)反應(yīng)前的物質(zhì)稱底物(subs
2、trate),而反應(yīng)后生成的物質(zhì)稱產(chǎn)物(product)。 一、 酶的概念1. 酶具有共同于一般催化劑的特征用量少;只能催化熱力學(xué)上允許的反應(yīng);不改變反應(yīng)的平衡點,而只能縮短時間。催化機理都是降低反應(yīng)所需的活化能。 二、 酶的特性一般催化劑反應(yīng)活化能反應(yīng)總能量變化酶促反應(yīng)活化能非催化反應(yīng)活化能初 態(tài)終 態(tài)能 量 改 變活 化 過 程酶促反應(yīng)降低活化能過渡態(tài)酶促反應(yīng)的速度比非酶促反應(yīng)通常要快1051017 倍如此高的催化效率使生物體內(nèi)含量甚微的酶能催化大量的物質(zhì)轉(zhuǎn)化。2. 酶不共同于一般催化劑的特征 催化效率極高二、 酶的特性用簡單的實驗證明酶的催化效率:鐵屑 肝糜 肝糜(煮) 2 H2O2 2
3、 H2O + O21000109二、 酶的特性2. 酶不共同于一般催化劑的特征 鉑:催化許多反應(yīng),包括有機反應(yīng)H+:淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、蔗糖等酶:只作用于結(jié)構(gòu)近似的分子,甚至 只催化一種化合物。 專一性很強 二、 酶的特性2. 酶不共同于一般催化劑的特征 酶對環(huán)境條件極為敏感 酶活性可以調(diào)控 二、 酶的特性 酶催化的專一性(specificity):是指酶對它所催化的反應(yīng)及其底物具有的嚴(yán)格的選擇性。通常一種酶只能催化一種或一類化學(xué)反應(yīng)。1. 絕對專業(yè)性除一種底物外,酶都不能催化其它反應(yīng)的特性 三、酶的專一性及其類型 2 相對專一性酶能催化在結(jié)構(gòu)上類似的一系列化合物反應(yīng)特怔。A 基團專一性(gr
4、oup specificity)在催化A-B化合物中,酶對其中的一個基團具有高度甚至是絕對專一性,而對另一個基團則具有相對專一性的特性。 三、酶的專一性及其類型 2 相對專一性酶能催化在結(jié)構(gòu)上類似的一系列化合物反應(yīng)特怔。B 鍵專一性(bond specificity)在催化A-B化合物中,酶對A,B基團的結(jié)構(gòu)要求不嚴(yán),而要求有一定的化學(xué)鍵便能進行催化反應(yīng)特性。 三、酶的專一性及其類型 C 立體專一性(stereo specificity)一種酶只能對一種立體異構(gòu)體起催化作用,對其對映體則全無作用的特性。a.立體異構(gòu)專一性: 三、酶的專一性及其類型 C 立體專一性(stereo specific
5、ity)一種酶只能對一種立體異構(gòu)體起催化作用,對其對映體則全無作用的特性。B.幾何異構(gòu)專一性 : 三、酶的專一性及其類型 Summry絕對專一性一種酶只能催化一種底物。如6-磷酸葡萄糖磷酸酯酶。立體專一性一種酶只能對一種立體異構(gòu)體起催化作用。相對專一性鍵專一性一種酶只作用于一定的化學(xué)鍵,對鍵兩側(cè)的基團無要求。如酯酶。基團專一性不僅要求底物具有一定的化學(xué)鍵,還對鍵某一側(cè)的基團有選擇性。如磷酸單酯酶。 三、酶的專一性及其類型 迄今為止所發(fā)現(xiàn)的4000多種酶中,現(xiàn)已有2500余種酶被鑒定出來,用于生產(chǎn)實踐的酶有近200種,其中半數(shù)用于臨床。 1. 習(xí)慣命名法 1961年以前,人們根據(jù)酶作用的底物名稱
6、、反應(yīng)、性質(zhì)及酶來源,對該酶冠名。 四、酶的命名 如 己糖激酶、蛋白酶、脲酶 底物名 + “酶” 1. 習(xí)慣命名法如 己糖激酶、乳酸脫氫酶、DNA聚合酶 反應(yīng)類型 + “酶” 1. 習(xí)慣命名法如 胃蛋白酶 酶的來源 1. 習(xí)慣命名法 這種命名法缺乏科學(xué)系統(tǒng)性,易產(chǎn)生“一酶多名”或“一名多酶”問題。如分解淀粉的酶,若按這種命名法則有三種名稱,如淀粉酶、淀粉水解酶和細菌淀粉酶。 對于淀粉酶來說,強調(diào)的是底物;對淀粉水解酶來說,既強調(diào)底物又指出酶催化反應(yīng)的性質(zhì);而細菌淀粉酶強調(diào)的是酶的來源和作用的對象。 問題 1. 習(xí)慣命名法 該命名法規(guī)定,每種酶的名稱應(yīng)明確標(biāo)明底物及所催化反應(yīng)的特征,即酶的名稱應(yīng)
7、包含兩部分:前面為底物,后面為所催化反應(yīng)的名稱。 2. 國際系統(tǒng)命名法 若前面底物有兩個,則兩個底物都寫上,并在兩個底物之間用“:”分開,若底物之一是水,則可略去。 2. 國際系統(tǒng)命名法 酶的國際習(xí)慣用名和系統(tǒng)命名的應(yīng)用實例 國際酶學(xué)委員會規(guī)定,每個酶都有唯一的特定標(biāo)碼,其書寫方式是:EC 數(shù)字.數(shù)字.數(shù)字.數(shù)字酶的分類序號亞類亞亞類順序號 2. 國際系統(tǒng)命名法乙醇脫氫酶的編碼是: EC1.1.1.1 第一個“1” 第1大類,即氧化還原酶類; 第二個“1” 第1亞類,供氫體為CHOH; 第三個“1” 第1亞亞類,受氫體為NAD+; 第四個“1” 在亞亞類中的順序號。乳酸脫氫酶的編碼是: EC1
8、.1.1.27 2. 國際系統(tǒng)命名法 國際系統(tǒng)命名法看起來科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn),但使用起來不太方便. 2. 國際系統(tǒng)命名法國際酶學(xué)委員會建議:每個酶都給予 2 個名稱習(xí)慣名系統(tǒng)名五. 酶的分類 國際酶學(xué)委員會(Enzyme Commission, EC)將所有的酶按它們所催化的反應(yīng)的性質(zhì)分為六大類。酯酶、蛋白酶、淀粉酶水解酶類(hydrolase) 3谷丙轉(zhuǎn)氨酶、已糖激酶轉(zhuǎn)移酶類(transferase)2脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶、加氧酶氧化還原酶類(oxidoreductase)1舉 例催化反應(yīng)的性質(zhì)酶的類型分類序號AH2+BA+BH2AR+BA+BRAB+H2OAOH+BH五. 酶的分類 國際酶學(xué)
