篩選具有優(yōu)良組織培養(yǎng)特性的小麥品種及成熟胚半胚培養(yǎng)的有效性

1、PAGE PAGE 14Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET.篩選具有優(yōu)良組織培養(yǎng)特性的小麥品種及成熟胚半胚培養(yǎng)的有效性生物科學(xué)2002級 陳黎指導(dǎo)教師 晏本菊 教授摘 要：為為了篩選選具有良良好組織織培養(yǎng)特特性的優(yōu)優(yōu)良小麥麥品種作作為轉(zhuǎn)基基因受體體，使轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因小小麥能盡盡快得到到應(yīng)用，四四個小麥麥品種綿綿陽111、川農(nóng)農(nóng)12、川川農(nóng)177、川農(nóng)農(nóng)18的的幼胚和和成熟胚胚以及七七個20004年年參加四四川省區(qū)區(qū)試的小小麥品系系的成熟熟胚被用用來進行行離體培培養(yǎng)，考考察其組組織培養(yǎng)養(yǎng)特性。結(jié)結(jié)果表

2、明明，十三三個品種種（系）的的成熟胚胚成愈率率都達990%以上，但但成熟胚胚來源的的愈傷組組織的植植株再生生率存在在很大差差異：七七個小麥麥品系的的植株再再生率都都低于220%，而四四個小麥麥品種的的植株再再生率都都達355%以上。另另外，四四個小麥麥品種的的幼胚成成愈率及及植株再再生率都都分別達達90%和633%以上。因因此本研研究為小小麥的遺遺傳轉(zhuǎn)化化提供了了幾個新新的優(yōu)良良受體品品種。而而且，本本研究進進行成熟熟胚培養(yǎng)養(yǎng)時，采采用半胚胚培養(yǎng)的的方式，一一方面有有效地克克服了成成熟胚在在誘導(dǎo)培培養(yǎng)基上上直接萌萌發(fā)的現(xiàn)現(xiàn)象，另另一方面面提高了了成熟胚胚來源的的愈傷組組織分化化為多苗苗的能力力

3、。該再再生體系系可以作作為小麥麥胚培養(yǎng)養(yǎng)的參考考。關(guān)鍵詞：小小麥，幼胚，成熟胚胚，組織培培養(yǎng)特性性，植株再再生Culliing eliite wheeat culltivvarss wiith goood ttisssue cullturre rrespponsse aand culltivvatiing hallf-mmatuure embbryoos eeffeectiivellyChen Li Bioologgicaal SScieencee, GGradde 220022 Direcctedd byy Yaan BBenjju (Proof. Ph. D)Abstrractt: IIn

4、 oordeer tto sscreeen eliite wheeat culltivvarss wiith goood ttisssue cullturre rrespponsse aas rreciipieentss off whheatt trranssforrmattionn annd sspeeed uup tthe apppliccatiion of traansggeniic wwheaat, thee immmatturee annd mmatuure embbryoos of fouur wheeat culltivvarss “CChuaannoong112”, “CChu

5、aannoong117”, “CChuaangnnongg18”, “MMiannyanng111” aand of sevven wheeat linnes, whhichh weere useed ffor areea ttestt inn Siichuuan proovinnce in 20004, werre cculttureed iin vvitrro. Thee reesullts inddicaate thaat mmeann caalluus iinduuctiion ratte oof mmatuure embbryoos wwas oveer 990%. Hoowevve

6、r, siigniificcantt diiffeerenncess weere obsservved amoong thee caalluus iinittiatted froom tthesse mmatuure embbryoos. Thee pllantt reegenneraatioon rratee off caalluus iinittiatted froom mmatuure embbryoo off thhe sseveen wwheaat llinees wweree leess thaan 220% annd pplannt rregeenerratiion ratte

7、oof ccalllus iniitiaatedd frrom matturee emmbryyo oof tthe fouur wwheaat cculttivaars werre mmoree thhan 35%. MMoreeoveer, thee caalluus iinduuctiion ratte aand plaant reggeneerattionn raate of immmatuure embbryoos oof tthe fouur wwheaat cculttivaars werre iin eexceess of 90% annd 663%, reespeectiiv

8、elly. So thiis rreseearcch ssupppliees tthreee nnew eliite reccipiientt cuultiivarrs ffor wheeat traansfformmatiion. Fuurthhermmoree, iin tthiss reeseaarchh, hhalff-matturee emmbryyos werre cculttivaatedd, wwhicch ccan deccreaase effficiienttly gerrminnatiion of embbryoos iin ccalllus indducttionn m

