人類疾病動物模型概述(2016級研究生,2016年9月)課件

1、人類疾病動物模型概述 中南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系肖獻忠一、基本概念1、生物：指一切具有新陳代謝、可生存、生長、繁殖的生命體，包括動物、植物、微生物。2、動物：指多細胞真核生命體，是生物中的一大類群，已知有150多萬種，包括人類。3、實驗動物：是指經(jīng)專門培育、供生物醫(yī)學實驗研究使用的動物，要求來源清楚、遺傳背景明確、微生物受到控制。4、人類疾病動物模型：是指具有人類疾病模擬表現(xiàn)的實驗動物二、人類疾病動物模型的作用和意義 1、避免了在人身上進行實驗所帶來的風險 臨床上對外傷、中毒、腫痛病因等研究是有一定困難的，甚至是不可能的，如急性和慢性呼吸系統(tǒng)疾病研究中很難重復環(huán)境污染的作用。輻射對機體的損

2、傷也不可能在人身上反復實驗。而動物可以作為人類的替難者，在人為設計的實驗條件下可反復觀察和研究。因此，應用動物模型，除了能克服在人類研究中經(jīng)常會遇到的理論和社會限制外，還容許采用某些不能應用于人類的方法學途徑，甚至為了研究需要可以損傷動物組織、器官或處死動物。2、可隨時復制臨床上平時不易見到的疾病 如放射病、毒氣中毒、烈性傳染病 ,可以根據(jù)研究目的要求隨時采用實驗性誘發(fā)的方法在動物身上復制出來。 3、可克服在研究某些潛伏期長、病程長和發(fā)病率低的人類疾病時所遇到的困難 一般遺傳性、免疫性、代謝性和內(nèi)分泌等疾病在臨床上發(fā)病率很低，研究人員可以有意識地提高其在動物種群的中發(fā)生頻率，從而推進研究。 如

3、腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展很緩慢，有的可能要幾年、十幾年、甚至幾十年。有些致病因素需要隔代或者幾代才能顯示出來，一個科學家很難有幸進行三代以上的觀察，而許多動物由于生命的周期很短，在實驗室觀察多代都是容易的。 在各種疾病研究中，同一時期內(nèi)很難在病人身上取得一定數(shù)量的生物樣本和數(shù)據(jù)資料，但在動物模型上容易實現(xiàn)。而且通過限定各種實驗條件（如投服一定劑量的藥物或移植一定數(shù)量的腫瘤等），可獲得條件一致的模型材料和數(shù)據(jù)。5、可以簡化實驗操作和樣品收集 動物模型作為人類疾病的“縮影”，便于研究者按實驗目的需要隨時采取各種樣本，甚至及時處死動物收集樣本，這在臨床是難以辦到的。實驗動物向小型化的發(fā)展趨勢更有利于實驗者

4、的日常管理和實驗操作。 因此，利用人類疾病動物模型來研究人類疾病，對理解疾病發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，對基因功能與疾病關(guān)系的分析、疾病發(fā)病機制的探討、藥物新靶點的發(fā)現(xiàn)及臨床前藥效學評價等都具有十分重要的作用和意義。 但從動物模型獲得的結(jié)果不能簡單類推至人，只能供研究人類疾病參考，其結(jié)果還必須在人類疾病中獲得驗證。三、人類疾病動物模型的分類（一）按制備方法分類1、自發(fā)性動物模型（spontaneous animal models）指不加任何人工誘發(fā)，在自然條件下動物自然產(chǎn)生的疾病，或者由于基因突變引起異常表型，通過遺傳育種保留下來的動物疾病模型。以腫瘤遺傳性疾病居多。優(yōu)點：在一定程度上減少了人為的因素

5、，更接近自然的人類疾病。缺點：種類有限，疾病動物飼養(yǎng)條件要求高，發(fā)病率低，發(fā)病時間長。自發(fā)腫瘤模型因動物種系、品種不同，其腫瘤所發(fā)生的類型和發(fā)病機制有差異 自發(fā)性動物模型應用價值很高，在遺傳性疾病、心血管病、免疫缺陷病、腫瘤等的研究上得到了廣泛應用。近幾十年來科學界十分重視自發(fā)性動物模型的開發(fā)。 如與人類心臟病相似的加拿大犬；與兒童碳水化合物、氨基酸代謝失調(diào)相似的貓；自發(fā)性高血壓和腦中風大鼠；青光眼兔；自發(fā)性糖尿病地鼠；肥胖癥小鼠；裸鼠等等。 優(yōu)點：制作方法簡便，實驗條件比較簡單，其他因素容易控制，短時間內(nèi)可大量復制。 缺點：誘發(fā)的疾病模型與自然產(chǎn)生的疾病在某些方面有所不同。而且有些人類疾病不