9、委員會(Enzyme Commission, EC)將所有的酶按它們所催化的反應(yīng)的性質(zhì)分為六大類。羧化酶、氨酰-tRNA合成酶、天冬酰胺合成酶合成酶類(連接酶類)(ligase)6差向異構(gòu)酶、順反異構(gòu)酶、酮醛異構(gòu)酶異構(gòu)酶類(isomerase) 5醛縮酶、水合酶、脫氨酶、脫羧酶裂解酶類(lyase) 4舉 例催化反應(yīng)的性質(zhì)酶的類型分類序號ABXYA BXYAAABABATPADPPi氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng),催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如,乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1、氧化-還原酶 Oxidored
10、uctaseAH2 + B(O2)A + BH2(H2O2,H2O)(1)脫氫酶類:催化直接從底物上脫氫的反應(yīng)AH2 +BA +BH2(需輔酶或輔酶)(2)氧化酶類催化底物脫氫,氧化生成H2O2:AH2 + O2A + H2O2(需FAD或FMN)催化底物脫氫,氧化生成H2O:2AH2 + O22A + 2H2O(3)過氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2(4)加氧酶(雙加氧酶和單加氧酶)O2 +OHOHC=OC=OOHOH(順,順-已二烯二酸)RH + O2 + 還原型輔助因子ROH + H2O + 氧化型輔助因子(又稱羥化酶)轉(zhuǎn)移酶催化基團轉(zhuǎn)移反應(yīng),即將一個底物分子的基團
11、或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。根據(jù)X分類:轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、?;?、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如, 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2、轉(zhuǎn)移酶 TransferaseAX + BA +BX水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如,脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng):3、水解酶 hydrolaseAB + H2OAOH + BH裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如, 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。4、裂解酶 Lyase異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化,即底物分子內(nèi)基團或原子
12、的重排過程。例如,6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)5、異構(gòu)酶 IsomeraseAB合成酶,又稱為連接酶,能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。例如,丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6、合成酶 Ligase or SynthetaseA + B + ATPAB + ADP +Pi六.酶的分離與提取 酶提取基本的方法由細胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶,稱為細胞外酶。這類酶大部分屬于水解酶。在細胞內(nèi)合成后并不分泌到細胞外,而在細胞內(nèi)起催化作用,稱為細胞內(nèi)酶,該類酶在細胞內(nèi)往往與細胞器結(jié)合,不僅有一定的區(qū)域性,而且催化的
13、反應(yīng)具有一定順序性。A. 了解所分離酶在細胞中分布 B. 材料的獲取 在提取某一酶時,首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要,選擇含此酶最豐富的材料。由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑受到原料限制,成本又很大,因此,目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。六.酶的分離與提取C. 酶分離純化的主要步驟1.主要步驟為:抽提、純化、結(jié)晶 抽提:破碎細胞,動植物組織一般可用組織搗碎器;或者加石英砂研磨,將材料做成丙酮粉或進行冰凍融解 ;對細菌,常采用加砂或加氧化鋁研磨和超聲波振蕩方法破碎。 大多數(shù)酶一般都用緩沖液進行抽提,緩沖液的類型決定于酶的種類和理化特性,抽提液pH最好遠離等電點 。 六.酶的分離與提取