9、eediaa annd iincrreasse tthe mulltipple-plaantllet reggeneerattionn raate of callluss froom mmatuure embbryoss. Thiis wwheaat pplannt rregeenerratiion sysstemm coouldd bee a reffereencee foor ootheer wwheaat ggenootyppes.Keywoord: wheeat,immmatuure embbryoo, matturee embbryoo,tisssuee cuultuure ress

10、ponnse,plaant reggeneerattionn raate小麥?zhǔn)鞘澜缃缟戏N植植面積和和產(chǎn)量均均居榜首首的重要要糧食作作物。綜綜合世界界糧農(nóng)組組織(FFAO)的統(tǒng)計計報告，1999年，世界小麥種植面積達2.14億hm2，1997和1999年世界平均總產(chǎn)量為5.88億t。而且小麥蛋白質(zhì)含量可達其干重的10%，是人類蛋白質(zhì)的主要攝入來源 1。實踐證明，利用植物基因工程改良小麥品質(zhì)是一個行之有效的途徑。雖然轉(zhuǎn)化方法較多并且日趨成熟，但限制其發(fā)展的一個重要因素是小麥的植株再生頻率低，而且建立穩(wěn)定的小麥再生體系也比較困難。所以，在小麥組織培養(yǎng)過程中，建立高頻率的植株再生體系是小麥轉(zhuǎn)化成功的重

11、要基礎(chǔ)和保證，而研究小麥組織培養(yǎng)條件和植株再生頻率的影響因素則是小麥生物技術(shù)育種中一個亟待解決的課題。眾所周知，轉(zhuǎn)基因方法在小麥的改良中起著舉止輕重的作用。通過轉(zhuǎn)基因的方法，可以將單個外源優(yōu)良基因?qū)胄←湺皇芊N間不親和性的干擾。另外也不會把不利基因?qū)胄←湵尘爸?。然而，轉(zhuǎn)基因小麥的實際應(yīng)用還受到很多的限制。主要有兩方面原因：一是不能找到大量合適的外源基因受體。 在目前的小麥轉(zhuǎn)基因方案中，通過組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法還不能被忽視。這就要求轉(zhuǎn)基因受體具有良好的組織培養(yǎng)特性。此外，外源基因受體的整體農(nóng)藝性狀必須優(yōu)良，這樣才能更快獲得能用于大田生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小麥。目前已被審定推廣的優(yōu)良小麥品種很多

12、，但我們并不清楚哪些品種具有優(yōu)良的組織培養(yǎng)特性。因此我們需要從這些優(yōu)良的小麥品種中不斷地篩選出組織培養(yǎng)特性好的品種作為轉(zhuǎn)基因受體，這樣的篩選工作可以促進小麥轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展。二是小麥組織培養(yǎng)方案中外植體的選擇范圍狹窄，主要集中于幼胚和成熟胚兩種植體。雖然研究者們普遍認為幼胚是小麥組織培養(yǎng)的最佳外植體2，3，前人也在小麥成熟胚的離體培養(yǎng)方面已取得很大進展4，5，這為小麥轉(zhuǎn)基因研究提供了一個方便的途徑。然而，小麥胚的組織培養(yǎng)特性受基因型的影響極大2，69，因此找到適合于某些優(yōu)良小麥品種的植株再生體系也是必要的。本研究考察了十三個小麥品種（系）的幼胚及成熟胚的組織培養(yǎng)特性，建立了一個比較有效的小麥植

13、株再生體系，篩選出優(yōu)良的具有組織培養(yǎng)特性的小麥品種，并比較成熟胚和半胚培養(yǎng)的有效性，為小麥轉(zhuǎn)基因的研究提供參考。1 試驗材材料與方方法1.1 材材料實驗材料包包括在220044年四川川省區(qū)試試中表現(xiàn)現(xiàn)高產(chǎn)的的七個小小麥品系系CP993-117-331、GG33、22L-221、SSW1881555、0220488、64400002和小小觀544的種子子；四個個小麥品品種綿陽陽11、川川農(nóng)122、川農(nóng)農(nóng)17和和川農(nóng)118的種種子和幼幼胚。1.2 培培養(yǎng)基愈傷組織誘誘導(dǎo)培養(yǎng)養(yǎng)基和繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)基：MMS22 mgg/L 2，44D0.11 g/LL水解酪酪蛋白30 gg /L蔗糖糖；分化培養(yǎng)養(yǎng)基：M