6、能用人工方法誘發(fā)出來。3、基因修飾動物模型（genetically modified animal models) 又稱遺傳工程動物模型，是指通過轉(zhuǎn)基因、基因敲除、基因敲入、基因敲低等生物工程技術(shù)人為改變了動物遺傳性狀的動物模型，是研究人類基因功能、人類疾病及新藥研發(fā)的重要工具，反應生命科學的發(fā)展趨勢，新技術(shù)不斷產(chǎn)生，日益受到學術(shù)界的重視。 在本講座中將做重點介紹。1、抗疾病型動物模型（negative animal models） 是指特定的疾病不會在某種動物身上發(fā)生。因此可借以探討為何該種動物對該疾病有天然的抵抗力。 如哺乳類動物均感染血吸蟲病，而洞庭湖流域的東方田鼠卻不能復制血吸蟲病，故

7、可用于血吸蟲感染和抗病的研究。（三）、其它分類2、生物醫(yī)學動物模型（biomedical animal models) 是指利用健康正常動物的生物學特征來提供人類疾病相似表現(xiàn)的疾病模型。 如沙鼠缺乏完整的腦基底Willis動脈環(huán)、動脈環(huán)后交通支，左右大腦供血相對獨立，可用來結(jié)扎一側(cè)頸動脈制備腦梗塞、腦缺血模型；鹿的正常紅細胞是鐮刀形的，多年來一直用于鐮刀形紅細胞貧血研究。四、人類疾病動物模型的制備原則1、相似性2、可重復性3、可靠性4、適用性和可控性5、易行性和經(jīng)濟性1、相似性所復制的模型應盡可能與人類疾病相同、相似，能夠找到與人類疾病相同的動物自發(fā)性疾病當然最好。例如SHR就是研究人類原發(fā)性

8、高血壓的理想模型，老母豬自發(fā)性冠狀動脈粥樣硬化是研究人類冠心病的理想模型，自發(fā)性狗類風濕性關(guān)節(jié)炎與人類幼年型類風濕性關(guān)節(jié)炎十分相似等等。與人類完全相同的動物自發(fā)性疾病模型畢竟不可多得，往往需要人工加以復制。為了盡量做到與人類疾病相似，首先要注意動物的選擇。 例如，小雞最適宜做高脂血癥的模型，因它的血漿甘油三酯、膽固醇以及游離脂肪酸水平與人十分相似，低密度和極低密度脂蛋白的脂質(zhì)構(gòu)成也與人相似。如果動物模型與臨床情況不相似，在動物身上有效的治療方案就不一定能用于臨床。 例如，動物內(nèi)毒性休克（單純給動物靜脈輸入細菌內(nèi)毒素所致的休克）與臨床感染性（膿毒性）休克就不完全一樣，因此對動物內(nèi)毒素性休克有效的

9、療法（如抗炎癥因子抗體）不能通過臨床試驗。如何增強動物模型復制時的可重復性？注意在以下方面盡量保持一致： 動物品種、品系、年齡、性別、體重、健康情況、飼養(yǎng)管理；實驗及環(huán)境條件、季節(jié)、晝夜節(jié)律、應激、室溫、濕度、氣壓；實驗方法步驟；藥品生產(chǎn)廠家、批號、純度、規(guī)格；給藥劑型、途徑、劑量、濃度；麻醉、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛方法；儀器型號、靈敏度、精確度；實驗者操作熟練程度等。3、可靠性復制的動物模型應該力求可靠地反映人類疾病，即可特異地、可靠地反映某種疾病或某種機能、代謝、結(jié)構(gòu)變化，應具備該種疾病的主要癥狀和體征，經(jīng)化驗或X光照片、心電圖、病理切片等證實。 例如鉛中毒可用大鼠做模型，但有它本身容易患地方性肺炎及