14、C. 酶分離純化的主要步驟1.主要步驟:抽提、純化、結(jié)晶 濃縮:抽提液或發(fā)酵液中酶濃度往往很低,必須濃縮富集。常用的濃縮方法有:加中性鹽或冷乙醇沉淀后再溶解,膠過濾濃縮以及超過濾濃縮法等。純化:純化過程就是去除雜質(zhì)的過程。原則:一方面是要提高酶的純度,另一方面卻也使酶的總量不可避免有所損失。 六.酶的分離與提取C. 酶分離純化的主要步驟1. 主要步驟為:抽提、純化、結(jié)晶 結(jié)晶:濃縮液經(jīng)過各種方法的純化,可得到較純的結(jié)晶產(chǎn)品。 六.酶的分離與提取C. 酶分離純化的主要步驟2. 選擇分離純化方法a.鹽析法(如硫酸胺) b.有機溶劑沉淀法 c.層析純化法(葡聚糖凝膠、離子交換層析) d.等電點法 e
15、.吸附分離法 六.酶的分離與提取酶活力:是酶促反應(yīng)的能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化的某一化學(xué)反應(yīng)速度的快慢,即酶催化的反應(yīng)速度越快,酶活力越高,反之則表示該酶活力低。 七.酶活力及其測定 酶的定量并非對其蛋白質(zhì)進行定量,而是對它的催化能力進行定量。所以,酶的定量就是測定酶的活力,也即測定酶促反應(yīng)的速度。1. 酶活力概念 七.酶活力及其測定 如何測定酶活力?以產(chǎn)物濃度對反應(yīng)時間作圖,可得到酶促反應(yīng)速度曲線0產(chǎn)物濃度時間注意:初速度的測定是關(guān)鍵,為什么?七.酶活力及其測定 可見,反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定,隨著時間的延長,反應(yīng)速度逐漸下降產(chǎn)物濃度時間0原 因底物濃度的降低、產(chǎn)物的增
16、加造成的逆反應(yīng)的加快產(chǎn)物的抑制作用酶本身逐漸失活七.酶活力及其測定 常用的酶活力單位有三種: A. 國際單位 (IU)這種單位是由國際酶學(xué)委員會規(guī)定的。 在標(biāo)準(zhǔn)條件(25、最適pH、最適底物濃度)下,酶每分鐘催化 1 mmol 底物轉(zhuǎn)化,這樣的速度所代表的酶的活力即酶的量定義為1個國際單位 (IU)。 2. 酶活力與單位 七.酶活力及其測定 B. Katal是由國際酶學(xué)委員會于1972年規(guī)定的一種新單位在最適條件下,酶每秒鐘催化1 mol 底物轉(zhuǎn)化,這樣的速度所代表的酶的活力即酶的量定義為 1個Kat 。 1 Kat = 60106 IU2. 酶活力與單位 七.酶活力及其測定 C. 自定義的活
17、力單位這種單位簡單方便,省去了許多計算;但只能進行酶活力的相對比較。 酶習(xí)慣上或測定時使用的反應(yīng)速度的單位定義為酶的活力單位。有的甚至直接用測得的物理量,如單位時間內(nèi)消光值的變化 (DA/t) 表示酶活力單位。七.酶活力及其測定 指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)比活力是酶制劑純度的常用指標(biāo) 比活力越大,表示酶越純比活力 酶活力單位數(shù)(U)酶蛋白質(zhì)量(mg)3. 酶的比活力 七.酶活力及其測定 純化倍數(shù) = 后續(xù)每次比活力/第一次比活力產(chǎn)率(回收率) =后續(xù)每次總活力/第一次總活力100% 4. 酶的純度 七.酶活力及其測定 1. 某酶在一定條件下,5 min內(nèi)使30 mmol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物,問
18、該酶的活力(IU)是多少?2. 從某細胞中提取的一種蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白質(zhì),總活力為360單位。經(jīng)過一系列純化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白),總活力為288單位。請問回收率是多少?4. 酶的純度 七.酶活力及其測定 不同樣品同一酸制劑的總活力、總蛋白、比活力比較 4. 酶的純度 純化進程甲乙丙丁總活力6432總蛋白(mg)201052比活力(U/mg)6/204/103/52/2七.酶活力及其測定 八、酶與疾病的發(fā)生: 酶的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、位置及其調(diào)節(jié)改變 酶缺乏或異常引起的疾病 酶 疾 病苯丙氨酸羥化酶 苯丙酮酸尿癥6-磷酸葡萄糖脫氫酶 蠶豆病酪氨酸酶
19、白化病細胞色素氧化酶 氰化物中毒膽堿酯酶 有機磷中毒蛋白酶 炎癥酶與疾病的診斷:血清酶活性測定 臨床診斷部分常用酶 酶 主要臨床應(yīng)用谷丙轉(zhuǎn)氨酶 肝實質(zhì)疾患谷草轉(zhuǎn)氨酶 心肌梗塞、肝實質(zhì)疾患膽堿酯酶 有機磷中毒乳酸脫氫酶 心肌疾患、肝實質(zhì)疾患淀粉酶 胰腺疾病堿性磷酸酶 骨病、肝膽疾患胰蛋白酶(原) 胰腺疾病肌酸激酶 心肌梗塞、肌肉疾患醛縮酶 肌肉疾病 酸性磷酸酶 前列腺癌、骨病谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 肝實質(zhì)病變、酒精中毒5核苷酸酶 肝膽疾患山梨醇脫氫酶 肝實質(zhì)病變第二節(jié) 酶動力學(xué)及影響酶反應(yīng)速度的因素一.底物濃度的影響(一) 酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線一.底物濃度的影響對于簡單的酶反應(yīng),當(dāng)酶濃度和其他條
20、件恒定時:vS0Vmax零級反應(yīng)一級反應(yīng)混合級反應(yīng) 該曲線可以用米氏方程 來描述一.底物濃度的影響一.底物濃度的影響 dp/dtkES:一級反應(yīng):反應(yīng)速度只與反應(yīng)物濃度的一次方成正比的反應(yīng)。dp/dtkE:零級反應(yīng)(二) 米氏方程 為了要解釋這一現(xiàn)象,Michaelis & Menten 提出了中間絡(luò)合物學(xué)說。 1. 米氏方程的推導(dǎo)該學(xué)說必須兩個條件: (1)符合質(zhì)量作用定律:化學(xué)反應(yīng)速率與反應(yīng)物的有效質(zhì)量成正比(2)形成的中間產(chǎn)物決定整個反應(yīng)的速度一.底物濃度的影響 Michaelis & Menten 提出了中間絡(luò)合物學(xué)說。 (二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響 對于單