14、MS22 mgg /LL KT 0.55 g /L水水解酪蛋蛋白220 gg /L蔗蔗糖；生生根培養(yǎng)養(yǎng)基：11/2MMS00.1 mg/L KKT+0.55 mgg/L NAAA200g/LL蔗糖。所所有培養(yǎng)養(yǎng)基用88 g/L瓊脂脂固化，ppH調(diào)至至5.88， 1211下經(jīng)1.1 kkg/mm2高壓濕濕熱滅菌菌20mmin。1.3 小小麥成熟熟胚、幼幼胚的離離體培養(yǎng)養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)養(yǎng)：選擇擇飽滿種種子，用755%乙醇消消毒5mmin，換以0.1% HgCl2消毒25min，無菌水沖洗56次，置于適量無菌水中，室溫下浸泡1416h，然后剝離成熟胚，橫切為兩段，將含胚芽的一段（以后稱為半胚）接種于誘導(dǎo)

15、培養(yǎng)基上。其中一部分胚以完整胚（以后稱為全胚）的形式接種，以便和半胚比較培養(yǎng)效果。 幼胚培養(yǎng)：取開花花后144 d的四個個小麥品品種的幼幼嫩種子子，用775%乙醇消消毒1mmin，再用0.11% HggCl22消毒110miin，無無菌水沖沖洗56次，剝剝離幼胚胚接種于于誘導(dǎo)培培養(yǎng)基上上。每個個品種都都接種1120枚枚半胚、1120枚枚全胚和和1200枚幼胚胚，各設(shè)設(shè)3次重重復(fù)。將胚放置在在242的的條件下下暗培養(yǎng)以誘誘導(dǎo)愈傷傷組織。形形成的愈愈傷組織織每隔77d繼代代一次，成熟胚胚愈傷組組織在繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)基中共共培養(yǎng)228 d。幼胚胚愈傷組組織在繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)基中共共培養(yǎng)449 d，繼代代時除

16、去去直接萌萌發(fā)出芽芽的愈傷傷組織，隨后將60枚愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，于242、16 h光照（2000Lux）條件下培養(yǎng)，設(shè)3次重復(fù)。1.4數(shù)據(jù)據(jù)統(tǒng)計及及處理萌發(fā)率（在誘導(dǎo)導(dǎo)培養(yǎng)基基上直接接萌發(fā)的的胚數(shù)/1200）1000%出愈率（愈傷組組織塊數(shù)數(shù)/1220）1000%分化率（分化出出苗的愈愈傷組織織數(shù)/60）1000%多苗率（分分化出多多苗的愈愈傷組織織數(shù)/660）1000% 對所得數(shù)據(jù)據(jù)進行FF檢驗及及t-檢檢驗分析析。因七七個小麥麥品系的的成熟胚胚愈傷組組織的分分化率遠遠低于四四個小麥麥品種的的成熟胚胚愈傷組組織的分分化率，所所以七個個小麥品品系的植植株再生生率沒有有參與比比較。2 試

17、驗結(jié)結(jié)果與分分析2.1小麥麥胚的成愈率比較較 供試試的十三三個小麥麥品種（系系）的半半胚、全全胚及幼幼胚的平平均成愈愈率都在在90%以上。十十三個品品種（系系）之間間相比，半胚和全胚的成愈率都無顯著差異（半胚：F= 0.226 ，全胚：F0.213，F(xiàn)0.052.30）。這表明愈傷組織的誘導(dǎo)無基因型差異。且半胚和全胚的成愈率也無顯著差異（F=0.147，F(xiàn)0.05 2.30），表明成熟胚被分為兩半后不影響愈傷組織的形成。另外，四個小麥品種的幼胚和半胚之間相比，其成愈率無顯著差異（表1），表明半胚形成愈傷組織的能力和幼胚相似。表1 四個個小麥品品種幼胚胚和半胚胚平均成成愈率（）比較較Tablee

18、 1 meaan ccalllus indducttionn raate (%) off immmatturee emmbryyoand hhalff-maaturre eembrryo of ffourr wheeat varriettiess小麥品種varieetiees幼胚成愈率率(%)calluus iinduuctiion ratte of immmatturee emmbryyo半胚成愈率率(%)calluus iinduuctiion ratte oof half of matturee emmbryyot值t-vallue川農(nóng)1292.78891.9440.3133ns川農(nóng)17