10、進行性腎病，后者容易與鉛中毒所致的腎病相混淆，不易確定該腎病是鉛中毒所致還是它本身的疾病所致。 用蒙古沙土鼠就比較容易確定，因為一般只有鉛中毒才會使它出現(xiàn)相應的腎病變。 5、易行性和經(jīng)濟性在復制動物模型時，所采用的方法應盡量做到容易執(zhí)行和合乎經(jīng)濟原則。 如靈長類動物雖與人最相近，復制的疾病模型與人類疾病相似性最好，但靈長類動物稀少昂貴，即使獼猴也不可多得，更不用說猩猩、長臂猿。很多小動物如大小鼠、地鼠、豚鼠等也可以復制出十分近似的人類疾病模型。它們?nèi)菀鬃鞯竭z傳背景明確，體內(nèi)微生物可加控制，模型穩(wěn)定，年齡、性別、體重等可任意選擇，而且價廉易得、便于飼養(yǎng)管理，因此可盡量采用。除非不得已或一些特殊疾

11、?。ㄈ缌〖病⒓顾杌野踪|(zhì)炎等）研究需要外，盡量不用靈長類動物。除了在動物選擇上要考慮易行性和經(jīng)濟性原則外，而且在模型復制的方法、試劑、指標的觀察上也都要注意這一原則。 五、基因修飾動物模型的制備方法及其研究進展1、轉(zhuǎn)基因動物模型2、基因敲除動物模型（經(jīng)典方法、條件性敲除）3、基因敲入動物模型4、基因敲低動物模型5、基因修飾技術(shù)新進展（ZNF, TALENs, CRISPR/Cas9) 1982年華盛頓大學的Palmiter RD將大鼠的生長激素基因注射到小鼠受精卵內(nèi),培育出體型明顯大于正常小鼠的超級鼠,轉(zhuǎn)基因小鼠A生長速度要比普通小鼠B的生長速度平均快50%，引起轟動。1、 轉(zhuǎn)基因動物（tran

12、sgenic animal) 模型1987年 世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊誕生(英國Roslin 研究所)；1989年 精子載體法應用于轉(zhuǎn)基因動物；1997年 轉(zhuǎn)基因克隆羊Dolly產(chǎn)生(Roslin研究所)，攜帶人 凝血因子； 1999年 上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管牛“滔滔”誕生 三十多年來，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因雞、轉(zhuǎn)基因魚等陸續(xù)育成。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已廣泛應用于生物學、醫(yī)學、藥學、畜牧學等研究領域。 轉(zhuǎn)基因鼠 轉(zhuǎn)基因動物的概念 將外源基因?qū)肱咛ゼ毎⒄系交蚪M，使動物獲得一個基因并能穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物。（傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物：外源基因隨機整合,

13、拷貝數(shù)不定)轉(zhuǎn)基因動物制備原理 轉(zhuǎn)基因的基本方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒法ES（胚胎干細胞）法精子載體法脂質(zhì)體載體法電脈沖法基因槍法體細胞核移植技術(shù)（轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)） 1、顯微注射法顯微注射儀拉針儀煅針儀體視鏡受精卵的采集受精卵的消化、培養(yǎng)消化、洗滌后的受精卵原核清晰的受精卵注射前注射后（3）受精卵的顯微注射注射中受精卵的移植2、逆轉(zhuǎn)錄病毒法Retrovirus是只有一條單鏈RNA的病毒類的總稱。逆轉(zhuǎn)錄病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的作用下可以將本身的單鏈RNA作為模板進行復制和遺傳信息的傳遞。逆轉(zhuǎn)錄病毒通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞。原 理逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細胞

14、DNA上高度整合的特性。 逆轉(zhuǎn)錄病毒能作為目的基因的載體，通過感染早期胚胎細胞實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生嵌合體動物，再經(jīng)過雜交、篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。人或動物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干細胞，稱胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）。它與早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能參與宿主胚胎的發(fā)育，形成包括生殖細胞在內(nèi)的所有組織。3、胚胎干細胞介導法 （ES細胞法）原 理將外源目的基因?qū)隕S細胞，再移入囊胚期的宿主胚胎，最后將宿主胚胎移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，便可獲得由胚胎干細胞介導的轉(zhuǎn)基因動物。 關(guān)鍵步驟ES細胞的分離培養(yǎng)ES細胞基因操作：電穿孔、顯微注