21、底物、單產(chǎn)物反應(yīng),其反應(yīng)過程需經(jīng)過中間復(fù)合物ES,即 ESK1K3ESK2K4EPMichaelis-Menten的三個假設(shè): (1)推導(dǎo)的v為反應(yīng)初速度(二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響 產(chǎn)物的生成量很少 k4 的反應(yīng)忽略不計。即(二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響E酶總量;Et反應(yīng)后t時的酶量;ES中間產(chǎn)物濃度Et E-ES(二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響剛反應(yīng)時,若形成的速度為v,則v1k1 EtS k1(E)-(ES)S (1)ES消失速度:v2 k2ES; v3 k3ESv23 k2 ES k3ES (k2 k3)ES
22、 (2) (二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響Michaelis-Menten的三個假設(shè): (2)反應(yīng)體系處于穩(wěn)態(tài) (二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響即ES不變 ES的生成量 = ES的分解量。即v1 =v23k1(E)-(ES)S = ES (k2 k3)(E)-(ES)S/ ES = (k2 k3)/ k1 (3)設(shè) Km=(k2+k3)/k1 將(3)重排得ES =ES/(Km S) (4)(二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響Michaelis-Menten 的三個假設(shè): E =ES,Vmax = K3ES,即K3 = Vma
23、x/ E (5)同時,v = K3ES, K3 = vt/ ES (6)(5) + (6)ES =vt E /Vmax (7)(7)代入(4)得 vt E /V = ES/(Km S)(3)S E(二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響V =Vmax S Km + S (二) 米氏方程 1. 米氏方程的推導(dǎo)一.底物濃度的影響Km 米氏常數(shù) 由于 Km= (k2+k3)/k1 , 為復(fù)合常數(shù)。 Km是酶的特征常數(shù),經(jīng)常表示酶與底物的親和力。 Km值越大,親和力越小。 (二) 米氏方程 1. 米氏方程中常數(shù)的意義一.底物濃度的影響 Km的值是當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度的一半時所對應(yīng)的
24、底物濃度。 所以Km的單位為濃度單位 Km = S (二) 米氏方程 1. 米氏方程中常數(shù)的意義一.底物濃度的影響(二) 米氏方程 1. 米氏方程中常數(shù)的意義一.底物濃度的影響V =Vmax S Km + S 所以采用雙倒數(shù)作圖法:即 1/v - 1/S 作圖 v-S作圖法: Vmax難以測定,不能從vV/2處求得,從而導(dǎo)致Km也難確定。(二) 米氏方程 3. 米氏方程中常數(shù)的測定一.底物濃度的影響V =Vmax S Km + S (二) 米氏方程 3. 米氏方程中常數(shù)的測定一.底物濃度的影響二.酶濃度對酶反應(yīng)速度的影響 在一般的酶促反應(yīng)中,常常SE,酶反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度。 當(dāng)SE,由于
25、Vmax=kE0,反應(yīng)速度與酶濃度成正比。 酶濃度曲線三. pH對酶反應(yīng)速度的影響 pH對酶反應(yīng)速度的影響較大。其原因有: 極端pH的條件引起酶蛋白的變性。pH影響底物的解離,從而影響酶與底物的結(jié)合。 pH影響酶分子解離狀態(tài)。 每種酶只能在一定的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出它的活性,且在某一pH值范圍內(nèi)活性最高,其兩側(cè)活性都下降。 酶促反應(yīng)具有一最適pH。反應(yīng)速度和pH的關(guān)系見下圖: 酶的最適pH一般在7左右。也有很多例外,如胃蛋白酶的最適pH只有1.5,木瓜蛋白酶(5.6) ,胰蛋白酶(7.8)。 酶的最適pH并非酶的特征性常數(shù),它與底物的種類、濃度等因素有關(guān)。三. pH對酶反應(yīng)速度的影響 溫度對酶反應(yīng)
26、速度的影響具有雙重性:隨著溫度的升高,酶蛋白會失活,使反應(yīng)速度下降 隨著溫度的升高,反應(yīng)速度會加快四. 溫度對酶反應(yīng)速度的影響 因此,在這雙重因素的綜合作用下,酶促反應(yīng)具有一最適溫度。四. 溫度對酶反應(yīng)速度的影響 不同酶的最適溫度也不一樣。動物酶的最適溫度一般在3540,植物酶為4050。 酶的最適溫度并非酶的特征性常數(shù),它與底物、作用時間等因素有關(guān)。五. 激活劑對酶反應(yīng)速度的影響激活劑:能提高酶活性的物質(zhì)。無機離子: 主要是金屬離子,它們有的本身就是酶的輔助因子,有的是酶的輔助因子的必要成分。 如: 激酶需要Mg2+激活 唾液淀粉酶需要Cl-激活主要的激活劑有:五. 激活劑對酶反應(yīng)速度的影響