19、92.50091.3881.2655ns川農(nóng)1891.94491.3880.7077ns綿陽1195.25591.9441.2111nsns表示在在p00.055的水平平上差異異不顯著著。ns meeanss noo siign diffferrencce aat pp=0.05.2.2半胚胚與全胚胚發(fā)芽率率比較 成成熟胚在在形成愈愈傷組織織的同時時，其胚胚芽會直直接萌發(fā)發(fā)成苗。全全胚的萌萌發(fā)現(xiàn)象象最為嚴嚴重，平平均萌發(fā)發(fā)率在443%以以上。半半胚的萌萌發(fā)率明明顯比全全胚低，平平均在99%以下下。全胚胚和半胚胚的萌發(fā)發(fā)率存在在顯著差差異（FF= 774.1199，F(xiàn)F0.005= 2.330）

20、，表表明半胚胚能很好好地克服服胚直接接萌發(fā)的的現(xiàn)象。而而十三個個品種之之間相比比，半胚胚和全胚胚萌發(fā)率率無顯著著差異（半半胚：FF= 00.2338，全全胚：FF=0.4411，F(xiàn)0.05= 2.30）。這表表明在這這十三個個品種（系系）中，胚胚直接萌萌發(fā)的現(xiàn)現(xiàn)象無基基因型影影響。2.3基因因型不同同及來源源不同的愈傷組組織對植植株再生生的影響響 供試試的七個個小麥品品系的半半胚和全全胚所形形成的愈愈傷組織織，其植植株再生生率都分分別在15%和200%以下，明明顯低于于四個小小麥品種種相應(yīng)愈愈傷組織織的植株株再生率率，因此此沒參與與比較。這說明植株再生率存在基因型差異。四個小麥品種的半胚和全胚

21、所形成的愈傷組織，其植株再生率分別都達35%和47%以上（表2），且四個小麥品種之間無顯著差異（半胚：F= 2.458，全胚：F=1.733，F(xiàn)0.05(3,8)= 4.07）。半胚和全胚來源的愈傷組織都能分化出多苗（圖1A）。盡管全胚愈傷組織的植株再生率比半胚愈傷組織的植株再生率高，且兩者之間存在明顯差異（表2），但半胚來源的愈傷組織分化多苗的能力遠遠高于全胚來源的愈傷組織（表2）。而四個小麥品種的幼胚形成的愈傷組織的植株再生率都在63%以上（表3），且品種之間不存在顯著差異（F= 0.247，F(xiàn)0.05=4.07）。幼胚來源的愈傷組織的植株再生能力比半胚來源的愈傷組織高（表3），且四個品種

22、幼胚來源的愈傷組織全都分化為多苗（圖1B）。表2 半胚胚、全胚胚愈傷組組織植株株再生率率（）、多多苗率（）比較較Tablee 2 meaan pplannt aand mulltipple-plaantllet reggeneerattionn frrequuenccy (%) of calluus iinduucedd frrom inttactt maaturre eembrryo andd haalf - mmatuure embbryoo品種varriettiess植株再生率率plantt reegenneraatioon rratee(%)多苗率mean mulltipple-pla

23、antllet regeenerratiion freequeencyy(%)半胚全胚t-值半胚全胚t-值川農(nóng)1237.67749.4447.2977*21.1117.7816.9771*川農(nóng)1736.67748.89911.0000*20.0008.899.9988*川農(nóng)1835.56647.78815.5556*18.8997.7714.1442*綿陽1138.33350.56611.0000*21.6779.4411.0000*表示在在p00.011水平上上差異極極限著。* meeanss siigniificcantt diiffeerennce at p=00.011 .圖1A 箭箭

24、頭所指指是分化化的多苗苗 圖1BB幼胚愈愈傷組織織上的多多苗表3 四四個品種種的幼胚胚和半胚胚的愈傷傷組織平平均分化化率（）比較較Tablee3 mmeann pllantt reegenneraatioon ffreqquenncy (%) off caalluus iinduucedd frromimmatturee emmbryyo aand hallf-mmatuure embbryoo inn foour wheeat varriettiess小麥品種vvariietiies半胚愈傷組組織分化化率 plantt reegenneraatioon ffreqquenccy oof ca