15、射、磷酸鈣-DNA共沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等方法 獲取囊胚期胚胎顯微操作：ES細胞注射到囊胚期胚胎內(nèi) 胚胎移植優(yōu)點： 整合率相對較高可導入基因片斷較長外源基因整合于所有的組織細胞中的概率高 缺點： 隨機整合有些原核看不清，需經(jīng)特殊處理才能有效導入需較精密儀器，費用昂貴顯微注射法三種轉(zhuǎn)基因方法優(yōu)缺點比較優(yōu)點：胚胎存活率高病毒DNA隨機單拷貝整合宿主范圍廣 缺點： 整合率不高，整合位點是隨機的后代多為嵌合體動物外源基因易發(fā)生重排或丟失病毒載體容量不大病毒DNA序列可能會干擾外源基因的表達 逆轉(zhuǎn)錄病毒法 優(yōu)點： 整合可控可用多種方法將外源基因?qū)隕S細胞，其細胞的 鑒定和篩選比較方便ES細胞注入囊胚及

16、囊胚移植到子宮的操作比較簡便 缺點： ES細胞系培養(yǎng)、保存和維持不易后代多為嵌合體所需時間較長 ES細胞法 應用價值研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控建立人類疾病動物模型研究人類疾病基因治療研制生物反應器擴大移植供體來源改良動物品種2、基因敲除動物模型（經(jīng)典方法、條件性敲除）基因敲除動物（gene knock-out animal) 是指通過同源重組，在細胞中定點敲除某個基因，使之不能表達，并能遺傳給子代的一類動物。結(jié)合了基因工程、干細胞工程、生殖工程三大技術(shù)的優(yōu)勢，是上世紀80年代發(fā)展起來的受到全球科學家關(guān)注的一項新技術(shù)。1981年小鼠胚胎干細胞系建立（Evans MJ)； 1985年發(fā)現(xiàn)同

17、源重組（Smithies O)；1989年首個基因敲除小鼠產(chǎn)生（Schwartzberg PL)。主要步驟：基因打靶載體構(gòu)建、干細胞與生殖工程操作、基因型與表型觀察2007年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎Oliver Smithies美國北卡來納大學生化與分子生物學教授，發(fā)現(xiàn)同源重組技術(shù)。Mario R. Capecchi美國猶他大學遺傳學教授，發(fā)現(xiàn)同源重組技術(shù)。Martin J. Evans英國加的夫大學遺傳學教授，發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞建系、培養(yǎng)、操作等技術(shù)。基因打靶載體的構(gòu)建HSF1基因打靶載體構(gòu)建示意圖胚胎干細胞（ES)與胚胎操作基因型與表型的觀察FEMALE MALE+/+ -/- +/+ -/-

18、3. HSF1基因敲除Xiao XZ, et al. EMBO J, 18(21): 5943-52.1999條件性基因敲除（conditional gene knockout) 條件性基因敲除主要通過Cre/loxP或者Ftp/FRT重組系統(tǒng)來實現(xiàn)。Cre/loxP系統(tǒng) Cre/loxP系統(tǒng)來源于F1噬菌體，可以介導位點特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩種成分：一段長34bp的DNA序列，含有兩個13 bp的反向重復序列和一個8 bp的核心序列，稱為loxP位點；Cre重組酶，它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)loxP位點的DNA重組。當一段DNA序列位于兩個loxP位點之間的時候

19、，在Cre重組酶的作用下，這段序列可被刪除(當兩個loxP位點的方向相同)，或者方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)(當兩個loxP位點的方向相反)。 利用Cre/loxP系統(tǒng)進行條件性基因敲除，需要兩只轉(zhuǎn)基因小鼠。第一只小鼠通過同源重組技術(shù)將loxP位點分別置于目的基因的兩端；第二只是轉(zhuǎn)基因小鼠，將Cre重組酶置于某特定基因啟動子的調(diào)控之下，可以使其在某特定組織或誘導物存在的條件下表達。最后，讓這兩只小鼠進行交配，所產(chǎn)生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的組織細胞或在誘導物作用下缺失某特定基因。Cre/loxP系統(tǒng)的作用機制3、基因敲入動物（gene knockin animal) 即通過同源重組