27、有機小分子: 一些還原劑,如抗壞血酸、半胱氨酸,使含-SH的酶處于還原態(tài) 金屬螯合劑,如EDTA(乙二胺四乙酸),可絡(luò)合一些重金屬雜質(zhì),解除它們對酶的抑制,從而使酶活升高。抑制作用:有些物質(zhì)與酶結(jié)合后,引起酶的活性中心或必需基團的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,從而使酶活力降低或喪失。六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響引起抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑抑制作用可分為兩大類:可逆抑制作用和不可逆抑制作用 六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響 可逆抑制作用可分為三種類型: 1. 競爭性抑制作用 2. 非競爭性抑制作用 3. 反競爭性抑制作用 酶與抑制劑非共價地可逆結(jié)合,當(dāng)用透析或超濾等方法除去抑制劑后酶的活性可以恢復(fù),這種抑制
28、作用叫可逆抑制作用。(一)可逆抑制作用六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響 某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似,與底物競爭酶的活性中心并與之結(jié)合,從而減少了酶與底物的結(jié)合,因而降低酶反應(yīng)速度。這種作用稱為競爭性抑制作用。(一)可逆抑制作用1. 競爭性抑制作用六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響(一)可逆抑制作用1. 競爭性抑制作用六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響例如,丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。 這種抑制作用可通過增加底物濃度而使整個反應(yīng)平衡向生成產(chǎn)物的方向移動,因而能削弱或解除這種抑制作用。(一)可逆抑制作用1. 競爭性抑制作用六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響琥珀酸延胡索酸丙二酸六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度
29、的影響 ESESEPEI六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響 競爭性抑制中,Vmax不變,Km增大可通過增加底物濃度而使整個反應(yīng)平衡向生成產(chǎn)物的方向移動,因而能削弱或解除這種抑制作用。六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響 六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響 Linewevery-Burk圖 米氏方程Lineweaver-Burk plot of competitive inhibition六. 抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響 某些抑制劑結(jié)合在酶活性中心以外的部位,因而與底物和酶的結(jié)合無競爭,即底物與酶結(jié)合后還能與抑制劑結(jié)合,同樣抑制劑與酶結(jié)合后還能與底物結(jié)合。但酶分子上有了抑制劑后其催化功能基團的性質(zhì)發(fā)生改變,從而
30、降低了酶活性。這種作用稱為非競爭性抑制作用。 2. 非競爭性抑制作用這種抑制作用不能用增加底物濃度的方法來消除。(一)可逆抑制作用2. 非競爭性抑制作用非競爭性抑制劑,例如:金屬絡(luò)合劑,如EDTA、F -、CN -、N3- 等,可以絡(luò)合金屬酶中的金屬離子,從而抑制酶的活性。(一)可逆抑制作用2. 非競爭性抑制作用這種抑制作用不能用增加底物濃度的方法來消除。(一)可逆抑制作用2. 非競爭性抑制作用(一)可逆抑制作用Linewevery-Burk圖 米氏方程2. 非競爭性抑制作用非競爭性抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響 (一)可逆抑制作用2. 非競爭性抑制作用Lineweaver-Burk plot o
31、f noncompetitive inhibition(一)可逆抑制作用2. 非競爭性抑制作用非競爭性抑制中,Vmax變小,Km不變這種抑制作用不能用增加底物濃度的方法來消除。(一)可逆抑制作用3. 反競爭性抑制作用 某些抑制劑不能與游離的酶結(jié)合,而只能在酶與底物結(jié)合成復(fù)合物后再與酶結(jié)合。當(dāng)酶分子上有了抑制劑后其催化功能被削弱。這種作用稱為反競爭性抑制作用(uncompetitive inhibition)。(一)可逆抑制作用3. 反競爭性抑制作用(一)可逆抑制作用3. 反競爭性抑制作用(一)可逆抑制作用(一)可逆抑制作用SummerySummery(二)不可逆抑制作用不可逆抑制劑不能用透析或
32、超濾等方法去除。 抑制劑以共價鍵不可逆地與酶相結(jié)合而抑制酶的活性。這種抑制作用叫不可逆抑制作用。六.抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響常見的不可逆抑制劑: 碘乙酸(ICH2COOH) 是一種烷化劑,可使巰基烷化: E-SH + I-CH2COOH E-S-CH2COOH + HI 所以它是巰基酶的抑制劑。 如抑制3-磷酸甘油醛脫氫酶、脲酶、a-淀粉酶等(二)不可逆抑制作用六.抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響 有機磷化合物 可使-OH磷酯化,所以它是活性中心有Ser殘基的酶的抑制劑。 常見的有機磷農(nóng)藥,如敵敵畏、敵百蟲,它們殺滅昆蟲的機理就在于可抑制乙酰膽堿酯酶的活性,該酶的作用是將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解,若它被抑