25、llluss indduceed froom hhalff-matturee emmbryyo (%)幼胚愈傷組組織分化化regenneraatioon ffreqquenncy of callluss innducced froom iimmaaturre eembrryo (%)t 值t-vallue川農(nóng)1237.67763.33321.9227*川農(nóng)1736.67762.78811.7550*川農(nóng)1835.56662.22216.9771*綿陽1138.33363.89917.3887*表示在pp0.01水水平上差差異極顯著。* meaans siggnifficaant difffer

26、rencce aat pp=0.013 討論在小麥轉(zhuǎn)基基因研究究過程中中,選擇擇不恰當(dāng)當(dāng)?shù)男←滬溒贩N作作為受體體會給小小麥品種種的改良良帶來困困難。比比如選擇擇農(nóng)藝性性狀差的的小麥作作轉(zhuǎn)基因因受體就就難以從從整體水水平上使使小麥得得到改良良。眾所所周知，小小麥品種種Bobbwhiite具具有良好好的組織織培養(yǎng)特特性，但但因其整整體農(nóng)藝藝性狀欠欠佳，通通過轉(zhuǎn)基基因的方方法并沒沒有使其其得到改改良并被被推廣應(yīng)應(yīng)用。因因此為了了盡快使使小麥轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因得得到應(yīng)用用，有必必要從大大量已審審定并推推廣的優(yōu)優(yōu)秀小麥麥品種中中篩選具具有優(yōu)良良組織培培養(yǎng)特性性的品種種作為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因受受體，而而且這項項工作應(yīng)應(yīng)當(dāng)持續(xù)

27、續(xù)開展。本實驗結(jié)果表明，供試的十三個品種（系）中，四個小麥品種具有較好的組織培養(yǎng)特性，并且川農(nóng)12、川農(nóng)17和川農(nóng)18具有高產(chǎn)、抗病、抗衰老等優(yōu)良的農(nóng)藝性狀10,11。因此這幾個小麥品種在小麥轉(zhuǎn)基因研究中具有潛在的優(yōu)勢。供試的四個品種中，綿陽11是其余三個品種的親本之一10,11，有可能川農(nóng)12、川農(nóng)17、川農(nóng)18的優(yōu)良組織培養(yǎng)特性來源于綿陽11。這幾個品種可以用來進一步研究小麥胚組織培養(yǎng)特性的遺傳規(guī)律。在本研究中中，雖然然幼胚表表現(xiàn)出了了比成熟熟胚更好好的組織織培養(yǎng)特特性，但但成熟胚胚取材方方便并且也也表現(xiàn)出出了較好好的組織織培養(yǎng)特特性。因因此，在在沒有幼幼胚的情情況下，可可以作為為替代幼幼

28、胚的外外植體。對于成熟胚的離體培養(yǎng)，本研究采用了半胚的培養(yǎng)方式，有效地克服了成熟胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接萌發(fā)的現(xiàn)象。對于這一點，可以考慮以提早收獲成熟胚的方式克服萌發(fā)現(xiàn)象，但需要進一步試驗證明其是否可行。隨后的實驗表明提早收獲的成熟胚隨著存放時間的延長，其成愈率明顯下降（數(shù)據(jù)沒顯示）。另外，以全胚的方式進行培養(yǎng)，形成的愈傷組織絕大多數(shù)再生單個植株，這樣的植株極有可能是潛伏的胚芽在細胞分裂素作用下直接長成的植株，而不是再分化植株，用這樣的愈傷組織接受轉(zhuǎn)化是不容易得到轉(zhuǎn)基因植株的。而以半胚的方式接種，胚芽容易脫分化形成愈傷組織而不是處于潛伏狀態(tài)，所以半胚愈傷組織分化多苗的機率高。本研究之所以沒有采用含

29、胚根的半胚進行培養(yǎng)，是因為胚根部分形成的愈傷組織分化率極低，結(jié)果已有報道12。 本實驗所選選用的再再生體系系和以往往報道的成功再再生體系系不同4,113-115。盡管該培養(yǎng)體體系沒有有被證明是是最好的的，但它它在很大程程度上適適應(yīng)以上上四種優(yōu)優(yōu)良的小小麥品種種，這可可以作為為其它小小麥基因因型的參參考。參考文獻：1 李李娜，焦焦湞，谷谷運紅，秦秦廣雍。小小麥組織織培養(yǎng)研研究進展展。河南南農(nóng)業(yè)科科學(xué)，220055，8：11-152 AAhlooowaaliaa BSS. PPlannt rregeenerratiion froom ccalllus cullturre oof wwheaat J

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