20、技術(shù)將外源基因定點整合到宿主基因組中，且拷貝數(shù)確定，解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物制備中隨機整合、拷貝數(shù)不定的缺陷。4、基因敲低動物(gene knock-down animal) 即表達RNAi的轉(zhuǎn)基因動物。通過隨機或定點敲入的方式將某種siRNA基因整合至基因組，利用RNAi機制調(diào)低動物中某種基因的表達水平。與基因敲除動物相比，制備更為簡單、快速、經(jīng)濟。5、基因修飾技術(shù)新進展（ZFN, TALENs, CRISPR/Cas9)經(jīng)典方法 ：經(jīng)典的基因敲除技術(shù)：由細胞自身進行隨機雙鏈斷裂和同源重組，發(fā)生幾率低(1/106 cells），再靠正負篩選來獲得同源重組細胞。基因修飾新技術(shù)： 采用特異的DNA識

21、別域 + 核酸酶，在特定的DNA位點切斷DNA，形成雙鏈斷裂，大大改善了同源重組的效率，實現(xiàn)對基因組進行更加精確、有效的改造。實現(xiàn)染色體DNA序列的人工編輯修改點突變：Silent，Missense，Nonsense，F(xiàn)rame shift（基因敲除）片段刪除片段插入目的與用途：疾病模型制備、基因功能研究、基因治療等基因修飾新技術(shù)解決傳統(tǒng)的挑戰(zhàn)（1）ZFN 技術(shù)鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。鋅指結(jié)構(gòu)中的兩個半胱氨酸可與另兩個半胱氨酸（C）或組氨酸（H）一起與鋅離子絡合

22、而形成指狀結(jié)構(gòu)，每一個指狀結(jié)構(gòu)可特異識別3-4個堿基；人工設計識別特異DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)采用如上的通用序列，通過改變其中7個X來實現(xiàn)識別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個螺旋間的連接序列；構(gòu)建成對人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。鋅指核酸酶介導的定向染色體刪除研究人員可以利用ZFN技術(shù)進行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識別多種DNA序列，但還不能達到識別任意靶DNA的目的，其應用受到一定的限制。（2）TALEN技術(shù)概念：轉(zhuǎn)錄激活子樣效應子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，

23、TALENs)。最初在植物病原體黃單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)，即某些多肽能特異性結(jié)合到宿主基因的某個位點從而激活該宿主基因的表達 。與ZFNs相比，TALENs 的DNA識別序列更長，故脫靶效應的幾率較小，現(xiàn)已應用于細胞、酵母、斑馬魚、大鼠、小鼠等各類研究對象。技術(shù)原理：表達一個重組核酸酶，在靶點識別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標基因，完成基因敲除的過程。1989年 植物病原體黃單胞菌屬 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。2007年 發(fā)現(xiàn)其具有序列特異性核酸結(jié)合特性， avrBs3 TA2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列與核酸靶序列的對應關(guān)

24、系被破譯 由34個aa組成一個單元模塊，重復14 -18次 34個aa中的第12和13個氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 對應識別一個目標堿基 TALEN 發(fā)展過程N-天冬酰胺; I-異亮氨酸; H-組氨酸; D-天冬氨酸; G-甘氨酸人工構(gòu)建TALE模塊識別指定核酸序列102堿基模塊單元 14 18個重復真核表達 14 18個重復特異識別指定的14 -18 個核酸序列并與之結(jié)合34氨基酸單元TALEN (TALE+FOK I) 表達質(zhì)粒對構(gòu)建 TALEN 基因敲除X 2TALEN 表達質(zhì)粒對的轉(zhuǎn)染、表達和靶位點切割雙鏈斷裂誘發(fā)DNA損傷修復機制（nonh

25、omologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復中發(fā)生移碼突變的個體即形成目標基因敲除突變體TALEN介導的同源重組同源重組發(fā)生率升高幾個數(shù)量級Donor plasmidHRDonor plasmidDonor plasmid基因敲入Right armLeft arm片段刪除Right armLeft arm點突變2011年8月， Nature Biotechnology 上同時發(fā)表了用TALEN 技術(shù)進行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。一篇人類干細胞 Genetic engineering of human pluripotent

26、cells using TALE nucleases 一篇大鼠Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 兩篇斑馬魚 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs一篇綜述Move over ZFNTALEN技術(shù)新進展TALEN靶向（基因敲除）技術(shù)基本流程1. 選擇、確定靶點2. TALE識別模塊