33、制,會導(dǎo)致乙酰膽堿的積累,使神經(jīng)過度興奮,引起昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)而中毒致死。(二)不可逆抑制作用六.抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響第三節(jié) 酶作用機理 1. 酶的組成成分結(jié)合酶 除蛋白質(zhì)外,還有非蛋白質(zhì)成分。 全酶 = 酶蛋白 + 輔因子根據(jù)組成成分,酶可分為兩類:單純酶 僅由蛋白質(zhì)組成的酶。輔基 與酶蛋白結(jié)合較緊密,常常以共價鍵結(jié)合,包括小分子有機物及金屬離子。輔因子有兩種:輔酶 與酶蛋白結(jié)合較松弛的小分子有機物。一. 酶的結(jié)構(gòu) 2. 酶的聚合狀態(tài)單體酶 酶蛋白僅有一條多肽鏈組成。寡聚酶 酶蛋白是寡聚蛋白質(zhì),由幾個至十多個亞基組成,以非共價鍵連接。多酶復(fù)合體 由幾個酶聚合而成的復(fù)合體。一般由在系
34、列反應(yīng)中功能相關(guān)的酶組成,有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進行。根據(jù)酶的聚合狀態(tài),酶可分為三類:一. 酶的結(jié)構(gòu) 3. 同工酶指具有不同分子結(jié)構(gòu)但催化相同反應(yīng)的一組酶。不同點:體外:理化性質(zhì) 體內(nèi):催化特性、分布的部位、生物學(xué)功能 每組同工酶中各種酶的異同:相同點:催化相同的化學(xué)反應(yīng),大多數(shù)是寡聚酶。一. 酶的結(jié)構(gòu) 同工酶的定義: 3. 同工酶以乳酸脫氫酶為例一.酶的結(jié)構(gòu)乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase,LDH) 3. 同工酶一. 酶的結(jié)構(gòu) LDH是1959年發(fā)現(xiàn)的第一個同工酶。 由4個亞基組成的寡聚酶,亞基分為M型和H型。 因此可以裝配成五種四聚體:H4(LDH1)、H3M(LD
35、H2)、H2M2(LDH3)、HM3(LDH4、M4(LDH5) 不同的LDH分布在不同組織中。例如,脊椎動物心臟中主要是 LDH1,而骨骼肌的則是LDH5。 3. 同工酶 對于適應(yīng)不同的組織、器官的不同生理需要非常重要;是代謝調(diào)節(jié)的一種重要方式。同工酶的作用:同工酶物理性質(zhì)差異:組成和順序不同催化特性不同電泳行為不同組織、器官中分布不同生理功能不同一. 酶的結(jié)構(gòu) 3. 同工酶一. 酶的結(jié)構(gòu) 不同組織中的LDH同工酶的電泳圖譜 一. 酶的結(jié)構(gòu) Plant Cell Physiology, 2005. 3. 同工酶一. 酶的結(jié)構(gòu) 研究同工酶的意義: 是研究代謝調(diào)節(jié)、個體發(fā)育、細胞分化、分子遺傳等
36、方面的有力工具。 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的好材料。 在臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)遺傳育種、病理分析上都有應(yīng)用價值 。 指酶分子中直接和底物結(jié)合,并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。(1)酶活性中心的組成:由一些氨基酸殘基的側(cè)鏈基團組成。對于結(jié)合酶,輔因子常常是活性中心的組成部分。這些基團在一級結(jié)構(gòu)上可能相距很遠,甚至可能不在一條肽鏈上,但在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近,形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。二.酶的活性中心 1. 酶的活性中心 1. 酶的活性中心二.酶的活性中心The structure of a glycogen phosphorylase monomer 1. 酶的活性中心二.酶的活性中心(2)酶活性中心的
37、特點Substrates typically lose waters (of hydration 水合作用) in the formation of the ES complex 1. 酶的活性中心二.酶的活性中心(2)酶活性中心的特點2. 都是酶分子表面的一個凹穴,有一定的大小和形狀,但不是剛性的,而具有一定的柔性。3. 活性中心為非極性的微環(huán)境,有利于與底物結(jié)合。1. 活性中心在酶分子總體積中只占相當(dāng)小的部分(約1%2%),相當(dāng)于23個氨基酸殘基。 1. 酶的活性中心二.酶的活性中心(2)酶活性中心的特點4. 底物與酶通過形成較弱鍵力的次級鍵相互作用并結(jié)合到酶的活性中心。 5. 酶的活性部
38、位并不是和底物的幾何圖形正好吻合,而是在酶與底物結(jié)合的過程中,底物分子或酶分子或它們兩者的構(gòu)象同時發(fā)生一定變化后才相互契合,這時催化基團的位置也正好處于所催化底物的敏感化學(xué)鍵部位。 1. 酶的活性中心二.酶的活性中心結(jié)合部位:底物在此與酶分子結(jié)合。一個酶的結(jié)合部位又可以分為各種亞位點,分別與底物的不同部位結(jié)合。催化部位:底物的敏感鍵在此被打斷或形成新的鍵,從而發(fā)生一定的化學(xué)反應(yīng)。一個酶的催化部位可以不止一個。2.有關(guān)酶活性中心的幾個術(shù)語二.酶的活性中心 有些酶的分子表面除了活性中心外,還具有重要的功能部位調(diào)節(jié)中心 調(diào)節(jié)中心可以與小分子的代謝物相結(jié)合,使酶分子的構(gòu)象發(fā)生改變,從而影響酶的活性。這
39、種作用叫變構(gòu)效應(yīng)(又叫別構(gòu)效應(yīng)); 具有變構(gòu)效應(yīng)的酶叫變構(gòu)酶,引起變構(gòu)的小分子物質(zhì)叫變構(gòu)劑(調(diào)節(jié)物)。二.酶的活性中心 使酶活性升高的變構(gòu)叫正變構(gòu),此時的變構(gòu)劑叫正變構(gòu)劑(正調(diào)節(jié)物); 使酶活性降低的變構(gòu)叫負變構(gòu),此時的變構(gòu)劑叫負變構(gòu)劑(負調(diào)節(jié)物)。二.酶的活性中心二.酶的活性中心活性中心內(nèi)的必需基團結(jié)合基團(binding group)與底物相結(jié)合催化基團(catalytic group)催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物 位于活性中心以外,維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需?;钚灾行耐獾谋匦杌鶊F底 物 活性中心以外的必需基團結(jié)合基團催化基團 活性中心 目 錄溶菌酶的活性中心* 谷氨酸35和天冬氨酸52是催
40、化基團;* 色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是結(jié)合基團;* AF為底物多糖鏈的糖基,位于酶的活性中心形成的裂隙中。 變構(gòu)酶(別構(gòu)酶)是指一些含有2個或2個以上亞基的寡聚酶,在變構(gòu)酶分子上,別構(gòu)效應(yīng)劑的調(diào)節(jié)部位一般遠離活性中心,但活性部位與調(diào)節(jié)部位之間或者活性部位之間,存在著相互作用(變構(gòu)效應(yīng),協(xié)同效應(yīng))。調(diào)節(jié)物與酶分子的調(diào)節(jié)部位結(jié)合之后,引起酶分子構(gòu)象發(fā)生變化,從而提高或降低活性部位的酶活性 三.變構(gòu)酶變構(gòu)酶的特點:變構(gòu)酶分子上除了活性中心外,還有調(diào)節(jié)中心。這兩個中心處在酶蛋白的不同部位,有的在不同的亞基上,有的在同一亞基上。變構(gòu)酶的 v-S 的關(guān)系不符合米氏方程,所以其曲線不是
41、雙曲線型。已知的變構(gòu)酶都是寡聚酶。三.變構(gòu)酶別構(gòu)酶動力學(xué)曲線A.為非調(diào)節(jié)酶的曲線 B.為別構(gòu)酶的S形曲線 三.變構(gòu)酶完整的酶分子 催化亞基 調(diào)節(jié)亞基 (活性形式) (三聚體) (二聚體) E.coli ATCase(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 )中亞基排列及全酶與亞基的關(guān)系 三.變構(gòu)酶 誘導(dǎo)酶(inducenzyme)是細胞內(nèi)在正常狀態(tài)下一類很少存在或沒有的酶,當(dāng)細胞中因加入了誘導(dǎo)物后而被誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶,它的含量在誘導(dǎo)物存在下顯著增高,這種誘導(dǎo)物往往是該酶底物的類似物或底物本身。 誘導(dǎo)酶是20世紀(jì)四十年代,微生物學(xué)工作者在研究大腸桿菌以葡萄糖和山梨糖醇為培養(yǎng)基時出現(xiàn)二度生長時發(fā)現(xiàn)的. 四.誘導(dǎo)酶 即第一
42、次生長的量與葡萄糖成比例,第二次生長的量與山梨糖醇濃度成比例。二度生長現(xiàn)象是由于一般大腸桿菌細胞內(nèi)只有利用葡萄糖的酶,而不含利用山梨糖醇的酶。因此對葡萄糖的利用不需要適應(yīng),即可利用,而對山梨糖醇的利用必需在山梨糖醇的誘導(dǎo)下,生成能分解山梨糖醇的酶才能進行,但這種誘導(dǎo)作用受到葡萄糖的阻遏,故必須在葡萄糖消耗完后才逐漸利用山梨糖醇。 四.誘導(dǎo)酶E.coli二度生長現(xiàn)象a:葡萄糖50 g/mL,山梨糖醇150 g/mL;b:葡萄糖100 g/mL,山梨糖醇100g/mL;C:葡萄糖150g/mL;山梨糖醇50 g/mL)四.誘導(dǎo)酶五 酶的催化機理(一) 酶與活化能碰撞、有效碰撞、活化分子、活化能:活
43、化分子所有的最低能量(Ea)與分子的平均能量(EA)之差。分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需要的能量稱為活化能。(一) 酶與活化能(二) 酶與底物作用機理中間產(chǎn)物學(xué)說催化機理目前較滿意的解釋是:中間產(chǎn)物學(xué)說又叫過渡態(tài)學(xué)說中間產(chǎn)物學(xué)說酶與底物通過形成中間產(chǎn)物使反應(yīng)沿一個低活化能的途徑進行。E + S ES E + P(二) 酶與底物作用機理中間產(chǎn)物學(xué)說(二) 酶與底物作用機理底物S與酶結(jié)合形成中間產(chǎn)物ES S與E的結(jié)合導(dǎo)致分子中某些化學(xué)鍵發(fā)生變化,呈不穩(wěn)定狀態(tài),亦即活化態(tài),使反應(yīng)活化能降低。復(fù)合物ES轉(zhuǎn)變成酶與產(chǎn)物的復(fù)合物EPEP裂解,生成產(chǎn)物Sumary-中間產(chǎn)物學(xué)說(二) 酶與底物作用機理鎖鑰學(xué)說