27、串聯(lián)構(gòu)建3. TALEN真核表達質(zhì)粒構(gòu)建4. TALEN真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細胞，表達TALEN重組蛋白5. 檢測突變效率，篩選（移碼）突變體X 2X 2X 2靶點的DNA序列特征：相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點參考文獻：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在線靶點選擇

28、設計軟件：/node/add/talef-off/選擇確定TALE靶點 TAL的核酸識別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、G、C、T有恒定的對應關(guān)系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，非常簡單明確 欲使TALEN特異識別某一核酸序列（靶點），只須按照靶點序列將相應TAL單元（14 -18個）串聯(lián)克隆即可。TALE識別模塊串聯(lián)構(gòu)建具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng)步驟一：靶點識別單元串聯(lián)步驟二：TALEN表達質(zhì)粒構(gòu)建將靶點識別模塊克隆入真核表達載體，得到Talen質(zhì)粒對 靶點識別模塊串接成功后需克隆入真核表達載體中。此真核表達載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合

29、有FokI序列。 目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實際操作中需在目標基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個堿基）分別進行TAL識別模塊構(gòu)建。X 2真核表達TALEN質(zhì)粒對TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞后，其表達的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點并與靶位點特異結(jié)合。此時，兩個TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點之間打斷目標基因。步驟三. 將TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞中實現(xiàn)靶基因敲除內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復機制（nonhomologous end-joining

30、，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標基因敲除突變體。突變體形成PCR 酶切法 利用靶點設計時挑選的，位于相鄰靶位點之間的特異性內(nèi)切酶位點，進行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。 經(jīng)驗規(guī)律：= 2%可用，=10%很好熒光素酶檢測法 （按試劑盒說明書操作）TALEN切割效率檢測突變體篩選 有限稀釋法獲得單細胞克隆 PCR-酶切法鑒定 PCR測序確認（3）CRISPR/Cas9 技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)最初是在細菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是細菌用來識別和摧毀噬菌體、病毒等病原體入侵的防御系統(tǒng)，近年來經(jīng)科學家改造成一種新的基因組編輯技術(shù)，即一種來源于細菌獲得性免疫

31、的由RNA指導的Cas蛋白對靶基因進行修飾的技術(shù)，被科學雜志列為2013年年度十大科技進展之一。CRISPR規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）CasCRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）crRNA來源于CRISPR 的RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA)tracrRNA反式激活RNA (trans-activating RNA, tracrRNA)sgRNA單向?qū)NA(single guide RNA

32、, sgRNA)，將crRNA 和tracrRNA兩種向?qū)NA融合在一起形成PAM（protospacer-adjacent motif）即原型間隔序列鄰近基序，為NGGBiotechnology: Rewriting a genome，Nature495,5051在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，由Cas9核酸酶在DNA靶位點上進行切割。首先，crRNA的RNA分子中的一部分序列與tracrRNA分子通過堿基配對結(jié)合在一起，形成嵌合RNA(tracrRNA/crRNA)，然后，crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行堿基配對，這種嵌合RNA能夠引導Cas9結(jié)合到這個靶位點上并進行切割。CR

33、ISPR-Cas9 技術(shù)原理示意圖CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫。1987年，日本大阪大學（Osaka University）在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一段由簡單的重復序列組成的不同尋常的DNA片段。這些重復序列編碼的RNA能識別并切除外源噬菌體、質(zhì)粒DNA序列，達到防御免疫的作用。CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌防御免疫中的作用CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌防

34、御免疫中的作用CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細胞針對外源DNA特異性免疫, 而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細菌進化了CRISPR 介導的適應性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRISPR 間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔序列（spacer）來實現(xiàn)的。2013以后，研究者們在包括science和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章，采用CRISPR-Cas系統(tǒng)，在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。將細菌的特異性免疫系統(tǒng)改造為新的基因修飾系統(tǒng)CRISPR-Cas主要由兩部分組成：

35、識別切割CRISPR-Cas的結(jié)構(gòu)CRISPR結(jié)構(gòu) 規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）是一個特殊的DNA重復序列家族, 廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR 位點通常由短的高度保守的重復序列(repeats) 組成, 重復序列的長度通常 2148 bp, 重復序列之間被 2672 bp 間隔序列(spacer)隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進行識別。CRISPR結(jié)構(gòu)Cas家族Cas（CRISPR associated protein），存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導下對靶位點進行切割。它與fo