44、 (Lock and key Hypothesis)1890年 Emil Fischer as a great organic chemist led to the notion of an enzyme resembling a “l(fā)ock” and its particular substrate the “key”. 酶和底物的結(jié)合狀如鑰匙與鎖的關(guān)系。底物分子或其一部分象鑰匙一樣,專一地楔入到酶的活性中心部位,即底物分子進行化學(xué)反應(yīng)的部位與酶分子活性中心具有緊密互補的關(guān)系。(二) 酶與底物作用機理 此學(xué)說很好地解釋了酶的立體異構(gòu)專一性,但不能解釋酶的活性中心既適合于可逆反應(yīng)的底物,又適合
45、于產(chǎn)物,也不能解釋酶專一性中的所有現(xiàn)象。(二) 酶與底物作用機理誘導(dǎo)契合學(xué)說 (Induced fit Hypothesis)1958年 D.E.Koshland提出酶分子活性中心的結(jié)構(gòu)原來并非和底物的結(jié)構(gòu)互相吻合,但酶的活性中心是柔性的而非剛性的。(二) 酶與底物作用機理 當(dāng)?shù)孜锱c酶相遇時,可誘導(dǎo)酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)的變化,其上有關(guān)的各個基團達到正確的排列和定向,因而使底物和酶能完全契合。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束產(chǎn)物從酶分子上脫落下來后,酶的活性中心又恢復(fù)成原來的構(gòu)象。(二) 酶與底物作用機理目 錄對于雙分子反應(yīng),底物結(jié)合到酶的活性中心好象 (1) 鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)兩個底物分子相鄰近,大大提高了底物
46、的有效濃度 鄰近效應(yīng)底物分子還在活性中心“定向”排布,有利于原子軌道的重疊 軌道定向,使分子間反應(yīng)近似于分子內(nèi)反應(yīng)六、酶催化的高效性的機理2. 多元催化(multielement catalysis) 3. 表面效應(yīng)(surface effect) (2) “張力”和“形變”底物與酶結(jié)合酶分子構(gòu)象變化底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”和“形變”敏感鍵斷裂誘導(dǎo)有利于六、酶催化的高效性的機理 (3) 酸堿催化酶活性部位上的某些基團可以作為質(zhì)子供體(或質(zhì)子受體)對底物進行酸或堿催化 酸堿催化在酶的活性中心上,有些基團是質(zhì)子供體(酸催化基團),可以向底物分子提供質(zhì)子,稱為(酸催化)有些催化基團是質(zhì)子受體(堿
47、催化基團),可以從底物分子上接受質(zhì)子,稱為(堿催化)六、酶催化的高效性的機理酶分子中作為酸堿催化的功能基團 六、酶催化的高效性的機理有時,酶活性部位上有幾個基團分別作為質(zhì)子的供體和受體,同時進行酸堿催化 酸堿共同催化如 His的咪唑基在中性條件下,有一半是酸形式、一半是堿形式。因此既可進行酸催化,又可進行堿催化。所以咪唑基是酶分子最有效、最活潑的一個功能基團。六、酶催化的高效性的機理 (4) 共價催化 某些酶在催化反應(yīng)時,本身能放出或吸取電子并作用于底物的缺電子或負電子中心,并與底物形成共價連結(jié)的共價中間物,使反應(yīng)活化能大大降低。 按照酶對底物所攻擊的基團的不同,該催化方式又分為親核催化(nu
48、cleophilic catalysis)和親電子催化(cetecrophilic catalysis)。 六、酶催化的高效性的機理 (4) 共價催化親核催化:是指酶攻擊底物的基團是富電子的,這些基團首先攻擊底物的親電子基團(亦稱缺電子基團)而形成酶底物的共價復(fù)合物。反之,酶的缺電子基團攻擊底物分子上富電子基團而形成酶底物共價中間產(chǎn)物。在酶的共價催化中,親核催化較為常見 六、酶催化的高效性的機理羧肽酶A催化作用的模式 如 胰凝乳蛋白酶chymotrypsin六、酶催化的高效性的機理 (5) 活性中心是低介電區(qū)某些酶的活性中心穴內(nèi)是非極性的,這種低介電環(huán)境甚至還可能排除水分子。這樣,底物分子的敏
49、感鍵和酶的催化基團之間就會有很大的反應(yīng)力,加速反應(yīng)的進行。六、酶催化的高效性的機理第四節(jié) 維生素與輔因子維生素與輔因子 維生素是維持機體正常生命活動不可缺少的一類小分子有機化合物。它既不是機體的結(jié)構(gòu)物質(zhì),又不是營養(yǎng)物質(zhì)。許多維生素,特別是維生素B族,常常以輔因子的形式參與體內(nèi)代謝。 維生素種類按其溶性可將其分為脂溶性和水溶性:脂溶性Vit: A、D、E and K水溶性Vit: B1、B2、B6、B12維生素與輔因子維生素衍生的輔因子代號結(jié)構(gòu)輔因子功能維生素B1硫胺素焦磷酸硫胺素TPP主要參與a-酮酸的脫羧嘧啶環(huán)噻唑環(huán)1.維生素B1硫胺素c2維生素B1的需要量 維生素B1主要存在于種子外皮及胚芽中,米糠、麥麩、黃豆、酵母、瘦肉中含量最豐富。人體每日需要量為2毫克,體內(nèi)若維生素B1過多,極易隨尿排出,未見因體內(nèi)積累而造成中毒的情況。大劑量用于治療時,也未見副作用。 維生素B1缺乏癥 由于維生素B1和糖代謝關(guān)系密切,因此多食糖類食物,維生素B1的需要量也相應(yīng)增多。當(dāng)維生素B1缺乏時,糖代謝受阻,丙酮酸積累,使病人的血、尿和腦組織中丙酮酸含量增多,出現(xiàn)多發(fā)性神經(jīng)炎、皮膚麻木、心力衰竭、四肢無力、肌肉萎縮及下肢浮腫等癥狀,臨床上稱為腳氣病。根據(jù)其缺乏癥,又將維生素B1稱為抗神經(jīng)炎維生素(抗腳氣病維生素)。 FAD黃素腺嘌呤二核
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